قياس التقدمي العصبية الإعاقة في نموذج الفأر من مرض التصلب العصبي المتعدد

Summary

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Abstract

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introduction

تايلر الفئران التهاب الدماغ فيروس (TMEV) هو فيروس RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل موجه للعصب الذي يصيب باستمرار الجهاز العصبي المركزي الفئران (CNS). في الفئران عرضة، والعدوى مع TMEV يسبب والمرض المزيل لل-المزمنة التدريجي المناعة بوساطة، والمعروفة باسم يسببها TMEV المرض المزيل (TMEV-IDD). العدوى التجريبية من الفئران يأخذ مسار المرض تشبه تلك التي شوهدت في أشكال التدريجي لمرض التصلب المتعدد (MS). يتميز TMEV-الاتصال الدولي المباشر من قبل مرحلتين متميزتين: المرحلة الحادة والمرحلة المزمنة. المرحلة الحادة هو معتدل، عادة تحت الإكلينيكي التهاب الدماغ ^1،2. المرحلة الثانية، المزمنة، ابتداء نحو شهر بعد الإصابة، يتكون من العجز تتقدم ببطء تتميز إزالة الميالين، والالتهابات، ومحور عصبي ^1،2 الضرر. ويرتبط ضعف لوحظت في الفئران مع التشنج، وأحيانا تشنجات منشط شديدة.

لأن هناك حاليا أي medicatioنانو ثانية للتخفيف من العجز التقدمية في المرضى، تنجذب الباحثين بشكل خاص TMEV-الاتصال الدولي المباشر، وهو ما يمثل نموذج حيواني الأمثل لرصد تأثير الأدوية المعدلة للمرض على تطور المرض. ومع ذلك، في الفئران وكذلك في مرضى التصلب المتعدد، ورصد تطور العجز يتطلب المراقبة السريرية مستمرة على مدى فترات طويلة من الوقت. في الفئران، ورصد طويلة الأجل لتطور العجز ويمكن تحقيق ذلك مع اختبار الأداء Rotarod.

اختبار الأداء Rotarod هو اختبار السلوك القياسية التي تقيم وظائف المرتبطة السيارات مثل التنسيق والتوازن، والتعب في القوارض. الفئران لها للحفاظ على توازنها على قضيب تحول، والذي يدور في ظل التسارع المستمر. الكمون الوقت لتسقط من يتم تسجيل هذا قضيب. حيوانات مع خلل عصبي غير قادر على البقاء على قضيب الدورية طالما الضوابط، ويسقطون عادة قبالة عندما تتجاوز سرعة دورانهاقدرة المحرك. انخفاض القيمة أكثر عصبية والحيوانات لديها، وكلما كانت تسقط على قضيب، وأقصر الكمون الوقت.

الاستفادة من تجارب Rotarod على أنظمة التسجيل البصرية التقليدية هو أنه يولد موضوعي وقابل للقياس متغير الوقت الكمون والتي يمكن استخدامها في نهاية المطاف التحليلات الإحصائية لقياس آثار العلاجات والإجراءات التجريبية ^3.

في مختبر علم المناعة العصبية (لوني) في دارتموث، يتعرض الفئران لبروتوكول التكيف، حيث يتم اختبارها قبل العدوى TMEV من أجل تعريفهم على آلة وتقييم العادي "الأساس" التنسيق توازنها والتحكم في المحركات ^{4، 5.} وبمجرد وضع خط الأساس وإصابة الفئران مع TMEV، يتم اختبارها مرة واحدة أو مرتين في الأسبوع على مدى عدة أشهر. بروتوكول الاختبار الفعلي يستمر في المتوسط ​​150 يوما، مما يتيح إجراء تقييم للتراجع التوازن والتنسيق، والتحكم في المحركات على مدى كامل من هذا المرض المزيل.

وقد تم اختبار عدة مئات من TMEV-الاتصال الدولي المباشر والمعالجة الصورية الفئران حتى الآن عن خلل عصبي في دارتموث. وكانت هذه الفئران تلقت العديد من العلاجات المناعية، ولكن لم يتم العثور على وكيل الدوائية لتكون فعالة في تخفيف تطور العجز ^6،7. هذه المادة وعلى البروتوكول المتعلق تصف كيفية تميز إعاقة للجهاز العصبي التدريجي المعروضة من قبل الفئران TMEV-الاتصال الدولي المباشر. بشكل خاص، بروتوكول يقدم توصيات يختبر معلمات معينة يعتقد أنها مناسبة بشكل عام لدراسة الإعاقة العصبية في الفئران TMEV-الاتصال الدولي المباشر باستخدام اختبار Rotarod. يوفر هذا الإجراء خط الأساس يمكن على أساسها تقييم (1) أهمية هذا نموذج الفأر لمرض التصلب العصبي المتعدد التدريجي و(2) فائدته لاختبار العلاجات التي تهدف إلى علاج الحالات العصبية التقدمية مثل MS. ومن الواضح أناختبار الأداء Rotarod والحاليين بروتوكول المعلمات الاختبار الأمثل وليست مفيدة فقط في الكشف عن الإعاقة العصبية التقدمية في نموذج الفأر TMEV-الاتصال الدولي المباشر، بل هي أيضا مفيدة في الكشف عن ضعف في نماذج أخرى يسببها فيروس و / أو الماوس الجيني للأمراض الاعصاب.

Protocol

كل عمل الحيوان يستخدم بروتوكولات مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في مدرسة جيزل الطب في دارتموث.

1. الفأر نموذج

1. تحريض المرض المزيل للالمستحثة TMEV-
   1. نقل الأقفاص التي تحتوي البالغ من العمر 6 أسابيع-4- إلى الإناث SJL / JHan الفئران من رف إلى مساحة عمل مريحة. بمناسبة الفئران (على سبيل المثال، مع علامة الأذن أو لكمة الأذن) للسماح للتقييم الفردي للأمراض السريرية والنسيجية.
   2. رسم 30 ميكرولتر من اصابة الأسهم TMEV (وحدات تشكيل 2 × 10 ⁶ اللوحة، PFU) في برنامج تلفزيوني في حقنة الأنسولين 29 عيار والإبرة.
   3. إعداد آلة غاز التخدير: التحقق من نظام لضمان وجود كميات كافية من الأكسجين والأيزوفلورين لمدة الإجراء.
   4. بدوره على تدفق متر إلى 1 لتر / دقيقة. وضع الحيوانات في غرفة تحريض وختم أعلى. تشغيل زارة شؤون المحاربين القدامىporizer إلى 3.5٪، ومراقبة الحيوانات حتى راقد.
   5. إزالة الحيوان من الغرفة واختبار الماوس عن طريق معسر قاطع الطريق لضمان التخدير المناسب. عدم الاستجابة لقرصة قوية تشير التخدير المناسب.
   6. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ ايزوبروبيل.
   7. حقن 30 ميكرولتر من الأسهم اصابة TMEV في نصف الكرة المخية اليمنى عن طريق الحقن مرفوعة (الشكل 1). موقع الحقن هو في منتصف المسافة تقريبا بين خط العين والأذن وقبالة خط الوسط.
   8. عودة الماوس إلى القفص حصتها مرة واحدة في حالة تأهب والمحمول بالكامل (عادة 3-5 دقائق).
   9. الموت ببطء الفئران عن طريق استنزاف أو نضح القلب بعد 3-6 أشهر العدوى TMEV، اعتمادا على سرعة تطور المرض.

2. تحليل Rotarod

1. جهاز Rotarod
   1. الفئران اختبار قبل العدوى TMEV لتعريفهمآلة وتقييم الرقابة التنسيق توازن خط الأساس والمحرك وضعها الطبيعي.
   2. بدء تشغيل بروتوكول التكيف في أيام -5 إصابة آخر (نقطة في البوصة، أي قبل 5 أيام من العدوى TMEV).
   3. السماح للفئران حتى يتأقلم إلى غرفة الاختبار لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل Rotarod الاختبار، وذلك لتمكينهم من التكيف مع البيئة.
   4. تأكد من أن كل وحدة Rotarod والكمبيوتر وتوصيله في ومتصلة مع بعضها البعض (الشكل 2).
   5. قبل تعيين Rotarod مع -5 نقطة في البوصة المعلمات بروتوكول التدريب، كما هو موضح في الجدول رقم 1.
   6. حفظ ملف العمل مع التاريخ وتحديد المعلومات.
   7. نقل قفص يحتوي على تشكيلة لفحصها من رف إلى الجدول المجاور لRotarod. يتم اختبار الفئران عادة في مجموعات من 4.
   8. التقاط الماوس من ذيله ووضعه على قضيب، التي تواجه بعيدا عن المشغل. أكرر للمرة الثانية عن طريق الماوس الرابع. إذا كان فال الماوسليرة سورية أو يقفز، وضعه مرة أخرى في مسارها على Rotarod حتى كل الفئران التي هي في الموقف. تجاهل جدت الفئران بدوره حولها لمواجهة المشغل.
   9. بعد تحميل جميع الفئران، اضغط على زر "إدخال" لبدء التجربة. مراقبة توقيت تبدأ تلقائيا والتناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على الشاشة لكل حارة.
      1. كما يقع كل حيوان من قضيب، تسجيل سرعة قضيب في وقت الخريف، وكذلك مدة من الزمن ظلت الحيوان على قضيب. وسوف تستمر قضيب لتدوير حتى انخفض حيوان آخر من التجمع قضيب.
   10. بعد أن سقطت كل الفئران، واستخدام الأنسجة لإزالة أي بولي البراز والبول من القضيب. وجود البول والمواد البرازية قد يؤثر على قدرة الفئران لقبضة قضيب.
       1. بعد راحة 3-مين، وإعطاء الفئران الثانية ومن ثم محاكمة ثالثة. الحد الأقصى للوقت في محاكمة واحدة هو 240 ثانية. إدارة ما مجموعه 3 محاكمات خلال كل يوم الاختبار.
   11. عودة الفئران إلى قفص المنزل والعودة إليها مرة أخرى إلى الرف. في نهاية الدورة التجريبية، وتنظيف Rotarod بالماء والصابون لإزالة جميع البراز خارج الجهاز.
   12. مسح تنظيف اللوح الأساس مع الايثانول 70٪. رش أسفل الجهاز كله مع ثاني أكسيد الكلور لتعقيم.
   13. في أيام - 4، - 3، - 2، و- 1 بي، قبل تعيين Rotarod مع المعلمات بروتوكول التدريب المناسبة، كما هو موضح في الجدول رقم 1، وكرر الخطوات من 2.1.2 إلى 2.1.12.
   14. بعد الحصول على التدابير الأساسية، ويصيب الفئران مع TMEV. السماح بفترة انتعاش بي لمدة 6 أيام.

بروتوكول	يوم الاختبار	تردد	سرعة الانطلاق (دورة في الدقيقة)	ماكسالسرعة (دورة في الدقيقة)	تسريع	محاكمات	ITI
					(دورة في الدقيقة / ثانية)	(N س ثانية)	(دقيقة)
تدريب	- 5 نقطة في البوصة	يوم 1	1	12	03/01	3x240 ثانية	3
	- 4 نقطة في البوصة	يوم 1	1	13	03/01	3x240 ثانية	3
	- 3 نقطة في البوصة	يوم 1	1	14	03/01	3x240 ثانية	3
	- 2. - 1 نقطة في البوصة	يوم 1	5	40	03/01	3x240 ثانية	3
تجريبي	من 7-50 نقطة في البوصة	2 أسبوع	5	40	30/05	3x240 ثانية	3
	من 51-150 نقطة في البوصة	أسبوع 1	5	40	30/05	3x240 ثانية	3

الجدول 1: Rotarod معلمات في التدريب والبروتوكولات التجريبية.

2. بروتوكول التجريبية Rotarod
   1. على +7 نقطة في البوصة، قبل تعيين Rotarod مع المعلمات بروتوكول التجريبية المناسبة، كما هو موضح في الجدول رقم 1. كرر الخطوات من 2.1.2 إلى 2.1.10.
   2. في نهاية محاكمة # 3، وزن كل فأر وتقديم مذكرة من وزن الجسم على ورقة البيانات. نظيفة وتطهير Rotarod حسب الخطوات 2.1.11 و2.1.12.
   3. اختبار الفئران مرتين في الأسبوع لمدة 6 أسابيع التالية، كما هو موضح أعلاه. بعد 6 أسابيع (في هذه الفئران قد المرجح التوصل إلى مرحلة الهضبة) ^8،9، اختبار الفئران مرة واحدة في الأسبوع مع نفس experimentaبروتوكول لتر. بروتوكول الاختبار الفعلي يستمر في المتوسط ​​150 يوما، وهذا يتوقف على مسار مرض معين.
3. مؤشر الوظيفي للجهاز العصبي
   1. تصدير البيانات الخام إلى ملف البيانات وتحليل النتائج.
   2. البيانات كما أعرب عن إدارة الوقت (الشكل 3A): هذه هي المرة تشغيل العادي بالإضافة إلى الوقت دوران السلبي ناقص وقت دوران تأخير (الجدول 2) ^10. حساب متوسط ​​تشغيل وقت المحاكمات الثلاث في اليوم الواحد.
   3. التعبير عن البيانات كما مؤشر عصبي وظيفي (المواد غير الغذائية، الشكل 3B).
      1. حساب عتبة الأداء الأساسية من كل فأر الفردية. يتم تحديد عتبة أداء خط الأساس بأنه متوسط جميع الأوقات يمتد من يوم + 15 + 45 لبي ^6،7.
      2. حساب المواد غير الغذائية كمتوسط العصر تشغيل متوسط أحدث ثلاثة مقسوما على عتبة أداء خط الأساس من أن ^6،7 الماوس محدد ^</ سوب>.
         ملاحظة: إذا كان اختبار مرات الترشح للماوس على يوم + 72، + 76، و + 79 بي هي 55 ثانية، 45 ثانية و 50 ثانية، وزمن الأساس لنفس الماوس كان 135 ثانية، والمواد غير الغذائية لهذا الماوس على +79 نقطة في البوصة سيكون [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 أو 0.37.
   4. التعبير عن البيانات كما والمواد غير الغذائية المعدلة (adjNFI، الشكل 3C): ضبط بيانات المواد غير الغذائية من قيمة السكان لتجربة واحدة.
      1. حساب adjNFI بقسمة قيمة المواد غير الغذائية في متوسط ​​المواد غير الغذائية التي حصلت عليها المجموعة التي عولجت صورية في ذلك اليوم تحديدا.

مصطلح	تعريف
إدارة الوقت العادي	الوقت الإجمالي الماوس تنفق تشغيل بنشاط على قضيب الدورية، أي الكمون في الانخفاض.
الساعة تناوب السلبي	ولمن الزمن ظلت جبل الماوس على قضيب في وضع الدوران السلبي.
تأخير الوقت تناوب	مقدار الوقت الماوس يبقى على قضيب أثناء وضع الدوران السلبي
طريقة التناوب السلبي	عندما الاستيلاء على الماوس قضيب وتدور دون الحاجة إلى ambulate.
إجمالي وقت الجلسة	المبلغ الإجمالي من الوقت تبقى الماوس على قضيب الدورية خلال الدورة.
أداء خط الأساس	تقييم الأداء الحركي-الضرر قبل لتحديد الحد الأدنى أداء.
مؤشر ظيفة الجهاز العصبي (غير الغذائية)	مؤشر السريري، الذي يقارن كل الأداء الحركي الماوس، أي يشغل وقت، في أي وقت لذروة الأداء.
مؤشر ظيفة الجهاز العصبي المعدل (adjNFI)	عندما يتم تطبيق عملية تطبيع لضبط بيانات المواد غير الغذائية من قيمة السكان لفي تجربة واحدة.
قيمة السكان	متوسط ​​قيمة المواد غير الغذائية التي حصلت عليها المجموعة التي عولجت صورية في يوم معين.

الجدول 2: تعاريف Rotarod معلمات اعتمد على القياس الكمي العصبية انخفاض قيمة.

النتائج

وكان الهدف من هذه التجربة التمثيلية للمقارنة الإعاقة العصبية الناجمة عن سلالة دانيلز (DA) والفول سلالة من TMEV. لأغراض هذه الدراسة، أصيب مجموعة من 32 الفئران SJL الإناث intracranially مع TMEV، إما سلالة DA (ن = 16) أو سلالة فول (ن = 16)، وكانت ترصد علامات السريرية على مر ?...

Discussion

وعلى الرغم من بعض القيود، يمثل اختبار الأداء Rotarod أداة هامة لتقييم وظيفة الحركة واختلال وظيفي في TMEV-الاتصال الدولي المباشر، فضلا عن تأثير التدخلات الدوائية على تطور العجز في الفئران.

وقد وصفت الاختبار Rotarod أولا في عام 1957 كأداة لق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M