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Résumé

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Résumé

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

Introduction

Dans le cadre du système immunitaire inné tueuses naturelles (cellules NK) contribuent à la première ligne de défense contre les cellules infectées par le virus ou malignement transformées. Un système de récepteurs inhibiteurs et activateurs qui leur permet de distinguer entre les cellules saines et transformées sans apprêt préalable de l'antigène, contrairement aux lymphocytes T. Lors de la rencontre de la cellule cible les cellules NK libèrent le contenu de leurs granules cytotoxiques (par exemple, perforine, granzymes) dans la synapse immunitaire de tuer leur cible. En outre, les cellules NK produisent et sécrètent différents types de cytokines (par exemple, gamma interferon: IFN-γ, facteur de nécrose tumorale α: le TNF-α) et de chimiokines (par exemple, macrophage inflammatoire protéine-1β: MIP-1 ß) sur la cellule cible l' interaction ou la stimulation des cytokines 1.

les fonctions des cellules NK suffisantes telles que la cytotoxicité, la chimiokine et la production de cytokines ont un impact important sur le sort des diverses dissoulage. Les patients leucémiques montrent une augmentation des taux de rechute si elles présentent un profil défectueux des cellules NK au moment du diagnostic consistant en une production réduite de l' IFN-γ et une expression réduite d'activation des cellules NK 2 récepteurs. Un redressement rapide du nombre de cellules NK et la fonction , y compris la production de cytokines lors de l' interaction de la cellule cible est associée à une rechute réduite et l' amélioration de taux de survie chez les patients recevant souches allogéniques transplantation de cellules 3. En outre, lors de l' initiation de la thérapie par interféron chez les patients infectés par le virus de l' hépatite C dont la capacité de dégranulation des cellules NK périphériques est plus forte dans les premiers répondeurs que chez les non-répondeurs 4. Le nombre de cellules NK (> 80 / ul) au jour 15 après la transplantation de cellules souches autologues (autoSCT) chez les patients souffrant d' un lymphome ou un myélome multiple sont prédictifs d'une amélioration sans progression et la survie globale 5. Chez les patients souffrant de mélanome l'expression de la cellule T et immunoglobulin- mucine domaine containing molécule-3 (TIM-3), une protéine de régulation immunitaire sur les cellules NK, est en corrélation avec stade de la maladie et le pronostic 6.

Les scientifiques ont suivi les fonctions des cellules NK au cours des dernières décennies. L'analyse initiale de cytotoxicité des cellules NK contre les cellules tumorales sans amorçage préalable a été traitée en utilisant un dosage 51 Cr-release 7. Plus récemment, des chercheurs ont développé un procédé non radioactif pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK expansées 8. Cytokine et chimiokine production a souvent été évaluée en utilisant un dosage immuno (ELISA) techniques liés aux enzymes 9,10. Au cours des dernières décennies, ces méthodes ont été complétés par des essais à base de cytométrie en flux. L'utilisation d'inhibiteurs de la protéine de transport (par exemple, la monensine et la brefeldine A) et des procédés de perméabilisation cellulaire en combinaison avec des protocoles de coloration de surface classiques ont permis aux chercheurs d'étudier la chimiokine et la production de cytokines dans différents ganglions spécifiquesous - ensembles de ocyte (par exemple, T, cellules NK B ou) 11. En outre, des dosages à base de cytométrie de flux ont été développés pour surveiller T et la cytotoxicité des cellules NK. En 2004 , Alter et al. , Décrit l'expression de surface de la protéine associée au lysosome CD107a (Lampe 1) sur les cellules NK à la rencontre de la cellule cible en tant que marqueur pour la dégranulation des granules 12 cytotoxiques. Etant donné qu'une large gamme de différents fluorochromes et les cytomètres de flux à canaux multiples sont disponibles de nos jours, il est devenu possible de surveiller simultanément les différentes fonctions cellulaires (NK cytotoxicité, de cytokines et de production de chimiokine) dans différents sous-ensembles de cellules NK. Cela devient particulièrement important dans les situations où la taille de l' échantillon est limitée, par exemple, dans des biopsies ou des échantillons de sang de patients atteints de leucopénie.

Pour tester les fonctions globales de cellules NK, les essais à base de cytométrie de flux différents peuvent être efficacement combinés. Theorell et al. Les cellules NK stimulées de headonateurs lthy avec la lignée cellulaire tumorale K562 et analysé NK dégranulation cellulaire, signal à l' intérieur-out et chimiokine production via cytométrie en flux 13. Récemment des sous-groupes de cellules NK, phénotypes et fonctions chez les patients de tumeur pendant autoSCT ont été analysées à l'aide de flux tests basés sur la cytométrie. Il a été démontré que les cellules NK ont été capables de produire des cytokines et dégranulent / chimiokines sur la reconnaissance des cellules tumorales à des moments très tôt après 11 autoSCT.

Ici, un protocole est décrit pour évaluer les fonctions des cellules NK lors de l'interaction avec des cellules tumorales y compris la capacité de la dégranulation, la chimiokine et la production de cytokines à l'aide d'un flux de dosage basé sur une cytométrie qui permet de contrôler les fonctions des cellules NK dans les différents sous-ensembles simultanément.

Protocole

Cette étude a été réalisée en conformité avec les recommandations du comité d'éthique local de l'Université de Francfort.

1. Culture de cellules K562

  1. La culture de cellules K562 en R10 (Media RPMI1640 avec du milieu de glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine, 10% de sérum de veau foetal) à une densité de 0,5-1 x 10 6 cellules par ml dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2.
  2. Récolte des cellules K562 24 h Avant le début d'une nouvelle expérience.
    1. Retirer le flacon de culture cellulaire contenant les cellules K562 à partir de l'incubateur. Remettre en suspension les cellules K562 au sein des milieux de culture en pipettant doucement vers le haut et vers le bas.
    2. Transférer le milieu de culture contenant les cellules K562 dans un tube de 15 ou 50 ml et un culot cellulaire à 400 g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu R10 et bien mélanger.
    3. Transférer 20 ul de la solution de cellules dans un puits d'une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 ul bleu trypan etbien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et compter les cellules.
    4. Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min. Re-suspendre les cellules dans R10 médias et ajuster la concentration de cellules K562 à 0,5-1 x 10 6 cellules par ml.
    5. Incuber les cellules K562 dans un flacon de culture cellulaire à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à son utilisation.

2. Isolement des cellules NK

  1. Selon l'approbation et les directives du comité d'éthique local, obtenir le consentement éclairé du donneur ou d'un patient en bonne santé avant la collecte de 6-10 ml de l'EDTA ou du sang périphérique hépariné.
  2. Conserver les réactifs pour l'isolement des cellules NK à 4 ° C jusqu'à ce que le début de l'expérience, puis les utiliser à la température ambiante (RT) dans des conditions stériles. Isoler les cellules NK de sang périphérique en utilisant des microbilles magnétiques et un aimant pour l'isolement spécifique des cellules T selon lail les instructions du fabricant.
    1. Reconstituer un flacon de la cellule NK lyophilisée isolement négative cocktail d'anticorps par pipetage 7,5 ml du tampon fourni A (inclus dans le kit d'isolement des cellules NK) dans le flacon. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas 3-4 fois.
      REMARQUE: Assurez-vous que la suspension est homogène avant chaque utilisation.
    2. Préparer la solution finale de cocktail en mélangeant des volumes appropriés de la pastille reconstitué à partir de l'étape 2.2.1 et le tampon B (inclus dans le kit d'isolement des cellules NK). Pour déterminer ces volumes, de définir le volume de l'échantillon de sang total en ml le volume = 1,0. Utiliser 0,25 volume de la pastille reconstitué (étape 2.2.1) et 0,25 volume de tampon B à traiter 1 volume de sang total.
    3. Transférer le mélange dans un tube adéquat contenant l'échantillon de sang entier. Ne pas pipeter de haut en bas pour éviter la perte de sang au sein de la pipette. Au lieu de cela, fermer le tube et le déplacer avec précaution de haut en bas jusqu'à ce que la suspension est homogène. Ne pas vortex.
    4. homogénéiser davantage l'échantillon en utilisant un dispositif de rotation du tube pendant 5 min à température ambiante.
    5. Dans des conditions stériles, enlever le bouchon et placer le tube dans le séparateur magnétique pendant 15 min tel que recommandé par le fabricant. Assurez-vous que les étiquettes de tube soient orientés vers l'arrière de l'aimant pour permettre une visibilité tranquille de la ligne de séparation. Ne pas déplacer l'aimant lors de la séparation, que cette procédure serait perturbé.
    6. Soigneusement transférer le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml et remplir avec un milieu complet (CM, les médias hématopoïétique cellulaire, 1% de pénicilline / streptomycine, 5% des sérums humains). Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min.
      1. Facultatif: Si la pastille est rouge, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse des erythrocytes (par exemple, 1 ml d'ammoniaque-chlorure de potassium (ACK) tampon de lyse: 155 mM de NH4CI, 0,1 mM d' EDTA, 10 mM KHCO3 dans 1 litre d'eau distillée (DW)) et laisser incuber pendant 8 minutes à température ambiante. Vous pouvez également utiliser un erkit de déplétion ythrocyte.
        NOTE: Gardez à l' esprit, que l'utilisation d' un tampon ACK pourrait avoir un impact négatif sur les fonctions des cellules NK 14.
      2. Diluer rapidement le tampon ACK en ajoutant au moins 1 ml de CM pour arrêter la lyse et centrifuger à 400 g pendant 8 min pour sédimenter les cellules.
    7. Re-suspendre le culot cellulaire dans 1 ml CM et procéder au dépouillement. Transférer 20 ul de la solution de cellules NK sur une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 pi de bleu de méthylène dans chaque puits et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et de cellules compter. Vous pouvez également utiliser 30 pl de suspension cellulaire non dilué pour le comptage avec un compteur de cellules disponibles dans le commerce.
    8. Ajuster les cellules à une concentration d'au moins 2 x 10 4 cellules NK par 100 ul de CM.
    9. Effectuer une coloration d'anticorps de surface de la population isolée de cellules NK pour vérifier la pureté en utilisant un cytomètre de flux.
      1. Prepare une solution maître de mélange en mélangeant les volumes des anticorps indiqués selon le tableau 1.
      2. Remettre en suspension les cellules dans 88,5 ul de tampon de lavage (WB; 0,5% de sérum albumine bovine (BSA), 0,1% de NaN3 dans du PBS) et ajouter 11,5 ul de la solution maître de mixage. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
        Attention: NaN 3 est toxique et mutagène. Poignée en conséquence à la fiche de données de sécurité correspondantes (MSDS).
      3. Ajouter 1 ml de WB et sédimenter les cellules à 400 g pendant 4 min.
      4. Re-suspendre les cellules dans un tampon de coloration 300 pi, plus DAPI. Acquérir les cellules en utilisant un cytomètre de flux.
        REMARQUE: poursuivre l'essai que si la pureté des cellules NK est d'au moins 80% de tous les lymphocytes vivants.

3. La récolte des cellules K562 pour cellules NK Stimulation

  1. Retirer le flacon de culture cellulaire contenant les cellules K562 (étape 1.2) du ième e incubateur. Remettre en suspension les cellules K562 au sein des milieux de culture en pipettant doucement vers le haut et vers le bas.
  2. Transférer l'ensemble des milieux de culture dans un tube 15 ou 50 ml et sédimenter les cellules à 400 g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et bien mélanger.
  3. Transférer 20 ul de la solution de cellules dans un puits d'une plaque à 96 puits en U. Ajouter 20 ul bleu trypan et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Introduire à la pipette 10 ul de la solution dans une chambre de comptage de cellules et compter les cellules. Sinon, utiliser 30 pl de suspension cellulaire non dilué compter avec un compteur de cellules disponibles dans le commerce.
  4. Pellet les cellules à 400 g pendant 8 min. Remettre en suspension les cellules CM à une concentration d'au moins 2 x 10 4 cellules K562 par 100 ul de milieu de.
    REMARQUE: Utilisez le même K562 et les concentrations de cellules NK pour incuber les deux à un effecteur: cible (E: T) rapport de 1: 1 plus tard.
"> 4. Stimulation des cellules NK avec la tumeur cellulaire K562 Line et Cytokines

  1. Mélanger délicatement les cellules en les pipetant pendant au moins 5 fois. Distribuer 100 pl / puits de la solution des cellules NK dans les puits nécessaires d'une plaque à 96 puits V.
    1. Utilisez au moins deux puits pour chaque donneur, une avec et l' autre sans un stimulus (par exemple, des cellules tumorales K562 et cytokines). Chaque fois que possible, réaliser l'expérience au moins en double et ajouter un contrôle positif (par exemple, phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et ionomycine; concentration finale: 50 nM PMA, 1 uM ionomycine par puits). Préparer le flux mis à jour cytométrie compensations pour la date de l'expérience.
      NOTE: Titrer les anticorps avant utilisation (voir la discussion).
  2. Eteignez la lumière et ajouter l'anticorps anti-CD107a (2 pl, concentration finale: 1: 100) à chaque puits avec des cellules NK sur la plaque 96-V-bien.
  3. Mélanger délicatement les cellules K562 en les pipetant auau moins 5 fois.
    1. Des puits contenant le / anti-CD107a solution d'anticorps des cellules NK, identifier celles prévues pour la stimulation avec des cellules K562. Ajouter 100 ul / puits de la solution de cellules K562 dans ces puits. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois.
    2. Ajouter l'interleukine-2 (IL-2, la concentration finale de 100 U / ml) et l'interleukine-15 (IL-15; concentration finale de 10 ng / ml) dans les puits contenant des cellules K562 et la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a.
      1. Facultatif: Testez l'impact de soit des cellules K562 ou cytokines seul sur les cellules NK distribués à déchiffrer contre les fonctions des cellules NK induite par des cytokines induite par une tumeur.
    3. Identifier les puits sur la plaque 96-V-bien planifié contrôles négatifs sans stimulus. Ajouter 100 pl / puits CM à ces puits ne contenant que la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois.
      1. Facultatif: Pour un contrôle positif, ajouter 100 μ; L cm contenant du PMA et de l'ionomycine (concentration finale: 50 nM de PMA, ionomycine 1 pM par puits) dans un puits avec la solution d'anticorps des cellules NK / anti-CD107a.
  4. Incuber les cellules pendant 3 heures dans l'obscurité à 37 ° C et 5% de CO 2.
  5. Préparer une solution d'inhibiteur de transport des protéines (par exemple, la bréfeldine A et / ou la monensine) CM. Après 1 heure d'incubation, ajouter la solution à chaque puits de la plaque 96-V-bien avec la lumière éteinte (concentration finale: 0.5-1μM brefeldine A et 2-3 uM monensin). Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. Continuer l'incubation pour les 2 heures restantes.

5. Surface et intracellulaires Coloration

  1. Après la période d'incubation de 3 heures, mélanger les cellules dans les puits de la plaque 96-V-bien soigneusement par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois et de les transférer dans des tubes de cytométrie de flux. Ajouter 1 ml / tube WB. cellules de granule à 400 xg pendant 4 min.
    1. Facultatif: Avant centrifugation rincer les puits avec 100 pl / puits de PBS, afin d'optimiser la récupération des cellules, par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois avant de transférer les cellules dans le tube FACS respective.
  2. Jeter le surnageant et continuer avec le Coloration de surface.
  3. Inclure un colorant fluorescent amine réactif qui est non infiltrant de cellules vivantes avec un maximum d'émission de 423 nm comme morts marqueur de cellules fixable (DCM). Effectuer la coloration avant (voir ci-dessous) ou en parallèle avec la coloration de la surface de l'anticorps en fonction du type du DCM utilisé.
    1. Remettre en suspension les cellules dans 99 ul / tube de PBS et ajouter 1 pl / tube du DCM (concentration finale: 1: 100) peut être fixé. Mélanger les cellules et en utilisant un vortex et incuber pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
    2. Préparer une solution maître de mélange en mélangeant ensemble les anticorps «surface» figurant au tableau 2 (voir colonne de coloration étape surligné en bleu). Utilisez le endicated volumes / tube et les multiplier par le nombre de cytométrie de flux des tubes à être colorés.
    3. Après incubation prendre la cytométrie en flux tubes avec les cellules et ajouter 1 ml / tube WB. Pellet les cellules à 400 g pendant 4 min.
    4. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 84 ul / tube WB et ajouter 16 ul / tube de la solution maître de mélange. Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Incuber les cellules pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
    5. Après 20 minutes ajouter 1 ml / tube de WB et un culot de cellules à 400 g pendant 4 min.
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul / tube d'une solution de fixation à froid (par exemple, 2% ( en ) finale paraformaldéhyde ou le formaldéhyde). Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Incuber les cellules pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
    1. Colorer les cellules pour intracellulaires cytokines / chimiokines après cette étape ou de les stocker pendant une nuit à 4 ° C dans WB.
      NOTE: Après une nuit d'incubation, une reprise de la cellule inférieure peut se produire.
      Attention: paraformaldéhyde et le formaldéhyde sont potentiellement cancérigènes. Manipulez-les en conséquence à la fiche de données de sécurité respective (MSDS).
  5. Laver les cellules dans 1 ml / tube de WB à 400 g pendant 4 min et passez à l'étape de perméabilisation.
  6. Préparer un tampon de perméabilisation (PB) (par exemple, 0,2% de saponine, une solution de BSA à 1% dans du PBS).
  7. Laver les cellules deux fois dans 1 ml / tube PB à 400 g pendant 4 min. Continuer avec la coloration intracellulaire.
    Attention: saponine est potentiellement irritant. Poignée en conséquence à la fiche de données de sécurité correspondantes (MSDS).
  8. Préparer une solution maître de mélange en utilisant les volumes indiqués «intracellulaires» d'anticorps dans le tableau 2 (mis en évidence en vert). Multipliez ces volumes avec le nombre de tubes à colorer.
    1. Re-suspendre les cellules dans 90 ul / tube de PB et d'appliquer 10 pl / tube de la solution d'anticorps maître de mélange. Bien mélanger à l'aide d'un vortex et incuber les cellules pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  9. Laver les cellules deux fois dans 1 ml / tube PB à 400 g pendant 4 min.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 400 ul / tube de PB. Mélanger les cellules puits en utilisant un vortex. Placez les cellules sur la glace dans l'obscurité jusqu'à la mesure.

6. cytométrie de flux d'indemnisation et d'acquisition

  1. Sélectionnez les canaux pour les différents fluorochromes (voir le tableau 2) dans le flux de cytométrie logiciel d'acquisition dans le dossier de configuration des paramètres. En outre, pour choisir les canaux pour le FSC-A et -H, ainsi que pour la SSC-A et -H.
  2. Chargez une matrice de compensation créé pour les paramètres choisis dans le fichier d'acquisition.
    1. Créer une matrice de compensation en utilisant des cellules NK isolées de l' étape 2.2.8 en effectuant une seule tache de couleur pour chaque fluorochrome utilisé (voir le tableau 2). Utilisez le protocole de coloration de surface décrit dans les étapes 5.1-5.4. Inclure un témoin non coloré (sans anticorps) ainsi que des contrôles d'isotype et / ou fluorescence moins un contrôle (FMO).
      NOTE: Comme une alternative à la rémunération à base de cellules, utiliser des billes en tant que témoins de compensation IgG contraignant.
    2. Placer chaque tube pour les échantillons individuels de teinture, et l'échantillon sans anticorps dans le port d'injection d'échantillon (SIP). Cliquez sur le bouton "enregistrement" dans le logiciel d'acquisition de cytométrie de flux et d' acquérir un certain nombre de cellules d'au moins 5 x 10 3 cellules NK par échantillon.
    3. Utilisez l'application de calcul de la rémunération du logiciel d'acquisition cytométrie pour créer une matrice de compensation.
  3. Créer Parcelles Dot pour identifier la cellule NK Population.
    1. Identifier des cellules individuelles à l'aide de FSC-A / FSC-H et SSC-A / SSC-H tracés de points. Cliquez sur le bouton "porte de polygone". Dessiner une grille autour des cellules, qui ont un modèle de distribution linéaire dans les deux tracés de points. Double-cliquez sur les portes pour ouvrir un nouveau tracé de points.
    2. Choisissez un terrain FSC-A / SSC-Un point pour identifier le lymphocyte/ Population de cellules NK (voir Figure 1). Dessiner une grille polygonale autour d'elle et double-cliquez sur la porte.
  4. Placer chaque tube de l'essai de stimulation des cellules NK de l'échantillon dans le protocole SIP. Cliquez sur le bouton "enregistrement" et d' acquérir un certain nombre de cellules d'au moins 5 x 10 3 cellules NK par échantillon.

7. Analyse et statistiques

  1. Ouvrir la cytométrie de flux logiciel d'analyse. Cliquez sur le bouton de chargement d'échantillon pour ouvrir l'échantillon témoin non stimulé.
  2. Créer un système Gating pour les différentes sous - populations de cellules NK (voir Figure 1).
    1. Cliquez sur le bouton de tracé de points pour créer une FSC-A / SSC-Un terrain. Cliquez sur le bouton de porte de rectangle et dessiner une porte rectangle sur tous les événements avec un-A FSC valeur> 5 x 10 4 à exclure les débris. Ouvrez la porte en double-cliquant sur la porte.
    2. Choisissez à nouveau les / SSC-A paramètres FSC-A au sein de la nouvelle parcelle point et cliquez sur le bouton de porte de polygone. répremière une porte de polygone autour de la population de lymphocytes (voir Figure 1). Ouvre la porte.
    3. Sélectionnez le SSC-A / SSC-H paramètre pour le nouveau tracé de points et dessiner une grille polygonale autour de toutes les cellules individuelles. Les cellules individuelles montrent une distribution linéaire sur les paramètres FSC-A / FSC-H et SSC-A / SSC-H (voir la figure 1). Ouvrez la porte en double-cliquant dessus.
    4. Répétez l'étape 7.2.3 en utilisant les paramètres FSC-A / FSC-H cette fois.
    5. Utilisez le paramètre CD45 and Dump canal (CD3, CD14, CD19; DCM) pour exclure les cellules mortes. Dessinez une porte rectangle autour de tous CD45 positif et Dump cellules de canal négatives. Ouvrez la porte en double-cliquant sur la porte.
    6. Identifier l'ensemble de la population de cellules NK en utilisant le CD56 et de vidage des paramètres de canal. Créer une grille de rectangle autour du CD56 positif et Dump canaliser les cellules négatives. Ouvrez la porte en double-cliquant dessus.
    7. Dessiner une grille rectangle autour de tous les trois sous-ensembles de cellules NK dans un CD56 / CD16 dot plot. Identifier les différents sous - ensembles comme CD56 ++ CD16 -, CD56 ++ CD16 + et des sous - ensembles de cellules CD56 + CD16 ++ NK.
  3. Analyser NK fonctions cellulaires pour chaque cellule individuelle Subset NK.
    1. Cliquez sur l'un des trois sous-ensembles de cellules NK portes pour l'ouvrir. Créer trois tracés de points différents pour CD56 / CD107a, CD56 / IFN-γ et CD56 / MIP-1β.
    2. Dessiner une grille rectangulaire pour les cellules positives CD56, qui sont positifs aussi bien pour CD107a, IFN-γ ou MIP-1β respectivement (voir Figure 1).
    3. Répétez l'étape 7.3.1-7.3.2 pour chaque sous-ensemble restant des cellules NK.
  4. Répétez l'étape 7.2 et 7.3 pour tous les échantillons stimulés. Enregistrer toutes les valeurs statistiques de chaque échantillon individuel en cliquant sur le bouton de statistique exportateurs dans le logiciel d'analyse.
  5. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques des échantillons individuels pour analyser les fonctions des cellules NK. Sélectionnez les valeurs de cellules NK individuellesous - ensembles (par exemple, CD56 de la CD16 - les cellules NK) en les copiant dans un autre fichier.
    1. Soustraire le pourcentage de cellules NK CD107a positive, ce qui n'a pas été traité avec un stimulus, par rapport au pourcentage de cellules NK positives CD107a, qui ont été traités avec un stimulus.
      REMARQUE: Utilisez le résultat pour démontrer la capacité de dégranulation de cette cellule sous-ensemble NK particulier en réponse au stimulus.
    2. Répétez l'étape 7.5.1 pour l'IFN-γ et les cellules NK MIP-1ß-positifs pour démontrer la production de cytokines et de chimiokines, en réponse au stimulus.
    3. Répétez l'étape 7.5.1-7.5.2 pour chaque sous-ensemble restant de cellules NK pour évaluer leur capacité de dégranulation et la production cytokine / chimiokine lors de la stimulation.

Résultats

La stratégie d'ouverture de porte pour analyser la dégranulation, la production de cytokines et chimiokines de l' ensemble de la population de cellules NK et de trois sous - ensembles de cellules NK différentes sont illustrés sur la figure 1.

Des résultats représentatifs d'un donneur sain sont illustrés sur la figure 2. Les cellules NK sans stimulation produites ni IFN...

Discussion

La méthode décrite est une approche facile, rapide et fiable pour étudier les fonctions des cellules NK à partir d'échantillons de sang total de donneurs sains ou de patients. Ce procédé offre le grand avantage de purifier directement les cellules NK dans le sang total, en évitant le temps centrifugation en gradient de densité, qui est obligatoire pour de nombreux autres procédés de purification 15. En outre, il nécessite une plus petite taille de l'échantillon par rapport à des procéd?...

Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

Authors were supported by the German Cancer Aid (Max Eder Nachwuchsgruppe, Deutsche Krebshilfe; EU), the LOEWE Center for Cell and Gene Therapy Frankfurt (EU, ST) funded by the Hessian Ministry of Higher Education, Research and the Arts, Germany (III L 4- 518/17.004) and by the "Alfred- und Angelika Gutermuth-Stiftung", Frankfurt, Germany (EU). BJ was funded by a Mildred Scheel postdoctoral scholarship from the Dr. Mildred Scheel Foundation for Cancer Research. ST was founded by a GO-IN postdoctoral fellowship (PCOFUND-GA-2011-291776). The authors thank Becton Dickinson (BD) for providing the FACSCanto II and Canto10c Flow Cytometry Analyzers used in this study.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 + glutamineInvitrogen6187-044
penicilin/streptomycinInvitrogen15140-122
BD Falcon Round Bottom TubeBD352008
fetal calf serumInvitrogen10270-106heat inactivated before use
T-flaskGreiner Bio-One690195
K562 tumor cell lineDSMZ GmbHACC 10
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysis buffermade in house/components are listed in the text
Distilled water: Ampuwa Spüllösung 1000ml PlastipurFresenius Kabi1088813
Megafuge 40R CentrifugeHeraeus/
EDTA blood collector tubesSarstedt386453S-Monovette 7,5 ml, K3 EDTA
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Hematopoietic media (XVIVO)Lonza Group LtdBE04-743Q
human serumDRK Blutspendedienst, Frankfurt/M /healthy donors with blood type AB; heat inactivated before use
Neubauer-improved counting chamber, bright lineMarienfeld superior/ LO-Laboroptik Ltd.0640030/ 1110000
trypan blue solution (0,4%)Invitrogen15250-061
3% acetic acid with methylene blueStemcell Technologies 07060
Corning 96 Well Clear V-Bottom TC-treated MicroplatesCorning 3894
Falcon 96 Well Round Bottom Not Treated MicroplatesCorning 351177
DPBS (Ca2+- and Mg2+-free)Gibco Invitrogen14190-169
BSASigma AldrichA2153-100G
NaN3Sigma Aldrich08591-1ML-F
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Merck524400-1MG
ionomycin PromoKinePK-CA577-1566-5
interleukin 15 (IL-15)PeproTech200-15
Proleukin S (IL-2) Novartis Pharma730523
Golgi Stop, Protein Transport Inhibitor (containing Monensin)BD Biosciences554724This product can be used in combination or instead of Golgi Plug. The best combination for the wished experimental setting has to be tested.
Golgi Plug, Protein Transport Inhibitor (containing Brefeldin A)BD Biosciences555029
paraformaldehydeAppliChemUN2209
saponinSigma Aldrich47036
flow cytometer: Canto10CBD Biosciences/
FlowJoTreeStar Inc./
Graph PadGraph Pad Inc./
MACSxpress SeparatorMiltenyi Biotec 130-098-308
MACSxpress NK isolation kitMiltenyi Biotec 130-098-185
MACSxpress Erythrocyte Depletion Kit, humanMiltenyi Biotec 130-098-196
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
anti-human CD3 APCBiolegend300412
anti-human CD3 V450BD Biosciences560366
anti-human CD14 PerCPMiltenyi Biotec 130-094-969
anti-human CD14 V450BD Biosciences560349
anti-human CD16 PEBiolegend302008
anti-human CD16 PerCPBiolegend302029
anti-human CD19 PE-Cy7Biolegend302216
anti-human CD19 V450BD Biosciences560353
anti-human CD45 BV510BD Biosciences563204
anti-human CD56 FITCBiolegend345811
anti-human CD107a PEBiolegend328608
anti-human IFN-γ AF-647BD Biosciences557729
anti-human MIP-1β APC-H7BD Biosciences561280
DAPIBiolegend422801
Zombie Violet Fixable Viability KitBiolegend423113fixable dead cell marker

Références

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