Misurare Progressive neurologico disabilità in un modello murino di sclerosi multipla

Riepilogo

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Abstract

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introduzione

di Theiler murini Encefalomielite Virus (TMEV) è un virus a RNA a singolo filamento neurotropo che infetta con insistenza il murino sistema nervoso centrale (SNC). Nei topi suscettibili, l'infezione da TMEV provoca una malattia demielinizzante cronica progressiva immuno-mediata, nota come malattia demielinizzante TMEV-indotta (TMEV-IDD). infezione sperimentale di topi prende un decorso della malattia simile a quello visto in forme progressive di sclerosi multipla (SM). TMEV-IDD è caratterizzato da due fasi distinte: la fase acuta e la fase cronica. La fase acuta è un mite, di solito subclinico ^1,2 encefalite. La seconda fase, cronica, a partire circa un mese dopo l'infezione, è costituito da una disabilità lenta progressione caratterizzata da demielinizzazione, infiammazione, e assonale ^1,2 danni. La debolezza osservata nei topi è associata con spasticità e, occasionalmente, gravi spasmi tonici.

Perché ci sono attualmente medications a migliorare la progressiva disabilità nei pazienti, i ricercatori sono particolarmente attratti da TMEV-IDD, che rappresenta un modello animale ottimale per monitorare l'impatto dei farmaci modificanti la malattia sulla progressione della malattia. Tuttavia, nei topi come pure in pazienti con SM, il monitoraggio della progressione della disabilità richiede una continua osservazione clinica per periodi di tempo prolungati. Nei topi, il monitoraggio a lungo termine per la progressione della disabilità può essere realizzato con il test delle prestazioni rotarod.

Il test di prestazione rotarod è un test comportamentale standard che valuta le funzioni motorie associate come la coordinazione, equilibrio, e la fatica nei roditori. I topi devono mantenere l'equilibrio su un'asta tornitura, che ruota in accelerazione continua; il tempo di latenza per caduta da questa canna viene registrato. Gli animali con disfunzione neurologica sono in grado di rimanere sulla bacchetta di rotazione finché controlli, e normalmente scendere quando la velocità di rotazione è superiore a loropotenza del motore. L'impairment più neurologica gli animali hanno, prima che cadere l'asta, e più breve è il tempo di latenza è.

Il vantaggio del test rotarod oltre ai tradizionali sistemi di punteggio visivi è che genera un obiettivo, misurabile variabile il tempo di latenza-, che in ultima analisi può essere utilizzato per le analisi statistiche per quantificare gli effetti delle terapie e delle procedure sperimentali ^3.

Nel Laboratorio di Neuroimmunologia (LONI) a Dartmouth, i topi sono sottoposti a un protocollo di adattamento, dove vengono testati prima di infezione TMEV al fine di familiarizzare con la macchina e valutare il loro normale coordinazione equilibrio "di base" e di controllo del motore ^{4, 5.} Una volta che la linea di base viene stabilita ei topi sono infettati con TMEV, vengono testati una o due volte alla settimana per un periodo di diversi mesi. Il protocollo di prova reale dura mediamente 150 giorni, permettendo così una valutazioneil declino di equilibrio, la coordinazione e il controllo motorio durante l'intero corso della malattia demielinizzante.

Diverse centinaia di TMEV-IDD e sham trattati topi sono stati testati finora per disfunzione neurologica a Dartmouth. Questi topi avevano ricevuto diversi trattamenti immunomodulanti, ma nessun agente farmacologico è stato trovato per essere efficace nel migliorare la progressione della disabilità ^6,7. Il presente articolo ed il protocollo relativi descrivono come caratterizzare il danno neurologico progressivo mostrata dai topi TMEV-IDD. In particolare, il protocollo offre raccomandazioni dei parametri di prova specifici ritenuti generalmente adatto per studiare la disabilità neurologica nei topi TMEV-IDD utilizzando il test rotarod. Questa procedura prevede una linea di base rispetto al quale valutare (1) la rilevanza di questo modello murino di sclerosi multipla progressiva e (2) la sua utilità per testare terapie volte a trattamento di condizioni neurologiche progressive come MS. Chiaramente, latest delle prestazioni rotarod e l'attuale protocollo di parametri di prova ottimizzati e non sono solo utili a rilevare la disabilità neurologica progressiva nel modello murino TMEV-IDD, ma sono anche utili per scoprire i danni in altri modelli di virus-indotta e / o del mouse genetica di malattie neurodegenerative.

Protocollo

Tutti i lavori animale utilizza protocolli esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) a Geisel School of Medicine a Dartmouth.

1. Il modello murino

1. L'induzione di malattia demielinizzante TMEV indotta
   1. Spostare le gabbie contenenti da 4 a 6 settimane di età femminile SJL / jhan topi dal rack ad uno spazio di lavoro confortevole. Segnare la topi (ad esempio, con un marchio auricolare o pugno all'orecchio) per consentire una valutazione individuale di malattia clinica ed istologica.
   2. Disegnare 30 microlitri di TMEV magazzino infettare (unità formanti 2 x 10 ⁶ placca; PFU) in PBS in una siringa da insulina 29-gauge e ago.
   3. Preparare la macchina di gas per anestesia: controllare il sistema per garantire la presenza di una quantità adeguata di ossigeno e isoflurano per la durata della procedura.
   4. Accendere il misuratore di flusso a 1 L / min. Posto l'animale nella camera di induzione e sigillare la parte superiore. Accendere il vaporizer al 3,5% e monitorare l'animale fino reclinata.
   5. Rimuovere l'animale dalla camera e testare il mouse pizzicando la zampa per garantire un'adeguata anestesia. La mancanza di risposta ad una forte presa indica un'anestesia adeguata.
   6. Pulire il sito di iniezione con il 70% di alcol isopropilico.
   7. Iniettare 30 ml di TMEV infettare magazzino nell'emisfero cerebrale destro per iniezione a mano libera (Figura 1). Il sito di iniezione è di circa a metà strada tra la linea dell'occhio e dell'orecchio e appena fuori dalla linea mediana.
   8. Ritorna il mouse per sua gabbia partecipazione una volta pienamente vigile e mobile (di solito 3 - 5 minuti).
   9. Euthanize topi dal dissanguamento o perfusione cardiaca 3 a 6 mesi dopo l'infezione TMEV, a seconda della rapidità di sviluppo della malattia.

2. Analisi rotarod

1. L'Apparato rotarod
   1. topi di prova prima di infezione TMEV loro familiarità con ilmacchina e per valutare il loro normale equilibrio coordinamento controllo della linea di base e il motore.
   2. Avviare il protocollo di adattamento nei giorni -5 infezioni post (dpi, cioè 5 giorni prima dell'infezione TMEV).
   3. Lasciare i topi si adatti alla sala prove per almeno 30 minuti prima rotarod test, al fine di consentire loro di adeguarsi all'ambiente.
   4. Assicurarsi che sia l'unità rotarod e il computer siano collegati e collegati tra loro (figura 2).
   5. Pre-impostare il rotarod con i DPI parametri del protocollo di formazione -5, come descritto nella tabella 1.
   6. Salvare il file di lavoro con le informazioni sulla data e l'identificazione.
   7. Spostare la gabbia contenente la squadra da testare dal rack ad un tavolo adiacente alla rotarod. I topi di solito sono testati in squadre di 4.
   8. Raccogliere un topo per la coda e posizionarlo sull'asta, rivolta verso l'operatore. Ripetere per la seconda attraverso il quarto mouse. Se un fal del mousels o salti, riposizionarlo nella sua corsia sulla rotarod fino a quando tutti i topi sono in posizione. Ignora se eventuali topi girano intorno ad affrontare l'operatore.
   9. Dopo aver caricato tutti i topi, premere il tasto "Enter" per avviare l'esperimento. Osservare i temporizzatori avviati automaticamente e le rotazioni al minuto (rpm) in mostra per ogni corsia.
      1. Come ogni animale cade dalla canna, registrare la velocità dell'asta al momento della caduta, così come la durata di tempo l'animale è rimasto sull'asta. L'asta continua a ruotare fino all'ultimo animale è caduto dal gruppo dell'asta.
   10. Dopo che tutti i topi sono caduti, usare un tessuto per rimuovere eventuali boli fecali e urine dalla barra. La presenza di urina e materiale fecale può influenzare la capacità dei topi per afferrare l'asta.
       1. Dopo un periodo di riposo di 3 min, invia i topi un secondo e poi un terzo processo. Il tempo massimo per ogni singola prova è di 240 sec. Somministrare un totale di 3 prove durante ogni giornata di test.
   11. Riportare i topi alla loro gabbia a casa e tornare indietro al rack. Alla fine della sessione sperimentale, pulire rotarod con acqua e sapone per rimuovere tutta la materia fecale dalla macchina.
   12. Pulire la piastra di base con etanolo al 70%. Spray giù l'intera macchina con biossido di cloro per disinfettare.
   13. Nei giorni - 4, 3 -, - 2, e - 1 PI, pre-impostare il rotarod con i parametri del protocollo di formazione adeguati, come descritto nella tabella 1, e ripetere i passaggi 2.1.2 alla 2.1.12.
   14. Dopo aver ottenuto le misure di base, di infettare i topi con TMEV. Consentire un periodo di recupero pi di 6 giorni.

Protocollo	test Day	Frequenza	Velocità iniziale (rpm)	MaxVelocità (rpm)	Accelerazione	trials	ITI
					(rpm / sec)	(N x sec)	(min)
Formazione	- 5 DPI	1 giorno	1	12	01/03	3x240 sec	3
	- 4 dpi	1 giorno	1	13	01/03	3x240 sec	3
	- 3 DPI	1 giorno	1	14	01/03	3x240 sec	3
	- 2; - 1 DPI	1 giorno	5	40	01/03	3x240 sec	3
Sperimentale	Dal 7-50 dpi	2 settimane	5	40	30/05	3x240 sec	3
	Da 51-150 dpi	1 settimana	5	40	30/05	3x240 sec	3

Tabella 1: rotarod Parametri nella formazione e protocolli sperimentali.

2. Il protocollo sperimentale rotarod
   1. Sul +7 dpi, pre-impostare il rotarod con gli appropriati parametri del protocollo sperimentale, come descritto nella tabella 1. Ripetere i punti 2.1.2 a 2.1.10.
   2. Alla fine del processo # 3, pesare ogni mouse e prendere nota del peso corporeo sulla scheda tecnica. Pulire e disinfettare il rotarod come da passi 2.1.11 e 2.1.12.
   3. Testare i topi due volte alla settimana in 6 settimane, come descritto sopra. Dopo 6 settimane (in cui i topi hanno probabilmente raggiunto una fase di plateau) ^8,9, testare i topi una volta alla settimana con la stessa Experimental protocollo. Il protocollo di prova reale dura mediamente 150 giorni, a seconda del corso specifica malattia.
3. Indice funzionale neurologico
   1. Esportare i dati grezzi in un file di foglio di calcolo e analizzare i risultati.
   2. Dati Express come tempo di funzionamento (Figura 3A): questo è il tempo di esecuzione normale, più il tempo di rotazione passivo meno il tempo di ritardo di rotazione (tabella 2) ^10. Calcolare il tempo medio di esecuzione delle tre prove al giorno.
   3. Esprimere i dati come un indice neurologica funzionale (NFI; Figura 3B).
      1. Calcolare la soglia prestazioni di base di ogni singolo mouse. La soglia di prestazioni di base è determinato come la media di tutti i tempi che vanno rispettivamente dal + 15 a + 45 pi ^6,7.
      2. Calcolare il NFI come la media dei tre più recenti tempi medi di esercizio diviso per la soglia di prestazioni di base di quel ^6,7 specifica del mouse ^</ Sup>.
         NOTA: Se i tempi di esecuzione testato per un mouse sul giorno + 72, + 76 e + 79 pi sono 55 sec, 45 sec, 50 sec, e il tempo di riferimento per lo stesso topo era 135 sec, la NFI per quel mouse su 79 dpi sarà [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 o 0,37.
   4. Esprimere i dati come una regolata NFI (adjNFI; Figura 3C): regolare i dati NFI da un valore della popolazione per il singolo esperimento.
      1. Calcolare il adjNFI dividendo il valore NFI dalla media NFI ottenuto dal gruppo sham trattati in quel giorno specifico.

Termine	Definizione
tempo di esecuzione normale	Il tempo totale mouse spende attivamente esecuzione sulla bacchetta di rotazione, cioè, la latenza cadere.
tempo di rotazione passiva	L'amonte volta che il mouse è rimasto sull'asta nella modalità di rotazione passiva.
tempo di ritardo di rotazione	La quantità di tempo che il mouse rimane sull'asta durante la modalità di rotazione passiva
modalità di rotazione passiva	Quando il mouse afferra l'asta e ruota senza dover deambulare.
Durata totale della sessione	Tempo totale mouse rimane sull'asta rotante durante la sessione.
prestazioni di base	Pre-danni prestazioni del motore valutati per determinare la soglia minima delle prestazioni.
indice di funzione neurologica (NFI)	Indice clinico, che confronta ogni prestazioni del motore mouse, cioè, durata, in qualsiasi momento di suo massimo delle prestazioni.
Rettificato indice di funzione neurologica (adjNFI)	Quando viene applicato un processo di normalizzazione per adeguare i dati NFI da un valore di popolazione peril singolo esperimento.
valore della popolazione	Valore medio NFI ottenuto dal gruppo sham trattati in un giorno specifico.

Tabella 2: Definizioni di rotarod parametri adottati per quantificare danno neurologico.

Risultati

Lo scopo di questo esperimento rappresentativo è stato quello di confrontare la disabilità neurologica indotta dal ceppo Daniels (DA) e il fagiolo ceppo di TMEV. Ai fini del presente studio, un gruppo di 32 topi SJL femmina sono stati infettati con intracranially TMEV, sia il ceppo DA (n = 16) o il ceppo BeAn (n = 16), e loro segni clinici sono stati monitorati nel tempo. Un ulteriore gruppo di 20 topi è stata trattata sham (vale a dire, soluzione salina è stato iniettato in...

Discussione

Nonostante alcune limitazioni, il test delle prestazioni rotarod rappresenta uno strumento importante per valutare la funzione motoria e disfunzione in TMEV-IDD, così come l'effetto degli interventi farmacologici sulla progressione della disabilità nei topi.

Il test rotarod è stato descritto nel 1957 come strumento per misurare i deficit neurologici nei roditori ^11. I roditori devono camminare su un'asta rotante, con l'aumento della velocità di rotazione, e cercare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M