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Resumo

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Resumo

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introdução

Como parte do sistema natural killer imune inata (NK) contribuir para a primeira linha de defesa contra as células infectadas com vírus ou transformadas de forma maligna. Um sistema de receptores inibidores e activadores lhes permite distinguir entre células transformadas e saudáveis ​​sem escorva antigénio antes em contraste com as células T. No momento do encontro célula alvo células NK liberar o conteúdo de seus grânulos citotóxicos (por exemplo, perforina, Granzimas) na sinapse imunológico para matar seu alvo. Além disso, as células NK produzem e segregam diferentes tipos de citocinas (por exemplo, interferão-y: IFN-γ; Factor de Necrose Tumoral-α: TNF-α) e quimiocinas (por exemplo, proteína inflamatória de macrófagos-1β: MIP-1b) sobre células alvo interacção citocina ou uma estimulação.

Suficientes funções das células NK, tais como citotoxicidade, quimiocinas e produção de citocinas têm um impacto importante sobre o destino de diversas disfacilita. Pacientes com leucemia mostram taxas de recaída aumenta se eles apresentam um perfil de célula NK com defeito no momento do diagnóstico consiste em produção de IFN-γ reduzida e redução da expressão de ativação de receptores 2 células NK. Uma recuperação rápida do número de células NK e do funcionamento, incluindo a produção de citoquinas após interacção célula alvo está associada com uma recaída reduzida e uma melhor taxa de sobrevivência em doentes que receberam transplante de células estaminais alogénicas 3. Além disso, no início da terapêutica interferon em pacientes infectados pelo vírus da hepatite C a capacidade desgranulação das células NK periféricas é mais forte nos primeiros respondedores do que em não-respondedores 4. O número de células NK (> 80 / l) no dia 15 após o transplante de células-tronco autólogas (autoSCT) em pacientes que sofrem de linfoma ou mieloma múltiplo são preditivos de uma melhor progressão livre e de sobrevida global 5. Em pacientes com melanoma, a expressão de a-célula T immunoglobulin- e mucina-domínio-contendg molécula-3 (TIM-3), uma proteína imuno-reguladora das células NK, correlaciona-se com a fase da doença e o prognóstico 6.

Os cientistas têm monitorado as funções das células NK ao longo das últimas décadas. A análise inicial da citotoxicidade das células NK contra células tumorais sem escorva antes foi abordada utilizando um ensaio de libertação de 51Cr-7. Mais recentemente, os cientistas desenvolveram um método não-radioactivos para avaliar a citotoxicidade das células NK expandidos 8. Citocina e quimiocina produção tem sido frequentemente avaliado utilizando um ensaio de imunossorvente ligado técnicas a enzima (ELISA) 9,10. Durante as últimas décadas, estes métodos têm sido completada pelo fluxo de ensaios baseados em citometria. A utilização de inibidores de proteína de transporte (por exemplo, brefeldina A e monensina) e métodos de permeabilização celular em combinação com protocolos de coloração de superfície convencionais, permitiram aos cientistas estudar quimiocina e a produção de citocinas em diferentes linfa específicasubconjuntos ocyte (por exemplo, T, B ou células NK) 11. Além disso, ensaios baseados em citometria de fluxo diferentes têm sido desenvolvidos para monitorizar a citotoxicidade das células T e NK. Em 2004 Alter et ai. Descreveu a expressão de superfície da proteína associada ao lisossoma CD107a (LAMP1) em células NK mediante encontro de células alvo como um marcador para a desgranulação dos grânulos citotóxicos 12. Uma vez que uma ampla gama de diferentes fluorocromos e citómetros de fluxo multi-canal estão disponíveis nos nossos dias, tornou-se possível monitorizar simultaneamente diversas funções das células NK (citotoxicidade, produção de citoquinas e de quimioquinas) em diferentes subpopulações de células NK. Isto torna-se especialmente importante em situações em que o tamanho da amostra é limitado, por exemplo, em biopsias ou amostras de sangue de pacientes que sofrem de leucopenia.

Para testar as funções das células NK globais, os ensaios baseados em citometria de fluxo diferente pode ser eficientemente combinada. Theorell et al. Células NK estimuladas de headoadores imunda com a linha de células tumorais K562 e analisados a desgranulação das células, o sinal de dentro para fora e de quimiocina produção NK através de citometria de fluxo 13. Recentemente subgrupos de células NK, fenótipos e funções em pacientes com tumor durante autoSCT foram analisados ​​por meio de fluxo ensaios baseados em citometria. Demonstrou-se que as células NK foram capazes de produzir desgranulam e citocinas / quimiocinas sobre o reconhecimento de células de tumor em tempos precoces depois autoSCT 11.

Aqui é descrito um protocolo para avaliar as funções das células NK após interacção com células tumorais, incluindo a capacidade de desgranulação, produção de quimioquina e citoquina utilizando um fluxo de ensaio à base de citometria que faz com que seja possível controlar as funções das células NK em subconjuntos diferentes simultaneamente.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do comitê de ética local da Universidade de Frankfurt.

1. Cultura de células K562

  1. Cultura de células K562 em meios R10 (RPMI 1640 com meio de glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, 10% de soro fetal de vitela) a uma densidade de 0,5-1 x 10 6 culas por ml num balão de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2.
  2. Células colheita K562 24 h antes do início de uma nova experiência.
    1. Retirar o frasco de cultura de células contendo as células K562 da incubadora. Re-suspender as células K562 dentro do meio de cultura cuidado pipetando para cima e para baixo.
    2. Transferir a meios de cultura contendo as células K562 para um tubo de 15 ou 50 ml e sedimentar as células a 400 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de meio R10 e misturar bem.
    3. Transferir 20 uL da solução de células em um poço de uma placa de 96-L-poço. Adicionar 20 l de azul de tripano emisture bem por pipetagem cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e contagem das células.
    4. Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos. Re-suspender as células em meio R10 e ajustar a concentração de células K562 de 0,5-1 x 10 6 culas por ml.
    5. Incubar as células K562 em um frasco de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2 até à sua utilização.

2. Isolamento de células NK

  1. De acordo com a aprovação e diretrizes do comitê de ética local, obter o consentimento informado por escrito do doador saudável ou doente, antes da recolha de 6-10 ml de EDTA ou sangue periférico heparinizado.
  2. Conservar os reagentes para o isolamento de células NK, a 4 ° C, até o início da experiência e depois usá-los à temperatura ambiente (RT), em condições estéreis. Isolar células NK de sangue periférico usando microesferas magnéticas e um íman específico para o isolamento de células T de acordo com aele as instruções do fabricante.
    1. Reconstituir um frasco da célula NK liofilizado cocktail de anticorpos de isolamento negativo pipetando 7,5 ml do tampão A, desde que (incluído no estojo de isolamento de células NK) para dentro do frasco. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 3-4 vezes.
      NOTA: Certifique-se, que a suspensão é homogênea antes de cada utilização.
    2. Preparar a solução final cocktail por mistura de volumes apropriados da pelete reconstituída a partir do passo 2.2.1 e tampão B (incluído no estojo de isolamento de células NK). Para determinar esses volumes, definir o volume de toda a amostra de sangue em ml de volume = 1,0. Use 0,25 volumes do sedimento reconstituído (a partir do passo 2.2.1) e 0,25 volumes de tampão B para processar um volume de sangue total.
    3. Transferir a mistura para um tubo adequado contendo a amostra de sangue. Não pipeta cima e para baixo para evitar a perda de sangue dentro da pipeta. Em vez disso, fechar o tubo e movê-lo com cuidado para cima e para baixo até que a suspenSion é homogênea. não vortex.
    4. Além disso homogeneizar a amostra, utilizando um rotor tubo durante 5 min à TA.
    5. Sob condições estéreis, remover a tampa e colocar o tubo para dentro do separador magnético durante 15 min, tal como recomendado pelo fabricante. Certifique-se de que os rótulos dos tubos viradas para a parte traseira do ímã para permitir a visibilidade sem perturbações da linha de separação. Não mova o íman durante a separação, já que este procedimento seria perturbado.
    6. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e preencher-se com meio completo (CM; meios de comunicação celular hematopoiética, 1% de penicilina / estreptomicina, 5% de soro humano). Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos.
      1. Opcional: Se o sedimento é vermelho, re-suspender as células em 1 ml de tampão de lise de eritrócitos (por exemplo, 1 ml de amónio-cloreto e potássio (ACK) tampão de lise: 155 mM de NH 4 Cl, 0,1 mM de EDTA; 10 KHCO 3 mM em 1 L de água destilada (DW)) e incuba-se durante 8 minutos à temperatura ambiente. Como alternativa, use um erkit de depleção ythrocyte.
        NOTA: Tenha em mente, que o uso de tampão ACK pode impactar negativamente as funções das células NK 14.
      2. Rapidamente diluir o tampão ACK através da adição de pelo menos 1 ml de CM para parar a lise e centrifugar a 400 xg durante 8 minutos para sedimentar as células.
    7. Re-suspender o pellet celular em 1 ml de CM e prosseguir com a contagem. Transferir 20 uL da solução das células NK numa placa de 96-L-poço. Adicionar 20 ul de azul de metileno a cada poço e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e as células contam. Em alternativa, usar 30 ul de suspensão de células não diluído para a contagem com um contador de células comercialmente disponível.
    8. Ajustar as células a uma concentração de pelo menos 2 x 10 4 células NK por 100 ul de CM.
    9. Executar uma coloração de anticorpos de superfície da população de célula NK isolados a verificar a pureza utilizando um citómetro de fluxo.
      1. Prepare uma solução mestre mistura por mistura dos volumes dos anticorpos indicados como na Tabela 1.
      2. Re-suspender as células em tampão de lavagem de 88,5 ul (WB; 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% NaN3 em PBS) e adicionar 11,5 mL da solução de mistura mestre. Incubam-se as células durante 20 min a 4 ° C no escuro.
        Cuidado: NaN 3 é tóxico e mutagênico. Segurá-lo em conformidade com a correspondente Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS).
      3. Adicionar 1 ml de WB e sedimentar as células a 400 xg durante 4 min.
      4. Re-suspender as células em tampão de coloração de 300 ul além DAPI. Adquirir as células utilizando um citómetro de fluxo.
        NOTA: prosseguir a experiência só se a pureza das células NK é pelo menos 80% de todos os linfócitos vivos.

3. A colheita das células K562 para a estimulação das células NK

  1. Retirar o frasco de cultura de células contendo as células K562 (a partir do passo 1.2) a partir th e incubadora. Re-suspender as células K562 dentro do meio de cultura cuidado pipetando para cima e para baixo.
  2. Transferir todo o meio de cultura para um tubo de 15 ou 50 ml e sedimentar as células a 400 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misture bem.
  3. Transferir 20 uL da solução de células em um poço de uma placa de 96-L-poço. Adicionar 20 l de azul de tripano e misture bem por pipetagem cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Pipetar 10 ml da solução numa câmara de contagem de células e contagem das células. Como alternativa, use 30 ul de suspensão de células não diluído para contar com um contador de células disponíveis comercialmente.
  4. Agregar as células a 400 xg durante 8 minutos. Células em CM Re-suspender a uma concentração de pelo menos 2 x 10 4 K562 células por 100 ul de meios de comunicação.
    NOTA: É o mesmo K562 e as concentrações de células NK, a fim de, tanto a incubar um efector: alvo (E: T) proporção de 1: 1, mais tarde.
"> 4. Estimulação das células NK com o tumor celular Linha K562 e citocinas

  1. Misturar suavemente as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes. Distribuir 100 ^ l / poço da solução de células NK nos poços necessários de uma placa de 96 poços V.
    1. Utilizam pelo menos dois poços para cada doador, um com e um sem estímulo (por exemplo, células tumorais K562 e citoquinas). Sempre que possível, a realização da experiência, pelo menos, em duplicado, e adicionar um controlo positivo (por exemplo, de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e ionomicina; concentração final: 50 nM de PMA, ionomicina 1 uM por poço). Prepare fluxo atualizada citometria de compensações para a data do experimento.
      NOTA: Titular os anticorpos uso anterior (ver discussão).
  2. Desligar a luz e adicione o anticorpo anti-CD107a (2 ul, concentração final: 1: 100) a cada poço com células NK na placa de 96-V-poço.
  3. Misture suavemente as células K562 pipetando para cima e para baixo por peloPelo menos 5 vezes.
    1. Dos poços contendo o anti-CD107a solução de anticorpos de células NK /, identifique a que está planeada para a estimulação com células K562. Adicionam-se 100 ul / poço de solução de células K562 para estes poços. Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes.
    2. Adicionar a interleucina-2 (IL-2; concentração final 100 U / ml) e interleucina-15 (IL-15; concentração final de 10 ng / ml) aos poços que contêm as células K562 e a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a.
      1. Opcional: testar o impacto da utilização de células K562 ou citoquinas por si só nas células NK distribuídos para decifrar contra as funções das células NK induzida por citoquinas induzidas por tumor.
    3. Identificar os poços na placa de 96-V-planeado bem como controlos negativos sem estímulo. Adicionam-se 100 ul / poço cm a estes poços contendo apenas a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a. Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes.
      1. Opcional: Para um controlo positivo, adicionar 100 μ; L CM contendo PMA e ionomicina (concentração final: 50 nM de PMA, ionomicina 1 uM por poço) para um poço com a solução de anticorpos das células NK / anti-CD107a.
  4. Incubar as células durante 3 h no escuro, a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Prepara-se uma solução de inibidor de transporte de proteínas (por exemplo, brefeldina A e / ou monensina) em CM. Após 1 h de incubação, adicionar a solução a cada poço da placa de 96-V-bem com a luz desligada (concentração final: 0.5-1μM brefeldina A e 2-3 pM monensina). Misture com cuidado pipetando cima e para baixo por pelo menos 5 vezes. Continuar a incubação durante 2 horas a restante.

5. Superfície de Coloração Intracelular e

  1. Após o período de incubação de 3 h, misturar as células dentro dos poços da placa de 96 poços V cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes e transferi-los para tubos de citometria de fluxo. Adicionar 1 ml / tubo de WB. células pelete a 400 x g durante 4 min.
    1. Opcional: antes da centrifugação lave os poços com 100 ul / poço de PBS, a fim de optimizar a recuperação de células, por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 5 vezes antes da transferência das células para o respectivo tubo de FACS.
  2. Descartar o sobrenadante e continue com as manchas na superfície.
  3. Incluir um corante fluorescente reactivo com amina que é não-permeado a células vivas com um máximo de emissão de 423 nm, como um marcador de célula morta fixável (DCM). Realizar a coloração antes (ver abaixo) ou em paralelo com a superfície de coloração de anticorpo, dependendo do tipo do o DCM usado.
    1. Re-suspender as células em 99 ul / tubo PBS e adicionar 1 ul / tubo do fixável DCM (concentração final: 1: 100). Misturar bem as células utilizando um vortex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro.
    2. Preparar uma solução mestre mistura misturando os anticorpos "superfície" listadas na Tabela 2 (ver coloração coluna passo destacado em azul). Use o emdicated volumes / tubo e multiplicá-las com o número de tubos de citometria de fluxo de ser manchada.
    3. Após a incubação ter a tubos de citometria de fluxo com as células e adicionar 1 mL / tubo de WB. Agregar as células a 400 xg durante 4 min.
    4. Descartar o sobrenadante, re-suspender as células em 84 mL / tubo de WB e adicionar 16 mL / tubo de solução mestre mix. Misturar bem as células usando um vórtice. Incubar as células durante 20 min a 4 ° C no escuro.
    5. Depois de 20 min adicionar 1 ml / tubo de WB e células de pelotas a 400 xg durante 4 min.
  4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL / tubo de uma solução de fixação a frio (por exemplo, 2% () paraformaldeído final ou formaldeído). Misturar bem as células usando um vórtice. Incubar as células durante 10 min a 4 ° C no escuro.
    1. Corar as células para as citocinas intracelulares / quimiocinas após este passo ou armazená-los durante a noite a 4 ° C em WB.
      NOTA: Depois de incubação durante a noite, uma recuperação de células inferior pode ocorrer.
      Atenção: O paraformaldeído e formaldeído são potenciais cancerígenos. Tratá-los em conformidade com a respectiva Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS).
  5. Lave as células em 1 ml de WB / tubo a 400 xg durante 4 min e prossiga com a etapa de permeabilização.
  6. Preparar um tampão de permeabilização (PB) (por exemplo, 0,2% de saponina, solução de BSA a 1% em PBS).
  7. Lavar as células duas vezes com 1 mL / tubo de PB a 400 xg durante 4 min. Continue com a coloração intracelular.
    Cuidado: A saponina é potencialmente irritante. Segurá-lo em conformidade com a correspondente Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS).
  8. Preparar uma solução mestre mix usando os indicados volumes de anticorpos "intracelular" da Tabela 2 (destacada em verde). Multiplicar estes volumes com o número de tubos a serem corados.
    1. Re-suspender as células em 90 ul de PB / tubo e aplicar 10 ul / tubo de solução de anticorpo a mistura mestre. Misturar bem utilizando um vortex e incubar as células durante três0 min a 4 ° C no escuro.
  9. Lave as células duas vezes com 1 mL / tubo de PB a 400 xg durante 4 min.
  10. Descartar o sobrenadante e re-suspender as células em 400 PB ul / tubo. Misturar bem as células usando um vórtice. Colocar as células em gelo, no escuro, até à medição.

6. Citometria de Fluxo de Remuneração e Aquisição

  1. Selecionar os canais para os diferentes fluorocromos (ver Tabela 2) dentro da citometria de fluxo software de aquisição na pasta configuração dos parâmetros. Além disso, os canais para escolher FSC-A e -H, bem como para SSC-A e -H.
  2. Carregar uma matriz de compensação criado para os parâmetros escolhidos para o arquivo de aquisição.
    1. Criar uma matriz de compensação usando células NK isolados a partir do passo 2.2.8, realizando uma única mancha de cor para cada fluorocromo utilizados (ver Tabela 2). Usar o protocolo de coloração de superfície descrito nos passos 5,1-5,4. Incluir um controlo imaculada (sem anticorpos), bem como controles isotípicos e / ou de fluorescência menos um controles (FMO).
      NOTA: Como alternativa à remuneração baseada em célula, use pérolas como controles de compensação IgG de ligação.
    2. Colocar cada tubo para amostras de manchas individuais e a amostra sem anticorpos na porta de injecção de amostra (SIP). Clique no botão "record" no programa de aquisição de citometria de fluxo e adquirir um número de células de pelo menos 5 x 10 3 células NK por amostra.
    3. Use o aplicativo de cálculo da compensação do software de aquisição de citometria para criar uma matriz de compensação.
  3. Criar gráficos de pontos para identificar o celular População NK.
    1. Identificar células individuais usando / SSC-H gráficos de pontos SSC-A FSC-A / FSC-H e. Clique no botão "gate polígono". Desenhar uma porta em torno das células, que têm um padrão de distribuição linear em ambos os gráficos de pontos. Dê um duplo clique sobre os portões para abrir um novo gráfico de pontos.
    2. Escolha um terreno FSC-A / SSC-Um ponto de identificar o linfócito/ População de células NK (ver Figura 1). Desenhe um portão polígono em torno dele e clique duas vezes no portão.
  4. Colocar cada tubo de amostra do ensaio de estimulação da célula NK para o SIP. Clique no botão "record" e adquirir um número de células de pelo menos 5 x 10 3 células NK por amostra.

7. Análise e Estatísticas

  1. Abra a citometria de fluxo do programa de software de análise. Clique no botão de amostra de carga para abrir a amostra de controlo não estimulado.
  2. Criar um Sistema de Supressão para as diferentes subpopulações NK celular (ver Figura 1).
    1. Clique no botão gráfico de pontos para criar uma FSC-A / SSC-A trama. Clique no botão porta retângulo e desenhe um portão retângulo sobre todos os eventos com um FSC-Um valor> 5 x 10 4 a excluir detritos. Abra o portão, clicando duas vezes no portão.
    2. Escolha novamente os / SSC-A parâmetros FSC-A no âmbito do novo diagrama de pontos e clique no botão portão polígono. Dem bruto de um portão polígono em torno da população de linfócitos (ver Figura 1). Abra o portão.
    3. Selecione o SSC-Um parâmetro / SSC-H para o novo gráfico de pontos e desenhar um portão polígono ao redor todas as células individuais. Células individuais demonstrar uma distribuição linear entre os parâmetros do FSC-A / FSC-H e SSC-A / SSC-H (ver Figura 1). Abra o portão com um duplo clique sobre ele.
    4. Repita o passo 7.2.3, usando os parâmetros FSC-A / FSC-H neste momento.
    5. Use o CD45 parâmetro e despejo de canal (CD3; CD14; CD19; DCM) para excluir as células mortas. Desenhe um portão retângulo ao redor de todo o CD45 positivo e Dump células negativas canal. Abra o portão, clicando duas vezes no portão.
    6. Identificar toda a população de células NK, usando o CD56 e despejo parâmetros do canal. Criar uma porta retângulo ao redor do CD56 positivo e Dump canalizar células negativas. Abra o portão com um duplo clique sobre ele.
    7. Desenhe um portão retângulo ao redor de todas as três subpopulações de células NK dentro de um CD56 gráfico de pontos / CD16. Identify os diferentes subgrupos como CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + e subpopulações de células CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analisar as funções das células NK para cada célula Subconjunto individual NK.
    1. Clique em um dos três portões NK subconjunto de células para abri-lo. Criar três gráficos de pontos diferentes para CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ e CD56 / MIP-1β.
    2. Desenhar um portão rectângulo de células positivas para CD56, que são positivas, bem como para CD107a, IFN-γ ou MIP-1β respectivamente (ver Figura 1).
    3. Repetir o passo 7.3.1-7.3.2 para cada subconjunto de células NK restante.
  4. Repita o passo 7.2 e 7.3 para todas as amostras estimuladas. Guardar todos os valores estatísticos de cada amostra individual, clicando no botão de exportação de estatística dentro do software de análise.
  5. Abra os arquivos contendo os valores estatísticos das amostras individuais para analisar as funções das células NK. Selecione os valores para a célula NK indivíduosubconjuntos (por exemplo, CD56 ++ CD16 - células NK), copiando-os em outro arquivo.
    1. Subtrair a percentagem de células positivas NK CD107a, que não foram tratados com um estímulo, a partir da percentagem de células NK positivos CD107a, que foram tratados com um estímulo.
      NOTA: É o resultado para demonstrar a capacidade de desgranulação deste subconjunto de células NK particular, em resposta ao estímulo.
    2. Repetir o passo 7.5.1 em células NK MIP-1ß-positivos IFN-γ e para demonstrar a produção de citocina e quimiocina, em resposta ao estímulo.
    3. Repita o passo 7.5.1-7.5.2 para cada subconjunto de células NK restante para avaliar a sua capacidade de degranulação e produção de citocinas / quimiocinas após estimulação.

Resultados

A estratégia de propagação para analisar a desgranulação, produção de citoquinas e de quimioquinas de toda a população de células NK e três subconjuntos de células NK diferentes estão ilustradas na Figura 1.

Os resultados representativos de um dador saudável estão ilustrados na Figura 2. As células NK sem qualquer estímulo produzido nem IFN-γ nem MIP-1β e não manifest...

Discussão

O método descrito é um método fácil, rápido e fiável para estudar as funções das células NK, a partir de amostras de sangue completo de dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Este método oferece a grande vantagem de purificar as células NK directamente a partir de sangue total, evitando o demorado centrifugação em gradiente de densidade, que é obrigatória em muitos outros métodos de purificação 15. Além disso, requer um menor tamanho da amostra em relação ao "clássico" de is...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

Referências

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