La medición de la discapacidad neurológica progresiva en un modelo de ratón de la esclerosis múltiple

Resumen

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Resumen

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introducción

Virus Murino encefalomielitis de Theiler (TMEV) es un virus de ARN de cadena simple neurotrópico que persistentemente infecta el sistema nervioso central murino (CNS). En ratones susceptibles, la infección con TMEV causa una, enfermedad desmielinizante crónica progresiva inmunomediada, conocida como enfermedad desmielinizante inducida por TMEV (TMEV-IDD). La infección experimental de ratones toma un curso de la enfermedad se asemeja a la observada en las formas progresivas de la esclerosis múltiple (MS). TMEV-IDD se caracteriza por dos fases distintas: la fase aguda y la fase crónica. La fase aguda es una, ^1,2 encefalitis generalmente subclínica leve. La segunda fase, crónica, que comienza alrededor de un mes después de la infección, se compone de una discapacidad aumento que se caracteriza por la desmielinización, la inflamación y el daño axonal ^1,2. La debilidad observada en ratones se asocia con la espasticidad y, en ocasiones, graves espasmos tónicos.

Debido a que hay actualmente ningún medicamenns para mejorar la discapacidad progresiva en los pacientes, los investigadores se sienten especialmente atraídos por TMEV-DDI, lo que representa un modelo animal óptimo para el seguimiento del impacto de los fármacos modificadores de la enfermedad en la progresión de la enfermedad. Sin embargo, en ratones, así como en pacientes con EM, la monitorización de la progresión de la discapacidad requiere una observación clínica continua durante largos períodos de tiempo. En ratones, el seguimiento a largo plazo para la progresión de la discapacidad se puede lograr con la prueba de rendimiento de Rotarod.

La prueba de rendimiento de Rotarod es una prueba de comportamiento estándar que evalúa las funciones motoras asociadas a tales como la coordinación, el equilibrio y la fatiga en los roedores. Los ratones tienen que mantener el equilibrio sobre una varilla giratoria, que está girando en aceleración continua; la latencia de tiempo para caer de esta barra se registra. Los animales con disfunción neurológica no pueden permanecer en la barra giratoria, siempre que los controles, y que normalmente entrega cuando la velocidad de rotación es superior a sula capacidad del motor. El deterioro neurológico más los animales tienen, más pronto se caiga la varilla, y el más corto es el tiempo de latencia es.

La ventaja de la prueba de rotarod en los sistemas tradicionales de puntuación visual es que genera un objetivo, medible variable el tiempo de latencia-que en última instancia puede ser utilizado para los análisis estadísticos para cuantificar los efectos de las terapias y procedimientos experimentales ^3.

En el Laboratorio de Neuroinmunología (LONI) en Dartmouth, los ratones son sometidos a un protocolo de adaptación, en el que se prueban antes de la infección por TMEV con el fin de que se familiaricen con la máquina y para evaluar su normal "línea de base" equilibrio coordinación y el control motor ^{4, 5.} Una vez que se estableció la línea de base y los ratones están infectados con TMEV, que se ponen a prueba una vez o dos veces a la semana durante un período de varios meses. El protocolo de prueba real tiene una duración media de 150 días, lo que permite una evaluación dela disminución de equilibrio, coordinación, y control del motor durante todo el curso de la enfermedad desmielinizante.

Varios cientos de TMEV-IDD y tratada simulacro que los ratones se han probado hasta el momento para la disfunción neurológica en Dartmouth. Estos ratones habían recibido varios tratamientos inmunomoduladores, pero ningún agente farmacológico ha demostrado ser eficaz en la mejora de progresión de la discapacidad ^6,7. El presente artículo y el protocolo relacionado describen cómo caracterizar el deterioro neurológico progresivo mostrada por los ratones TMEV-IDD. En particular, el protocolo ofrece recomendaciones de parámetros de prueba específicos que se consideran generalmente adecuados para el estudio de la discapacidad neurológica en ratones TMEV-IDD utilizando la prueba de Rotarod. Este procedimiento proporciona una línea de base que sirve para evaluar (1) la relevancia de este modelo de ratón para la EM progresiva y (2) su utilidad para probar terapias destinadas al tratamiento de enfermedades neurológicas progresivas como la esclerosis múltiple. Claramente, laprueba de rendimiento de Rotarod y el protocolo de parámetros de prueba optimizados y actual no sólo son útiles en la detección de la discapacidad neurológica progresiva en el modelo de ratón TMEV-IDD, pero también son útiles en el descubrimiento de las deficiencias en otros modelos de virus inducida y / o de ratón genético de las enfermedades neurodegenerativas.

Protocolo

Todo el trabajo con animales utiliza protocolos revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Escuela Geisel de Medicina de Dartmouth.

1. El modelo de ratón

1. La inducción de la enfermedad desmielinizante inducida por TMEV
   1. Mover las jaulas que contienen de 4 a 6 semanas de edad, hembra SJL / JHAN ratones del bastidor a un espacio de trabajo confortable. Marcar los ratones (por ejemplo, con una marca auricular o un punzón oído) para permitir una evaluación individual de la enfermedad clínica e histológica.
   2. Dibujar 30 l de TMEV Stock infectar (unidades formadoras de 2 x 10 ⁶ placa; UFP) en PBS en una jeringa de insulina de calibre 29 y una aguja.
   3. Preparar la máquina de anestesia de gas: compruebe el sistema para asegurar la presencia de cantidades adecuadas de oxígeno e isoflurano durante la duración del procedimiento.
   4. Encienda el medidor de flujo de 1 L / min. Colocar el animal en la cámara de inducción y sellar la parte superior. Encienda el VAporizer a 3,5% y controlar al animal hasta reclinada.
   5. Retire el animal de la cámara y poner a prueba el ratón pellizcando la almohadilla para asegurar una anestesia adecuada. La falta de respuesta a una pizca fuerte indica una anestesia adecuada.
   6. Limpiar el sitio de la inyección con alcohol isopropílico al 70%.
   7. Inyectar los 30 l de TMEV Stock infectando en el hemisferio cerebral derecho por inyección a mano alzada (Figura 1). El sitio de la inyección es aproximadamente a medio camino entre la línea de vista y el oído, y justo al lado de la línea media.
   8. Vuelva a colocar el puntero del ratón a su jaula de retención una vez completamente alerta y móvil (generalmente de 3 - 5 min).
   9. La eutanasia a los ratones por exanguinación o perfusión cardíaca 3 a 6 meses después de la infección TMEV, en función de la rapidez del desarrollo de la enfermedad.

2. Análisis de Rotarod

1. El Aparato de Rotarod
   1. ratones de prueba antes de la infección por TMEV que se familiaricen con elmáquina y para evaluar su coordinación balance de línea de base y el motor de control normal.
   2. Iniciar el protocolo de adaptación en los días -5 después de la infección (dpi; es decir, 5 días antes de la infección por TMEV).
   3. Permitir que los ratones se aclimaten a la cámara de ensayo durante al menos 30 minutos antes de la prueba de Rotarod, con el fin de permitir que se ajustan al medio ambiente.
   4. Asegúrese de que tanto la unidad de Rotarod y el ordenador están conectados y conectados entre sí (Figura 2).
   5. Programado en el rotarod con los parámetros del protocolo de entrenamiento dpi -5, tal como se describe en la Tabla 1.
   6. Guarde el archivo de trabajo con la información de la fecha y la identificación.
   7. Mover la jaula que contiene el equipo a ensayar desde el bastidor a una mesa junto a la rotarod. Los ratones se prueban normalmente en escuadrones de 4.
   8. Recoger a un ratón por la cola y lo coloca en la barra, de espaldas a la operadora. Repita para el segundo hasta el cuarto ratón. Si un ratón falls o saltos, colocarlo de nuevo en su carril de la rotarod hasta que todos los ratones están en posición. No haga caso de cualquier ratones dan la vuelta para hacer frente al operador.
   9. Después de cargar todos los ratones, presione el botón "Enter" para iniciar el experimento. Observar los temporizadores se inician automáticamente y las revoluciones por minuto (rpm) en la pantalla para cada carril.
      1. Como cada animal se cae de la barra, registrar la velocidad de la varilla en el momento de la caída, así como la duración de tiempo que el animal permanecía en la varilla. La varilla seguirá girando hasta que el último animal ha caído del conjunto de la varilla.
   10. Después de que todos los ratones han caído, utilice un pañuelo de papel para eliminar cualquier bolos fecales y la orina de la varilla. La presencia de orina y la materia fecal puede afectar a la capacidad de los ratones para agarrar la barra.
       1. Después de un descanso de 3 minutos, dar a los ratones una segunda y una tercera prueba. El tiempo máximo por solo ensayo es de 240 seg. Administrar un total de 3 pruebas durante cada día de la prueba.
   11. Devolver los ratones a sus jaulas y devolverlos de nuevo al bastidor. Al final de la sesión experimental, limpiar el rotarod con agua y jabón para eliminar toda la materia fecal de la máquina.
   12. Limpiar la placa base con etanol al 70%. Rocíe toda la máquina con dióxido de cloro para desinfectar.
   13. En días - 4, - 3, - 2, y - 1 pi, pre-establecer el rotarod con los parámetros del protocolo de entrenamiento apropiadas, tal como se describe en la Tabla 1, y repita los pasos 2.1.2 a 2.1.12.
   14. Después de obtener las medidas de referencia, infectar a los ratones con TMEV. Permitir un período de recuperación pi a 6 días.

Protocolo	Día de la prueba	Frecuencia	Velocidad de arranque (rpm)	MaxVelocidad (rpm)	Aceleración	ensayos	ITI
					(rpm / sec)	(N x seg)	(min)
Formación	- 5 dpi	1 día	1	12	01/03	3x240 seg	3
	- 4 ppp	1 día	1	13	01/03	3x240 seg	3
	- 3 dpi	1 día	1	14	01/03	3x240 seg	3
	- 2; - 1 ppp	1 día	5	40	01/03	3x240 seg	3
Experimental	Entre +7 +50 dpi	2 semanas	5	40	05/30	3x240 seg	3
	De 51 a 150 dpi	1 semana	5	40	05/30	3x240 seg	3

Tabla 1: Parámetros rodillo giratorio en la formación y protocolos experimentales.

2. El protocolo experimental de Rotarod
   1. En 7 dpi, pre-establecer el rotarod con los parámetros de protocolo experimentales apropiados, como se describe en la Tabla 1. Repetir los pasos 2.1.2 a 2.1.10.
   2. Al final de la prueba # 3, se pesa cada ratón y hacer una nota del peso corporal en la hoja de datos. Limpiar y desinfectar el rotarod según los pasos 2.1.11 y 2.1.12.
   3. Prueba de los ratones dos veces a la semana para las 6 semanas siguientes, tal como se describe anteriormente. Después de 6 semanas (en el que los ratones propensos han llegado a una fase de meseta) ^8,9, prueba los ratones una vez a la semana con el mismo Experimental protocolo. El protocolo de prueba real tiene una duración media de 150 días, dependiendo de la evolución de la enfermedad específica.
3. Índice funcional neurológica
   1. Exportar los datos en bruto en un archivo de hoja de cálculo y analizar los resultados.
   2. Data Express como correr del tiempo (Figura 3A): este es el tiempo de funcionamiento normal más el tiempo de rotación pasiva menos el tiempo de retardo de rotación (tabla 2) ^10. Calcular el tiempo de funcionamiento media de los tres ensayos por día.
   3. Expresar los datos como un índice funcional neurológica (NFI; Figura 3B).
      1. Calcular el umbral de rendimiento de línea de base de cada ratón individual. El umbral de rendimiento de referencia se determina como la media de todos los tiempos de funcionamiento de día + 15 a + 45 pi ^6,7.
      2. Calcular la NFI como la media de los tres tiempos de funcionamiento promedio más recientes dividida por el umbral de rendimiento de línea de base de que ^6,7 de ratón específico ^</ Sup>.
         NOTA: Si los tiempos de funcionamiento probado para un ratón en el día +72, +76 y + 79 pi son 55 seg, 45 seg, y 50 segundos, y el tiempo de la línea de base para el mismo ratón fue de 135 segundos, el NFI para ese ratón en 79 dpi será [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 o 0,37.
   4. Expresar los datos como un NFI ajustado (adjNFI; Figura 3C): ajustar los datos de artículos no alimentarios por un valor de la población para el único experimento.
      1. Calcular la adjNFI dividiendo el valor NFI por el promedio NFI obtenido por el grupo tratado de referencia en ese día específico.

Término	Definición
tiempo de funcionamiento normal	El tiempo total que el ratón gasta en ejecución activa en la barra giratoria, es decir, la latencia se caiga.
tiempo de rotación pasiva	La Amontaje de tiempo que el ratón se ha mantenido en la varilla en el modo de rotación pasiva.
tiempo de retardo de rotación	La cantidad de tiempo que el ratón permanece en la varilla durante el modo de rotación pasiva
modo de rotación pasiva	Cuando el ratón agarra la varilla y gira sin tener que deambular.
El tiempo total de la sesión	La cantidad total de tiempo que el ratón permanece en la barra giratoria durante la sesión.
el rendimiento de referencia	Pre-daños rendimiento del motor evaluado para determinar el umbral mínimo de rendimiento.
índice de la función neurológica (NFI)	Índice clínico, que compara cada ratón el rendimiento del motor, es decir, el tiempo de funcionamiento, en cualquier momento para su máximo rendimiento.
índice de la función neurológica ajustado (adjNFI)	Cuando se aplica un proceso de normalización para ajustar los datos NFI por un valor de la población parael experimento sencillo.
valor de la población	NFI valor medio obtenido por el grupo de tratamiento simulado-tratado en un día específico.

Tabla 2: Definición de los parámetros adoptados para cuantificar el cilindro giratorio Neurológica deterioro.

Resultados

El objetivo de este experimento representativo fue comparar la discapacidad neurológica inducida por la cepa Daniels (DA) y la tensión de la haba de TMEV. Para los propósitos del presente estudio, un grupo de 32 ratones SJL hembra fueron infectados por vía intracraneal con TMEV, ya sea la cepa DA (n = 16) o de la cepa de frijol (n = 16), y sus signos clínicos se monitorizaron con el tiempo. Un grupo adicional de 20 ratones se aplicó el tratamiento simulado (es decir, soluc...

Discusión

A pesar de algunas limitaciones, la prueba de rendimiento de Rotarod representa una herramienta importante para la evaluación de la función motora y disfunción en TMEV-IDD, así como el efecto de las intervenciones farmacológicas en la progresión de la discapacidad en los ratones.

La prueba de Rotarod fue descrita por primera vez en 1957 como una herramienta para medir los déficits neurológicos en los roedores ^11. Los roedores tienen que caminar sobre una barra giratoria, a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M