在多发性硬化症的小鼠模型测量进行性神经功能残疾

摘要

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

摘要

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

引言

Theiler鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）是一种嗜神经单链RNA病毒持续感染的鼠的中枢神经系统（CNS）。在易感小鼠中，感染TMEV导致免疫介导的慢性进行性脱髓鞘疾病，称为TMEV诱导脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）。小鼠的实验性感染发生的疾病过程类似，在多发性硬化症（MS）的渐进形式看到。 TMEV-IDD的特征在于两个不同的阶段:急性期和慢性期。急性期是一种温和的，通常亚临床性脑炎^1,2。第二，慢性期，开始约一个月感染后，由一个缓慢进展残疾特征在于脱髓鞘，炎症和轴索损害^1,2。在小鼠中观察到的疲软与痉挛，偶尔严重的强直性痉挛有关。

由于目前还没有medicatioNS改善逐步残疾患者，研究人员特别是TMEV，国际直拨电话，它代表了监测疾病修饰药物对疾病进展的影响，最佳的动物模型所吸引。然而，在小鼠中，以及在MS患者，残疾进展的监测需要在延长的时间周期的连续的临床观察。在小鼠中，对于残疾进展的长期监测可与旋转杆的性能测试来完成。

在转棒性能测试是一种标准的行为测试，用于评估运动相关的功能，例如协调性，平衡，和疲劳在啮齿类动物。小鼠必须保持平衡的转弯杆，这是在连续加速旋转;落入时间延迟从该杆被记录。与神经功能障碍的动物不能长留在旋转杆作为对照，他们当转速超过正常脱落的电机容量。更多的神经功能缺损动物们，他们越早脱落杆，以及更短的时间延迟。

旋转试验在传统的视觉评分系统的优点在于，它产生一个目标，可测量的可变时间延迟该最终可用于统计分析以量化疗法和实验程序³的效果。

在免疫学（LONI）中的达特茅斯实验室，将小鼠进行的适配协议，在那里它们被TMEV感染前测试，以便与机器使他们熟悉并评估其正常的"基线"平衡协调和电机控制^{4， 5。}一旦基线建立和小鼠被感染TMEV，它们过了一段数月测定一次或每周两次。实际测试协议为期150天的平均值，从而允许进行评估平衡，协调和电机控制的降幅比脱髓鞘疾病的全过程。

几百TMEV，IDD和假治疗的小鼠迄今已测试达特茅斯神经功能障碍。这些小鼠接受了各种免疫调节治疗方法，但没有药剂已发现可有效地改善残疾进展^6,7。本文章及相关协议描述了如何通过定性TMEV-IDD小鼠显示进行性神经损害。特别是，该协议提供的认为是一般适合学习使用旋转试验TMEV-IDD小鼠神经失具体的测试参数的建议。此过程提供对照评估一个基线（1）该小鼠模型来进行性MS和（2）它的实用性，用于测试旨在治疗进行性神经疾病如MS疗法的相关性。显然，转棒性能测试和当前优化测试参数和协议不仅在该TMEV-IDD小鼠模型检测进行性神经障碍是有用的，但是，可以在中神经变性疾病的其他病毒诱导的和/或遗传小鼠模型揭示损伤是有用的。

研究方案

所有的动物利用工作的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在医学盖泽尔学院达特茅斯审查和批准协议。

1.小鼠模型

1. TMEV诱导脱髓鞘疾病的诱导
   1. 移动包含从机架4-6周龄的雌性SJL / JHan小鼠舒适的工作空间中的笼中。标记小鼠（ 例如，用耳标或耳冲），以允许临床和组织学疾病的个体的评价。
   2. 绘制30微升TMEV感染库存（2×10 ⁶噬斑形成单位; PFU）的在PBS中成29隔距胰岛素注射器和针头。
   3. 准备麻醉气体机:检查系统，以保证足量的氧气和异氟烷的过程期间存在。
   4. 打开流量计1升/分钟。放置动物进入吸气室和密封的顶部。打开VAporizer至3.5％和监视动物直到横卧。
   5. 从室取出的动物，捏住脚垫，保证足够的麻醉测试鼠标。缺乏应对强大的捏表示充分麻醉。
   6. 清洁注射部位用70％的异丙醇。
   7. 注入30微升TMEV感染股票的成徒手注射（ 图1）的右大脑半球。注射的部位是眼睛和耳朵线之间，只是离中线大约一半。
   8. 返回鼠标其控股笼一次高度警惕和移动（通常为3 - 5分钟）。
   9. 安乐死通过放血或心脏灌注小鼠TMEV感染后3至6个月，这取决于疾病的发展的速度。

2.转棒分析

1. 该转棒仪
   1. 之前TMEV感染小鼠的试验与以他们熟悉机，并评估其正常基线平衡协调和电机控制。
   2. 开始在5日的适配协议感染后（DPI， 即 TMEV感染前5天）。
   3. 允许小鼠适应到测试室转棒至少30分钟前的测试，以便使它们能够适应环境。
   4. 确保两个旋转杆单元和计算机已经插入并彼此连接（ 图2）。
   5. 预先设定的旋转杆与-5 dpi的训练协议参数，如表1所述。
   6. 保存日期和标识信息的工作文件。
   7. 移动包含小队要从机架测试邻近于旋转杆的表笼。小鼠通常在4小队进行测试。
   8. 由尾拿起小鼠，并将其放置在杆，面向远离操作者。重复到第四鼠标的第二位。如果鼠标FALLS或跳转，将它放回到它的旋转杆车道，直到所有的小鼠在适当的位置。如果忽略任何老鼠转身面对运营商。
   9. 加载所有的老鼠后，按"Enter"键开始实验。观察计时器自动启动，每展出每条车道分钟（RPM）的旋转。
      1. 由于每个动物从杆下降时，记录在秋天时的杆的速度，以及时间的持续时间的动物保持在杆上。该杆将继续转动，直到最后动物已经从杆组件下降。
   10. 之后所有的老鼠都下降了，用纸巾从杆删除任何粪便勃利和尿液。尿液和粪便材料的存在可能会影响小鼠握棒的能力。
       1. 3分钟休息后，给小鼠第二次，然后第三个审判。每个单次试验的最大时间为240秒。在每个测试日辖共3项试验。
   11. 返回老鼠的笼子，并返回他们回到机架中。在实验期结束时，清洗旋转杆用肥皂和水去除所有排泄物关了机。
   12. 用干净的乙醇70％的底板。喷洒下来整机用二氧化氯消毒。
   13. 天- 4 - 3， - 2，和- 1圆周率，预先设定的旋转杆与相应的训练协议参数，如表1所述，并重复步骤2.1.2至2.1.12。
   14. 获得基线措施后，感染与TMEV老鼠。允许6天PI恢复期。

协议	测试日	频率	起动转速（rpm）	马克斯转速（rpm）	促进	试验	ITI
					（转/秒）	为（N×秒）	（分钟）
训练	- 5 DPI	1天	1	12	01/03	3x240秒	3
	- 4 DPI	1天	1	13	01/03	3x240秒	3
	- 3 DPI	1天	1	14	01/03	3x240秒	3
	- 2; - 1 DPI	1天	五	40	01/03	3x240秒	3
试验	从+7至+50 DPI	2 /周	五	40	05/30	3x240秒	3
	从+51到+150 DPI	1周	五	40	05/30	3x240秒	3

表1:转棒参数培训与实验方案。

2. 该转棒实验协议
   1. +7 dpi的，预先设定的旋转杆与相应的实验协议参数，如表中所述1。重复步骤2.1.2至2.1.10。
   2. 在审判＃3月底，权衡每个鼠标和记体重的数据表上。清洁和消毒旋转杆按步骤2.1.11和2.1.12。
   3. 测试小鼠每周两次对下列6周，如上所述。 6周每周一次使用相同experimenta（其中小鼠可能已经达到了一个平台期^）8,9，测试小鼠后l协议。实际测试协议持续150天的平均值，这取决于具体的疾病过程。
3. 神经功能指数
   1. 导出原始数据到电子表格文件，并分析结果。
   2. 如运行时间（ 图3A）Express数据:这是在正常运行时间加上被动旋转时间减去旋转延迟时间（ 表^2）10。计算每日的三次试验的平均运行时间。
   3. 快递数据作为神经功能指数（NFI; 图3B）。
      1. 计算每个鼠标的基准性能门槛。基准性能阈值确定为从天所有的运行时间的平均值±15 + 45圆周^6,7。
      2. 计算NFI为最近的三个平均运行时间由特定的鼠标^6,7的基准性能阈值除以平均值^</ SUP>。
         注意:如果测试运行时间的日+ 72小鼠，+ 76和+ 79圆周率是55秒，45秒和50秒，基线时间为相同的鼠标为135秒时，NFI该鼠标在+79 dpi将是[（45 + 50 + 55）/ 3] / 135或0.37。
   4. 快递数据作为调整NFI（adjNFI; 图3C）:由单一实验中总体值调整NFI数据。
      1. 除以平均NFI由假治疗组在该特定日期获得的NFI值计算adjNFI。

术语	定义
正常运行时间	的总时间的小鼠花费在转动杆主动运行， 即 ，等待时间下降。
被动旋转时间	在一个时间安装鼠标一直在被动旋转模式杆。
旋转延迟时间	被动旋转模式期间的时间的小鼠保持在杆的量
被动旋转模式	当鼠标抓住杆和无需走动旋转。
总会话时间	时间总量鼠标保持在会议期间旋转杆。
基准性能	预损伤电机性能评估，以确定该最低性能阈值。
神经功能指数（NFI）	临床指标，其中每个小鼠电机性能进行比较， 即，运行时间，在任何时候其最佳性能。
调整后的神经功能指数（adjNFI）	当施加正常化过程通过为人口值来调节NFI数据单一的实验。
总体值	在特定的一天假治疗组获得的平均NFI值。

表2:采用量化神经损伤转棒参数的定义。

结果

该代表性实验的目的是比较由丹尼尔斯（DA）菌株和TMEV豆应变诱导的神经学障碍。本研究的目的，一组32例女性SJL小鼠用TMEV感染脑内，无论是DA株（N = 16）或豆株（N = 16），其临床症状随着时间的推移进行了监测。 20只小鼠的另外一个组假处理（ 即生理盐水溶液注入脑内），并担任健康对照组。

在转棒性能试验来评价?...

讨论

尽管有一些限制，所述旋转杆的性能测试代表用于评估TMEV-IDD运动功能和功能障碍，以及药理干预对残疾进展中的小鼠的影响的重要工具。

旋转试验是在1957年首次描述为在啮齿类动物¹¹测量神经功能缺损的工具。鼠害必须走在旋转的杆，随着转速，并尽量避免坠落到地面。落入延迟被记录并用作定量终点运动功能:越神经功能缺损的动物有，越早它们脱落杆。此测试在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M