Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

Resumo

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Resumo

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introdução

de Theiler murinos Vírus da Encefalomielite (TMEV) é um vírus de ARN de cadeia simples que neurotrópico persistentemente infecta o sistema nervoso central de murino (SNC). Em ratinhos susceptíveis, a infecção com TMEV provoca, uma doença desmielinizante imunomediada-progressiva crónica, conhecida como doença desmielinizante induzida por TMEV (TMEV-DDI). A infecção experimental de ratinhos leva um curso da doença que se assemelha observada em formas progressivas de esclerose múltipla (EM). TMEV-DID é caracterizada por duas fases distintas: a fase aguda e a fase crónica. A fase aguda é, normalmente um ^1,2 encefalite subclínica leve. A segunda fase, crónica, começando cerca de um mês após a infecção, é composto por uma deficiência lentamente progressiva caracterizada por desmielinização, inflamação e axonal ^1,2 danos. A fraqueza observada em ratos está associada a espasticidade e, ocasionalmente, graves espasmos tônico.

Porque há atualmente nenhuma medications para melhorar a incapacidade progressiva em pacientes, os investigadores estão particularmente atraídos por TMEV-IDD, o que representa um modelo animal ideal para o acompanhamento do impacto das drogas modificadoras da doença na progressão da doença. No entanto, em ratinhos, bem como em pacientes com esclerose múltipla, a monitorização da progressão da incapacidade requer uma observação clínica contínua ao longo de períodos de tempo prolongados. Em camundongos, monitorização a longo prazo para a progressão de incapacidade pode ser realizado com o teste de desempenho rotarod.

O teste de desempenho Rotarod é um teste comportamental padrão que avalia funções associadas ao motor, como coordenação, equilíbrio e fadiga em roedores. Os ratos têm a manter o equilíbrio em uma haste de giro, que é rotativa em aceleração contínua; latência do tempo de queda a partir dessa haste é gravado. Os animais com disfunção neurológica é incapaz de permanecer na haste rotativa desde que controles, e eles normalmente caem quando a velocidade de rotação é superior à suacapacidade motora. O comprometimento mais neurológica os animais têm, quanto mais cedo eles cair a vara, e quanto menor a latência é o tempo.

A vantagem do teste de rotarod ao longo dos sistemas de pontuação visuais tradicionais é que ele gera um objetivo, mensurável variável o tempo de latência que pode finalmente ser utilizada para análises estatísticas para quantificar os efeitos das terapias e procedimentos experimentais ^3.

No Laboratório de Neuroimunologia (LONI) em Dartmouth, os ratos são submetidos a um protocolo de adaptação, onde são testados antes da infecção TMEV, a fim de familiarizá-los com a máquina e para avaliar a sua "base" a coordenação normal de equilíbrio e controle motor ^{4, 5.} Uma vez que a linha de base é estabelecida e os ratinhos são infectados com TMEV, eles são testados uma vez ou duas vezes por semana ao longo de um período de vários meses. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, permitindo assim uma avaliação dao declínio do equilíbrio, coordenação e controle motor durante todo o curso da doença desmielinizante.

Várias centenas de TMEV-DDI e tratados de forma simulada os ratos foram testados até agora para disfunção neurológica em Dartmouth. Estes ratinhos tinham recebido vários imunomoduladores, mas nenhum agente farmacológico foi encontrado para ser eficaz no melhoramento da progressão da incapacidade ^6,7. O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem como caracterizar o comprometimento neurológico progressivo apresentado por ratos TMEV-DDI. Em particular, o protocolo oferece recomendações de parâmetros de teste específicos acredita-se ser geralmente adequados para estudar incapacidade neurológica em ratinhos TMEV-DID utilizando o teste de rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar (1) a relevância deste modelo de rato para progressiva MS e (2) a sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, tais como MS. Claramente, oteste de desempenho Rotarod e a corrente de protocolo de parâmetros e de teste optimizados não só são úteis na detecção de incapacidade neurológica progressiva no modelo de ratinho TMEV-DID, mas são também úteis na detecção de deficiências em outros modelos de ratinho genética induzida por vírus e / ou de doenças neurodegenerativas.

Protocolo

Todo o trabalho de animais utiliza protocolos revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Geisel Faculdade de Medicina de Dartmouth.

1. O Modelo rato

1. A indução da doença desmielinizante TMEV Induzida
   1. Mover as gaiolas contendo SJL feminina ratos de 4 a 6 semanas de idade / jhan do rack para um espaço de trabalho confortável. Marque a ratos (por exemplo, com uma etiqueta de orelha ou punção da orelha) para permitir a avaliação individual de doença clínica e histológica.
   2. Desenhar 30 ul de estoque TMEV infectando (unidades formadoras de 2 x 10 ⁶ de placa; UFP) em PBS para uma seringa de insulina 29-gauge e agulha.
   3. Prepare a máquina de gás de anestesia: verificar o sistema para garantir a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano para a duração do procedimento.
   4. Ligar o medidor de fluxo de 1 L / min. Colocar o animal na câmara de indução e selar o topo. Ligue o vaporizer para 3,5% e monitorar o animal até reclinada.
   5. Remover o animal da câmara e testar o mouse por beliscar a pata para assegurar a anestesia adequada. A falta de resposta a um beliscão forte indica anestesia adequada.
   6. Limpar o local de injecção com álcool isopropílico a 70%.
   7. Injectar 30 ul de estoque infectar TMEV no hemisfério cerebral direito por injecção à mão livre (Figura 1). O local da injecção é de aproximadamente meio caminho entre a linha do olho e da orelha e apenas fora da linha média.
   8. Devolver o mouse para sua gaiola de retenção, uma vez totalmente alerta e móveis (geralmente 3-5 min).
   9. Eutanásia ratinhos por sangria ou perfusão cardíaca 3 a 6 meses após a infecção TMEV, dependendo da rapidez de desenvolvimento da doença.

2. Análise Rotarod

1. O Aparelho Rotarod
   1. ratinhos de teste antes da infecção TMEV a familiarizarem-se com omáquina e para avaliar o seu comando normal coordenação equilíbrio linha de base e motor.
   2. Iniciar o protocolo de adaptação nos dias -5 infecção pós (dpi, ou seja, 5 dias antes da infecção TMEV).
   3. Permitir que os ratinhos se adapte à sala de teste durante pelo menos 30 min antes do teste de rotarod, a fim de lhes permitir adaptar ao ambiente.
   4. Certifique-se de que tanto a fonte Rotarod eo computador estão ligados e conectados entre si (Figura 2).
   5. Pré-definir o rotarod com as -5 dpi parâmetros do protocolo de treinamento, conforme descrito na Tabela 1.
   6. Salve o arquivo de trabalho com as informações de data e identificação.
   7. Mover a gaiola contendo o time a ser testada a partir do rack para uma mesa ao lado do rotarod. Ratos são geralmente testados em esquadrões de 4.
   8. Pegar um rato pela cauda e colocá-lo sobre a haste, de costas para o operador. Repita o procedimento para o segundo através da quarta mouse. Se um rato falls ou saltos, colocá-lo de volta em sua pista sobre o rotarod até que todos os ratos estão em posição. Ignorar se quaisquer camundongos virar-se para enfrentar o operador.
   9. Depois de colocar todos os ratos, pressione o botão "Enter" para iniciar o experimento. Observe os temporizadores são iniciados automaticamente e as rotações por minuto (rpm) em exposição para cada pista.
      1. Como cada animal cai da haste, registar a velocidade da haste no momento da queda, bem como a duração do tempo que o animal permaneceu sobre a haste. A haste vai continuar a rodar até que o último animal caiu do conjunto da haste.
   10. Depois de todos os ratinhos tenham caído, usar um lenço de papel para remover qualquer boli fecais e de urina a partir da haste. A presença de urina e material fecal podem afectar a capacidade dos ratinhos para agarrar a haste.
       1. Depois de um descanso de 3 min, dar os ratos um segundo e depois um terceiro ensaio. O tempo máximo por único ensaio é de 240 segundos. Administrar um total de 3 ensaios durante cada dia de teste.
   11. Devolver os ratos para sua gaiola e devolvê-los de volta para o rack. No final da sessão experimental, limpar o Rotarod com sabão e água, para remover toda a matéria fecal para fora da máquina.
   12. Limpe a placa de base com etanol 70%. Spray para baixo toda a máquina com dióxido de cloro para desinfectar.
   13. No dia - 4, - 3, - 2, e - uma pi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo de formação adequadas, como descrito na Tabela 1, e repetir os passos 2.1.2 a 2.1.12.
   14. Após a obtenção das medidas de linha de base, infectar os ratinhos com TMEV. Permitir um período de recuperação pi 6 dias.

Protocolo	Dia Testing	Freqüência	Velocidade de partida (rpm)	MaxSpeed ​​(rpm)	Aceleração	Ensaios	ITI
					(rpm / seg)	(N x seg)	(min)
Treinamento	- 5 dpi	1 dia	1	12	01/03	3x240 sec	3
	- 4 dpi	1 dia	1	13	01/03	3x240 sec	3
	- 3 dpi	1 dia	1	14	01/03	3x240 sec	3
	- 2; - 1 dpi	1 dia	5	40	01/03	3x240 sec	3
Experimental	De 7-50 dpi	2 / semana	5	40	30/5	3x240 sec	3
	De 51-150 dpi	1 / Semana	5	40	30/5	3x240 sec	3

Tabela 1: Parâmetros rotarod em treinamento e protocolos experimentais.

2. O protocolo experimental Rotarod
   1. Em 7 dpi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo experimentais adequadas, como descrito na Tabela 1. Repita os passos 2.1.2 a 2.1.10.
   2. No final do julgamento # 3, pesar cada rato e fazer uma nota do peso do corpo na folha de dados. Limpar e desinfectar o rotarod como por etapas 2.1.11 e 2.1.12.
   3. Testar os ratinhos duas vezes por semana durante as 6 semanas seguintes, como descrito acima. Após 6 semanas (em que os ratos propensos atingiram uma fase de planalto) ^8,9, teste a ratos uma vez por semana com o mesmo experimental protocolo. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, dependendo do curso da doença específica.
3. Índice Funcional neurológica
   1. Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha e analisar os resultados.
   2. Dados expressos como tempo de execução (Figura 3A): este é o tempo de execução normal mais o tempo de rotação passiva menos o tempo de atraso de rotação (Tabela 2) ^10. Calcula-se a média de tempo de execução os três ensaios por dia.
   3. Expressar os dados como um índice funcional neurológica (IFN; Figura 3B).
      1. Calcule o limite de desempenho de linha de base de cada rato individual. O limiar de desempenho da linha de base é determinada como a média de todos os tempos de execução de dias + 15 e + 45 pi ^6,7.
      2. Calcula-se a IFN-se a média dos três tempos de execução médios mais recentes dividido pelo limiar de ^6,7 de ratinho específico que o desempenho da linha de base ^</ Sup>.
         NOTA: Se a tempos de execução testado para um rato no dia + 72, + 76 e + 79 pi são 55 seg, 45 seg e 50 seg, eo tempo de linha de base para o mesmo rato foi de 135 segundos, o NFI para esse rato no 79 dpi será [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 ou 0,37.
   4. Expressar os dados como um NFI ajustado (adjNFI; Figura 3C): ajustar os dados NFI por um valor de população para o único experimento.
      1. Calcula-se a adjNFI pela divisão do valor da média IFN por IFN obtidos pelo grupo tratado com sham naquele dia específico.

Prazo	Definição
tempo de funcionamento normal	O tempo total que o rato gasta funcionando ativamente sobre a haste rotativa, ou seja, a latência a cair.
tempo de rotação passiva	a ummontagem de tempo que o rato tem-se mantido na haste no modo de rotação passiva.
tempo de atraso Rotação	A quantidade de tempo que o rato permanece na vara durante o modo de rotação passiva
modo de rotação passiva	Quando o rato agarra a vara e roda sem ter de deambular.
O tempo total da sessão	A quantidade total de tempo que o rato permanece na haste rotativa durante a sessão.
desempenho da linha de base	desempenho motor pré-danos avaliados para determinar o limite mínimo de desempenho.
Índice função neurológica (NFI)	Índice clínico, o que compara cada desempenho motor do mouse, ou seja, tempo de execução, a qualquer momento para seu desempenho máximo.
Ajustado Índice de função neurológica (adjNFI)	Quando um processo de normalização é aplicado para ajustar os dados IFN por um valor da população paraa única experiência.
valor da população	valor médio IFN obtidos pelo grupo submetida a tratamento simulado a um dia específico.

Tabela 2: Definições de rotarod parâmetros adotados para quantificar Neurological Impairment.

Resultados

O objectivo desta experiência representativa foi comparar a incapacidade neurológica induzida pela estirpe Daniels (DA) e tensão de feijão de TMEV. Para efeitos do presente estudo, um grupo de 32 ratinhos fêmea SJL foram infectados por via intracraniana com TMEV, quer da estirpe DA (n = 16) ou a estirpe de feijão (n = 16), e os seus sinais clínicos foram monitorizados ao longo do tempo. Um grupo adicional de 20 ratos foi tratado simulada (ou seja, solução salina foi inj...

Discussão

Despite some limitations, the Rotarod performance test represents an important tool for assessing motor function and dysfunction in TMEV-IDD as well as the effect of pharmacological interventions on disability progression in mice.

The Rotarod test was first described in 1957 as a tool for measuring neurological deficits in rodents¹¹. Rodents have to walk on a rotating rod, with increasing rotating speed, and try to avoid falling to the ground. The latency to fall is recorded and use...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M