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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Resumen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introducción

Como parte del sistema inmune innato células asesinas naturales (NK) contribuyen a la primera línea de defensa contra las células infectadas por virus o malignamente transformadas. Un sistema de receptores inhibidores y activadores les permite distinguir entre las células sanas y transformadas sin cebado antígeno antes en contraste con las células T. Al encuentro célula diana células NK liberan el contenido de sus gránulos citotóxicos (por ejemplo, perforina, granzimas) en la sinapsis inmune para matar a su objetivo. Por otra parte, las células NK producen y secretan diferentes tipos de citoquinas (por ejemplo, gamma interferón: IFN-γ; factor de necrosis tumoral-α: TNF-α) y quimiocinas (por ejemplo, proteína inflamatoria de macrófagos-1β: MIP-1 beta) sobre la célula diana interacción o citoquina estimulación 1.

suficientes funciones de las células NK, tales como citotoxicidad, quimioquinas y la producción de citoquinas tienen un impacto importante en el destino de diversas disalivia. Los pacientes con leucemia muestran un aumento de las tasas de recaída si presentan un perfil de las células NK defectuosa al momento del diagnóstico que consiste en reducción de la producción de IFN-γ y la reducción de la expresión de la activación de los receptores de células NK 2. Una recuperación temprana del número de células NK y la función, incluyendo la producción de citocinas tras la interacción célula diana está asociada con una recaída reducida y una mejor tasa de supervivencia en pacientes que reciben un trasplante de células madre alogénicas 3. Por otra parte, al iniciar la terapia con interferón en pacientes infectados por el virus de la hepatitis C la capacidad de la desgranulación de las células NK periféricas es más fuerte en los primeros respondedores que en los no respondedores 4. El número de células NK (> 80 / l) en el día 15 después del trasplante autólogo de células madre (autoSCT) en pacientes que padecen linfoma o mieloma múltiple son predictivos de la progresión de una mejora de la supervivencia global y libre de 5. En pacientes con melanoma la expresión de la célula T immunoglobulin- y mucina-dominio-containing molécula-3 (TIM-3), una proteína inmunorreguladora en las células NK, se correlaciona con la etapa de la enfermedad y el pronóstico 6.

Los científicos han monitoreado funciones de las células NK en las últimas décadas. El análisis inicial de la citotoxicidad de las células NK contra las células tumorales sin imprimación previa se abordó usando un ensayo de liberación de 51Cr 7. Más recientemente, los científicos desarrollaron un método no radiactivo para evaluar la citotoxicidad de las células NK expandido 8. La producción de citocinas y quimiocinas se ha evaluado con frecuencia usando el ensayo de inmunoabsorción (ELISA) técnicas ligados a enzimas 9,10. Durante las últimas décadas estos métodos han sido complementados por ensayos basados ​​en citometría de flujo. El uso de inhibidores de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y la monensina) y los métodos de permeabilización de células en combinación con protocolos de tinción de superficie convencionales han permitido a los científicos estudiar de quimioquinas y la producción de citoquinas en diferentes linfático específicosubconjuntos ocyte (por ejemplo, T, B o células NK) 11. Por otra parte, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se han desarrollado para monitorizar T y NK citotoxicidad de las células. En 2004 Alter et al. Describe la expresión en la superficie de la proteína asociada a lisosoma CD107a (Lamp1) en las células NK en encuentro célula diana como un marcador para la desgranulación de gránulos citotóxicos 12. Dado que una amplia gama de diferentes fluorocromos y citómetros de flujo de múltiples canales están disponibles en nuestros días, se ha hecho posible para monitorear simultáneamente diversas funciones de las células NK (citotoxicidad, producción de citoquinas y quimioquinas) en diferentes subconjuntos de células NK. Esto es especialmente importante en situaciones donde el tamaño de la muestra es limitado, por ejemplo, en las biopsias o muestras de sangre de pacientes que sufren de leucopenia.

Para probar las funciones globales de células NK, los ensayos basados ​​en citometría de flujo diferente se pueden combinar de manera eficiente. Theorell et al. Las células NK estimuladas de headonantes lthy con la línea de células tumorales K562 y analizada la producción desgranulación de las células, y la señal de quimiocina de dentro a fuera NK a través de citometría de flujo 13. Recientemente subgrupos de células NK, fenotipos y funciones en pacientes con tumor durante autoSCT se analizaron mediante citometría de flujo ensayos basados. Se demostró que las células NK fueron capaces de degranulación y producir citocinas / quimiocinas sobre el reconocimiento de células tumorales en puntos de tiempo muy tempranos después de autoSCT 11.

Aquí se describe un protocolo para evaluar las funciones de células NK tras la interacción con las células tumorales, incluyendo la capacidad de la desgranulación, quimioquinas y la producción de citoquinas utilizando un flujo ensayo basado en citometría-que hace que sea posible controlar las funciones de las células NK en diferentes subconjuntos de forma simultánea.

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del comité de ética local de la Universidad de Frankfurt.

1. El cultivo de células K562

  1. Células de cultivo K562 en medios R10 (RPMI 1640 con medio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de suero de ternera fetal) a una densidad de 0,5-1 x 10 6 células por ml en un matraz de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2.
  2. Las células K562 cosecha de las 24 horas antes del inicio de un nuevo experimento.
    1. Retirar el matraz de cultivo celular que contiene las células K562 de la incubadora. Vuelva a suspender las células K562 dentro de los medios de cultivo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
    2. Transferir el medio de cultivo que contiene las células K562 en un tubo de 15 o 50 ml y sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de medio R10 y mezclar bien.
    3. Transferencia de 20 l de la solución de células en un pocillo de una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de azul de tripano ymezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipeta de 10 l de la solución en una cámara de recuento celular y el recuento de las células.
    4. Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Vuelva a suspender las células en medios R10 y ajustar la concentración celular K562 de 0,5-1 x 10 6 células por ml.
    5. Se incuban las células K562 en un matraz de cultivo celular a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta su uso.

2. Aislamiento de células NK

  1. De acuerdo con la aprobación y directrices del comité de ética local, obtener el consentimiento informado por escrito del paciente o donante sano antes de la colección de 6-10 ml de EDTA o sangre periférica heparinizada.
  2. Almacenar los reactivos para el aislamiento de células NK a 4 ° C hasta el momento del inicio del experimento y luego usarlos a temperatura ambiente (TA) en condiciones estériles. Aislar las células NK de sangre periférica usando microperlas magnéticas y un imán específico para el aislamiento de células de acuerdo con tél instrucciones del fabricante.
    1. Reconstituir un vial del cóctel de anticuerpos aislamiento negativo liofilizado de células NK pipeteando 7,5 ml del tampón A proporcionado (incluidos en el kit de aislamiento de células NK) en el vial. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo 3-4 veces.
      Nota: Asegúrese de que la suspensión es homogénea antes de cada uso.
    2. Preparar la solución final cóctel mezclando volúmenes apropiados de la pastilla reconstituido desde el paso 2.2.1 y tampón B (incluidos en el kit de aislamiento de células NK). Para determinar estos volúmenes, definir el volumen de la muestra de sangre en ml como volumen = 1,0. Utilice 0,25 volúmenes de la pastilla reconstituida (de la etapa 2.2.1) y 0,25 volúmenes de tampón B para procesar 1 volumen de sangre entera.
    3. Transferir la mezcla en un tubo adecuado que contiene la muestra de sangre. No pipetear arriba y hacia abajo para evitar la pérdida de sangre dentro de la pipeta. En su lugar, cerrar el tubo y mover con cuidado hacia arriba y abajo hasta que la suspensión es homogénea. No hacer vórtice.
    4. homogeneizar aún más la muestra usando un rotador tubo durante 5 min a RT.
    5. En condiciones estériles, retire la tapa y colocar el tubo en el separador magnético durante 15 minutos según lo recomendado por el fabricante. Asegúrese de que las etiquetas de las mangueras apunten hacia la parte trasera del imán para permitir la visibilidad sin perturbaciones de la línea de separación. No mueva el imán durante la separación, como se vería perturbado este procedimiento.
    6. transferir cuidadosamente el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml y se llenan con completa los medios de comunicación (CM; medios de células hematopoyéticas, 1% de penicilina / estreptomicina, 5% de suero humano). Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min.
      1. Opcional: Si el sedimento es rojo, volver a suspender las células en 1 ml de tampón de lisis de eritrocitos (por ejemplo, 1 ml de amonio-cloruro de potasio (ACK) lisar tampón: 155 mM NH 4 Cl; EDTA 0,1 mM; 10 mM KHCO3 en 1 L de agua destilada (DW)) y se incuba durante 8 minutos a TA. Como alternativa, utilizar un amplikit de agotamiento ythrocyte.
        NOTA: Tenga en cuenta, que el uso de tampón ACK podría impactar negativamente en las funciones celulares NK 14.
      2. Rápidamente diluir el tampón ACK mediante la adición de al menos 1 ml de CM para detener la lisis y se centrifuga a 400 xg durante 8 minutos para sedimentar las células.
    7. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de CM y proceder con el conteo. Transferencia de 20 l de la solución de células NK en una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de azul de metileno a cada pocillo y mezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipetear 10 l de la solución en una cámara de recuento de células y células de contar. Alternativamente, utilizar 30 l de suspensión de células sin diluir para contar con un contador de células disponible en el mercado.
    8. Ajustar las células a una concentración de al menos 2 x 10 4 células NK por 100 CM l.
    9. Realizar una tinción de anticuerpos superficie de la población de células NK aisladas para comprobar la pureza usando un citómetro de flujo.
      1. Prepare una solución mezcla maestra mediante mezcla de los volúmenes de los anticuerpos indicados según la Tabla 1.
      2. Vuelva a suspender las células en tampón de lavado 88,5 l (WB; 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% NaN 3 en PBS) y añadir 11,5 l de la solución de mezcla maestra. Se incuban las células durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
        Precaución: NaN 3 es tóxico y mutágeno. Manejarlo de acuerdo a la correspondiente hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
      3. Añadir 1 ml de WB y sedimentar las células a 400 xg durante 4 minutos.
      4. Vuelva a suspender las células en tampón de tinción de 300 l, más DAPI. Adquirir las células utilizando un citómetro de flujo.
        NOTA: seguir adelante con el experimento sólo si la pureza de las células NK es de al menos 80% de todos los linfocitos vivos.

3. La recolección de las células K562 para la estimulación de células NK

  1. Retirar el matraz de cultivo celular que contiene las células K562 (de la etapa 1.2) de TH e incubadora. Vuelva a suspender las células K562 dentro de los medios de cultivo pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  2. Transferir todo el medio de cultivo en un tubo de 15 o 50 ml y sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 5 solución salina tamponada con fosfato ml (PBS) y mezclar bien.
  3. Transferencia de 20 l de la solución de células en un pocillo de una placa de 96-U-bien. Añadir 20 l de tripano azul y mezclar bien pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Pipeta de 10 l de la solución en una cámara de recuento celular y el recuento de las células. Alternativamente utilizar 30 l de suspensión celular sin diluir para contar con un contador de células disponibles comercialmente.
  4. Sedimentar las células a 400 xg durante 8 min. Células en CM Vuelva a suspender a una concentración de al menos 2 x 10 4 K562 células por 100 l de medios.
    NOTA: Utilice el mismo K562 y las concentraciones de células NK con el fin de incubar tanto a una relación de efector:: (TE) de 1: 1 de destino más adelante.
"> 4. La estimulación de las células NK con el tumor Línea Celular K562 y citoquinas

  1. Mezclar suavemente las células pipeteando arriba y abajo durante al menos 5 veces. Distribuir 100 l / pocillo de la solución de células NK en los pocillos requeridos de una placa de 96-V pocillos.
    1. Use al menos dos pocillos para cada donante, una con y otra sin un estímulo (por ejemplo, células tumorales K562 y citoquinas). Siempre que sea posible, realizar el experimento, al menos por duplicado y añadir un control positivo (por ejemplo, miristato de forbol 12-13-acetato (PMA) y ionomicina; concentración final: 50 nM de PMA, 1 M de ionomicina por pocillo). Preparar el flujo actualizado citometría de compensaciones para la fecha del experimento.
      NOTA: Valorar los anticuerpos uso anterior (véase el debate).
  2. Apagar la luz y añadir el anticuerpo anti-CD107a (2 l, concentración final: 1: 100) a cada pocillo con células NK en la placa 96-V-así.
  3. Mezclar suavemente las células K562 con la pipeta hacia arriba y abajo por loPor lo menos 5 veces.
    1. A partir de los pocillos que contienen la solución de anticuerpos de las células NK / anti-CD107a, identificar a los previstos para la estimulación con células K562. Añadir 100 l / pocillo de la solución de células K562 en estos pozos. Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces.
    2. Añadir la interleucina-2 (IL-2; concentración final 100 U / ml) y la interleucina-15 (IL-15; concentración final de 10 ng / ml) a los pocillos que contienen células K562 y la solución de anticuerpo de células NK / anti-CD107a.
      1. Opcional: probar el impacto de cualquiera de las células K562 o citocinas solo en las células NK distribuidos de descifrar comparadas con las funciones de las células NK inducida por citoquinas inducida por el tumor.
    3. Identificar los pozos de la placa de 96 V-bien planificada como controles negativos sin estímulo. Añadir 100 l / pocillo CM a estos pozos que contienen sólo la solución de anticuerpos de las células NK / anti-CD107a. Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces.
      1. Opcional: Para un control positivo, añadir 100 μ; L CM que contiene PMA y ionomicina (concentración final: 50 nM PMA, 1 mM ionomicina por pocillo) a un pozo con la solución de anticuerpos de células NK / anti-CD107a.
  4. Se incuban las células durante 3 horas en la oscuridad a 37 ° C y 5% de CO2.
  5. Preparar una solución de inhibidor de la proteína de transporte (por ejemplo, brefeldina A y / o monensina) en CM. Después de 1 h de incubación, añadir la solución a cada pocillo de la placa de 96-V-bien con la luz apagada (concentración final: 0.5-1μM brefeldin A y 2-3 monensina M). Mezclar con cuidado la pipeta hacia arriba y hacia abajo durante al menos 5 veces. Continuar la incubación durante 2 horas el restante.

5. La superficie e intracelulares tinción

  1. Después de que el período de incubación de 3 h, la mezcla de las células dentro de los pocillos de la placa de 96-V-así cuidadosamente pipeteando arriba y abajo por al menos 5 veces y transferirlos a citometría de flujo tubos. Añadir 1 ml / tubo de WB. Precipitar las células a 400 xg durante 4 minutos.
    1. Opcional: antes de la centrifugación Lavar los pocillos con 100 l / pocillo de PBS, con el fin de optimizar la recuperación de células, pipeteando arriba y abajo por al menos 5 veces antes de la transferencia de las células en el respectivo tubo de FACS.
  2. Descartar el sobrenadante y continuar con la tinción de la superficie.
  3. Incluir un colorante fluorescente reactivo con amina que no es permeable a las células vivas con un máximo de emisión de 423 nm como un marcador de células muertas puede arreglar (DCM). Realizar la tinción antes (ver a continuación) o en paralelo con la tinción de la superficie de anticuerpos en función del tipo de la DCM utiliza.
    1. Vuelva a suspender las células en 99 l / tubo de PBS y añadir 1 l / tubo del DCM corregible (concentración final: 1: 100). Mezclar bien las células utilizando un vórtice y se incuba durante 15 min a TA en la oscuridad.
    2. Preparar una solución de mezcla maestra mediante la mezcla de los anticuerpos "superficie" que se enumeran en la Tabla 2 (ver columna etapa de tinción resaltado en azul). En utilizar eldicated volúmenes / tubo y se multiplica con el número de tubos de citometría de flujo para ser teñidos.
    3. Después de la incubación tomar la citometría de flujo tubos con las células y añadir 1 ml / tubo de WB. Sedimentar las células a 400 xg durante 4 min.
    4. Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 84 l / tubo de WB y añadir 16 l / tubo de la solución de mezcla maestra. Mezclar bien usando células de un vórtice. Se incuban las células durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
    5. Después de 20 minutos añadir 1 ml / tubo de WB y células de pellets a 400 xg durante 4 minutos.
  4. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l / tubo de una solución de fijación fría (por ejemplo, 2% () de paraformaldehído al final o formaldehído). Mezclar bien usando células de un vórtice. Se incuban las células durante 10 min a 4 ° C en la oscuridad.
    1. Teñir las células de citoquinas intracelulares / quimiocinas después de este paso o almacenarlos durante la noche a 4 ° C en WB.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, se puede producir una recuperación celda inferior.
      Precaución: El paraformaldehído y formaldehído son posibles carcinógenos. Manejarlos de acuerdo a la respectiva hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
  5. Lavar las células en 1 ml de WB / tubo a 400 xg durante 4 minutos y proceder con el paso de permeabilización.
  6. Preparar un tampón de permeabilización (PB) (por ejemplo, 0,2% de saponina, 1% de solución de BSA en PBS).
  7. Lavar las células dos veces en 1 ml / tubo de PB a 400 xg durante 4 min. Continuar con la tinción intracelular.
    Precaución: La saponina es potencialmente irritantes. Manejarlo de acuerdo a la correspondiente hoja de datos de seguridad del material (MSDS).
  8. Preparar una solución de mezcla maestra utilizando los volúmenes indicados "intracelulares" de anticuerpos en la Tabla 2 (resaltados en verde). Multiplicar estos volúmenes con el número de tubos que se tiñe.
    1. Vuelva a suspender las células en 90 l de PB / tubo y aplicar 10 l / tubo de la solución de anticuerpos mezcla maestra. Mezclar bien usando un vórtice y se incuban las células durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
  9. Lavar las células dos veces en 1 ml / tubo de PB a 400 xg durante 4 minutos.
  10. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 400 PB l / tubo. Mezclar bien usando células de un vórtice. Coloque células en hielo en la oscuridad hasta la medición.

6. Citometría de Flujo de Compensación y Adquisición

  1. Seleccione los canales para los diferentes fluorocromos (ver Tabla 2) dentro de la citometría de flujo software de adquisición en la carpeta de configuración de parámetros. Además, elegir los canales para FSC-A y -H, así como para SSC-A y -H.
  2. Cargar una matriz de compensación creada para los parámetros elegidos en el archivo de adquisición.
    1. Crear una matriz de compensación utilizando células NK aisladas de la etapa 2.2.8 mediante la realización de una sola mancha de color para cada fluorocromo utilizado (véase la Tabla 2). Utilizar el protocolo de tinción de la superficie descrita en los pasos 5.1-5.4. Incluir un control sin teñir (sin ningún tipo de anticuerpos), así como controles de isotipo y / o fluorescencia menos uno controles (FMO).
      NOTA: Como alternativa a la compensación basada en células, usar perlas como controles de compensación de unión a IgG.
    2. Colocar cada tubo para muestras de manchas individuales y la muestra sin anticuerpos en el puerto de inyección de muestra (SIP). Haga clic en el botón "Grabar" en el software de adquisición de citometría de flujo y adquirir un número de células de al menos 5 x 10 3 células NK por muestra.
    3. Utilice la aplicación de cálculo de la compensación del software de adquisición de citometría de crear una matriz de compensación.
  3. Crear gráficas de puntos para la identificación de la población de células NK.
    1. Identificar las células individuales utilizando FSC-A / FSC-H y / SSC-H gráficos de puntos de SSC-A. Haga clic en el botón "puerta polígono". Dibuje una puerta alrededor de las células, que tienen un patrón de distribución lineal en ambos gráficos de puntos. Haga doble clic en las puertas para abrir un nuevo gráfico de puntos.
    2. Elija una parcela FSC-A / SSC-Un punto para identificar el linfocito/ Población de células NK (ver Figura 1). Dibuje una puerta polígono alrededor de ella y haga doble clic en la puerta.
  4. Colocar cada tubo de muestra del ensayo de estimulación de células NK en el SIP. Haga clic en el botón "Grabar" y adquirir un número de células de al menos 5 x 10 3 células NK por muestra.

7. Análisis y Estadísticas

  1. Abrir el flujo del programa software de análisis de citometría. Haga clic en el botón de carga de muestra para abrir la muestra de control no estimulado.
  2. Crear un sistema de llenado de las diferentes subpoblaciones de células NK (ver Figura 1).
    1. Haga clic en el botón gráfico de puntos para crear una EVE-A / SSC-Una trama. Haga clic en el botón de la puerta rectángulo y dibujar un rectángulo sobre la puerta todos los eventos con un FSC-Un valor> 5 x 10 4 para excluir los desechos. Abra la puerta, haciendo doble clic en la puerta.
    2. Elegir de nuevo los parámetros FSC-A / SSC-A dentro del nuevo gráfico de puntos y hacer clic en el botón de la puerta polígono. reen bruto de una puerta polígono alrededor de la población de linfocitos (véase la Figura 1). Abre la puerta.
    3. Seleccionar el parámetro / SSC-H SSC-A para el nuevo diagrama de puntos y dibujar una puerta polígono alrededor de todas las células individuales. Las células individuales muestran una distribución lineal a través de los parámetros de FSC-A / FSC-H y SSC-A / SSC-H (véase la Figura 1). Abra la puerta, haciendo doble clic sobre él.
    4. Repita el paso 7.2.3 con los parámetros de FSC-A / FSC-H en esta ocasión.
    5. Utilizar el parámetro de CD45 y volcado canal (CD3, CD14, CD19; DCM) para excluir las células muertas. Dibuje un rectángulo alrededor de la puerta todo CD45 positivas y negativas de vaciado células del canal. Abra la puerta, haciendo doble clic en la puerta.
    6. Identificar toda la población de células NK mediante el CD56 y volcado parámetros de canal. Crear una puerta rectángulo alrededor del CD56 positivo y volcado canalizar las células negativas. Abra la puerta, haciendo doble clic sobre él.
    7. Dibuje una puerta rectángulo alrededor de los tres subgrupos de células NK en un CD56 / CD16 gráfico de puntos. Identify los diferentes subconjuntos como CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + y subconjuntos de células CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analizar funciones de las células NK para cada subconjunto de células NK individual.
    1. Haga clic en una de las tres puertas de subconjuntos de células NK para abrirlo. Crear tres gráficos de puntos diferentes para CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ y CD56 / MIP-1β.
    2. Dibujar una puerta rectángulo de células positivas CD56, que son positivas también para CD107a, IFN-γ o MIP-1β, respectivamente (véase la Figura 1).
    3. Repita el paso 7.3.1-7.3.2 para cada subconjunto de células NK restante.
  4. Repita el paso 7.2 y 7.3 para todas las muestras estimuladas. Guardar todos los valores estadísticos de cada muestra individual haciendo clic en el botón de Estadística-exportación en el software de análisis.
  5. Abrir los archivos que contienen los valores estadísticos de las muestras individuales para analizar funciones de las células NK. Seleccionar los valores de las células NK individuosubconjuntos (por ejemplo, CD56 ++ CD16 - células NK) copiándolos en otro archivo.
    1. Restar el porcentaje de células NK positivo CD107a, que no han sido tratados con un estímulo, a partir del porcentaje de células positivas CD107a NK, que han sido tratados con un estímulo.
      NOTA: Utilice el resultado para demostrar la capacidad de la desgranulación de este subconjunto particular de células NK en respuesta al estímulo.
    2. Repita el paso 7.5.1 para IFN-γ y células NK MIP-1ß-positivos para demostrar la producción de citoquinas y quimioquinas en respuesta al estímulo.
    3. Repita el paso 7.5.1-7.5.2 para cada subconjunto de células NK restante para evaluar su capacidad desgranulación y la producción de citoquinas / quimioquinas tras la estimulación.

Resultados

La estrategia gating para analizar la desgranulación, citoquinas y quimioquinas producción de toda la población de células NK y tres subconjuntos de células NK diferentes se ilustran en la Figura 1.

Los resultados representativos de un donante sano se ilustran en la Figura 2. Las células NK sin ningún estímulo ni producen IFN-γ ni MIP-1β y no expresaron CD107a en su superficie ...

Discusión

El método descrito es un método fácil, rápido y fiable para estudiar las funciones de las células NK a partir de muestras de sangre entera de donantes sanos o pacientes. Este método ofrece la gran ventaja de purificar directamente a las células NK de la sangre entera, evitando el tiempo de centrifugación en gradiente de densidad, que es obligatorio para muchos otros métodos de purificación 15. Por otra parte, se requiere un tamaño de muestra más pequeño en comparación con métodos de enriquecimi...

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Agradecimientos

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

Referencias

  1. Watzl, C. How to trigger a killer: modulation of natural killer cell reactivity on many levels. Adv Immunol. 124, 137-170 (2014).
  2. Khaznadar, Z., et al. Defective NK Cells in Acute Myeloid Leukemia Patients at Diagnosis Are Associated with Blast Transcriptional Signatures of Immune Evasion. J Immunol. 195 (6), 2580-2590 (2015).
  3. Pical-Izard, C., et al. Reconstitution of natural killer cells in HLA-matched HSCT after reduced-intensity conditioning: impact on clinical outcome. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (3), 429-439 (2015).
  4. Ahlenstiel, G., et al. Early changes in natural killer cell function indicate virologic response to interferon therapy for hepatitis C. Gastroenterology. 141 (4), 1231-1239 (2011).
  5. Porrata, L. F., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study. Biol Blood Marrow Transplant. 14 (7), 807-816 (2008).
  6. Silva, I. P., et al. Reversal of NK-cell exhaustion in advanced melanoma by Tim-3 blockade. Cancer Immunol Res. 2 (5), 410-422 (2014).
  7. Kiessling, R., Klein, E., Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol. 5 (2), 112-117 (1975).
  8. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp. (48), (2011).
  9. Mariani, E., et al. Chemokine production by natural killer cells from nonagenarians. Eur J Immunol. 32 (6), 1524-1529 (2002).
  10. Reefman, E., et al. Cytokine secretion is distinct from secretion of cytotoxic granules in NK cells. J Immunol. 184 (9), 4852-4862 (2010).
  11. Jacobs, B., et al. NK Cell Subgroups, Phenotype, and Functions After Autologous Stem Cell Transplantation. Front. Immunol. 6, 583 (2015).
  12. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  13. Theorell, J., et al. Sensitive and viable quantification of inside-out signals for LFA-1 activation in human cytotoxic lymphocytes by flow cytometry. J Immunol Methods. 366 (1-2), 106-118 (2011).
  14. Brander, C., et al. Inhibition of human NK cell-mediated cytotoxicity by exposure to ammonium chloride. J Immunol Methods. 252 (1-2), 1-14 (2001).
  15. Beeton, C., Chandy, K. G. Enrichment of NK cells from human blood with the RosetteSep kit from StemCell technologies. J Vis Exp. (8), e326 (2007).
  16. Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1 (3), 1507-1516 (2006).
  17. Baginska, J., et al. Granzyme B degradation by autophagy decreases tumor cell susceptibility to natural killer-mediated lysis under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17450-17455 (2013).
  18. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  19. Sutton, V. R., et al. Serglycin determines secretory granule repertoire and regulates NK cell and CTL cytotoxicity. FEBS J. 283 (5), 947-961 (2016).
  20. Schönberg, K., Hejazi, M., Uhrberg, M. Protocol for the clonal analysis of NK cell effector functions by multi-parameter flow cytometry. Methods Mol Biol. 903, 381-392 (2012).
  21. Björkström, N. K., et al. Expression patterns of NKG2A, KIR, and CD57 define a process of CD56dim NK-cell differentiation uncoupled from NK-cell education. Blood. 116 (19), 3853-3864 (2010).
  22. Bryceson, Y. T., Ljunggren, H. G., Long, E. O. Minimal requirement for induction of natural cytotoxicity and intersection of activation signals by inhibitory receptors. Blood. 114 (13), 2657-2666 (2009).
  23. Cooper, M. A., et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 97 (10), 3146-3151 (2001).
  24. Fauriat, C., Long, E. O., Ljunggren, H. G., Bryceson, Y. T. Regulation of human NK-cell cytokine and chemokine production by target cell recognition. Blood. 115 (11), 2167-2176 (2010).
  25. Postow, M. A., Callahan, M. K., Wolchok, J. D. Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol. 33 (17), 1974-1982 (2015).
  26. Glienke, W., et al. Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells. Front Pharmacol. 6, 21 (2015).
  27. Curran, K. J., Brentjens, R. J. Chimeric antigen receptor T cells for cancer immunotherapy. J Clin Oncol. 33 (15), 1703-1706 (2015).
  28. Zappasodi, R., de Braud, F., Di Nicola, M. Lymphoma Immunotherapy: Current Status. Front. Immunol. 6, 448 (2015).
  29. Laprevotte, E., et al. Endogenous IL-8 acts as a CD16 co-activator for natural killer-mediated anti-CD20 B cell depletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 37 (4), 440-446 (2013).
  30. Maloney, D. G., et al. IDEC-C2B8 (Rituximab) anti-CD20 monoclonal antibody therapy in patients with relapsed low-grade non-Hodgkin's lymphoma. Blood. 90 (6), 2188-2195 (1997).
  31. Salles, G., et al. Phase 1 study results of the type II glycoengineered humanized anti-CD20 monoclonal antibody obinutuzumab (GA101) in B-cell lymphoma patients. Blood. 119 (22), 5126-5132 (2012).
  32. Terszowski, G., Klein, C., Stern, M. KIR/HLA interactions negatively affect rituximab- but not GA101 (obinutuzumab)-induced antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Immunol. 192 (12), 5618-5624 (2014).
  33. Hsu, A. K., et al. The immunostimulatory effect of lenalidomide on NK-cell function is profoundly inhibited by concurrent dexamethasone therapy. Blood. 117 (5), 1605-1613 (2011).
  34. Salih, J., et al. The BCR/ABL-inhibitors imatinib, nilotinib and dasatinib differentially affect NK cell reactivity. Int J Cancer. 127 (9), 2119-2128 (2010).
  35. Benson, D. M., et al. A phase 1 trial of the anti-KIR antibody IPH2101 in patients with relapsed/refractory multiple myeloma. Blood. 120 (22), 4324-4333 (2012).
  36. Vey, N., et al. A phase 1 trial of the anti-inhibitory KIR mAb IPH2101 for AML in complete remission. Blood. 120 (22), 4317-4323 (2012).
  37. Terme, M., Ullrich, E., Delahaye, N. F., Chaput, N., Zitvogel, L. Natural killer cell-directed therapies: moving from unexpected results to successful strategies. Nat Immunol. 9 (5), 486-494 (2008).

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