Mesure progressive neurologique invalidité dans un modèle murin de la sclérose en plaques

Résumé

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Résumé

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

Introduction

Murins encéphalomyélite virus de Theiler (TMEV) est un virus à ARN simple brin neurotrope qui infecte la persistance du système nerveux central murin (CNS). Chez les souris sensibles, l'infection par TMEV provoque, une maladie démyélinisante à médiation immunitaire chronique progressive, connue comme la maladie démyélinisante TMEV induite (TMEV-IDD). L'infection expérimentale de souris prend une évolution de la maladie ressemblant à celle observée dans les formes progressives de la sclérose en plaques (SEP). TMEV-IDD est caractérisée par deux phases distinctes: la phase aiguë et la phase chronique. La phase aiguë est une légère, généralement subclinique encéphalite ^1,2. La deuxième phase, chronique, commençant environ un mois après l' infection, se compose d'un handicap à évolution lente caractérisée par une démyélinisation, l' inflammation et des lésions axonales ^1,2. La faiblesse observée chez les souris est associée à la spasticité et, parfois, des spasmes toniques sévères.

Parce qu'il n'y a pas actuellement medications pour améliorer l'invalidité progressive chez les patients, les chercheurs sont particulièrement attirés par TMEV-IDD, qui représente un modèle animal optimal pour surveiller l'impact des médicaments modificateurs de la maladie sur la progression de la maladie. Cependant, chez la souris, ainsi que chez les patients atteints de sclérose en plaques, la surveillance de la progression de l'invalidité nécessite une observation clinique continue pendant des périodes de temps prolongées. Chez les souris, la surveillance à long terme pour la progression du handicap peut être accompli avec le test de performance Rotarod.

Le test de performance Rotarod est un test de comportement standard qui évalue les fonctions motrices associées telles que la coordination, l'équilibre et la fatigue chez les rongeurs. Les souris doivent garder leur équilibre sur une tige tournante, qui tourne à l'accélération continue; le temps de latence à l'automne de cette tige est enregistrée. Les animaux atteints de troubles neurologiques sont incapables de rester sur la tige de rotation aussi longtemps que les contrôles, et ils tombent normalement quand la vitesse de rotation est supérieure à leurla capacité du moteur. La perte de valeur plus neurologique que les animaux ont, plus vite ils tombent hors de la tige, et plus le temps de latence est.

L'avantage du test Rotarod sur les systèmes traditionnels de notation visuelle est qu'il génère un objectif, mesurable variable le temps de latence, qui peut finalement être utilisée pour des analyses statistiques pour quantifier les effets des thérapies et des procédures expérimentales ^3.

Dans le laboratoire de neuro - immunologie (LONI) à Dartmouth, les souris sont soumises à un protocole d'adaptation, où ils sont testés avant l'infection TMEV afin de les familiariser avec la machine et d'évaluer leur «base» de la coordination de l' équilibre normal et le contrôle moteur ^{4, 5.} Une fois la ligne de base est établie et les souris sont infectées par le TMEV, ils sont testés une fois ou deux fois par semaine sur une période de plusieurs mois. Le protocole de test réel dure en moyenne 150 jours, permettant ainsi une évaluation dele déclin de l'équilibre, la coordination et le contrôle du moteur pendant toute la durée de la maladie démyélinisante.

Plusieurs centaines de TMEV-IDD et faux-souris traitées ont été testées à ce jour pour le dysfonctionnement neurologique à Dartmouth. Ces souris avaient reçu divers traitements immunomodulateurs, mais aucun agent pharmacologique n'a été trouvé pour être efficace dans l' amélioration de la progression du handicap ^6,7. Le présent article et le protocole lié décrivent comment caractériser l'atteinte neurologique progressive affichée par les souris TMEV-IDD. En particulier, le protocole propose des recommandations de paramètres de test spécifiques jugées généralement appropriées pour étudier le handicap neurologique chez les souris TMEV-IDD en utilisant le test Rotarod. Cette procédure fournit une base de référence pour évaluer (1) la pertinence de ce modèle de souris pour la SP progressive et (2) son utilité pour tester les thérapies visant à traiter les maladies neurologiques progressives telles que la sclérose en plaques. De toute évidence, laRotarod test de performance et le protocole des paramètres de test optimisés et en cours ne sont pas seulement utiles à la détection de handicap neurologique progressive dans le modèle de la souris TMEV-IDD, mais sont également utiles dans la découverte de déficiences dans d'autres modèles viro-induits et / ou souris génétique des maladies neurodégénératives.

Protocole

Tous les travaux d'animaux utilise des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à Geisel School of Medicine à Dartmouth.

1. Le modèle de souris

1. L' induction de la maladie démyélinisante induite TMEV
   1. Déplacer les cages contenant 4 à 6 semaines d'âge SJL femelle / Jhan souris du rack à un espace de travail confortable. Marquer la souris (par exemple, avec une étiquette d'oreille ou poinçon) pour permettre une évaluation individuelle de la maladie clinique et histologique.
   2. Dessinez 30 pi de TMEV infectant stock (unités formant 2 x 10 ⁶ de la plaque; PFU) dans du PBS dans un 29-gauge insuline seringue et une aiguille.
   3. Préparer la machine à gaz d'anesthésie: vérifier le système pour assurer la présence de quantités suffisantes d'oxygène et isoflurane pendant toute la durée de la procédure.
   4. Allumez le débitmètre à 1 L / min. Placer l'animal dans la chambre d'aspiration et de sceller la partie supérieure. Allumez le vaporizer à 3,5% et de suivre l'animal jusqu'à recumbent.
   5. Enlever l'animal de la chambre et tester la souris par pincement de la patte pour assurer une anesthésie adéquate. Le manque de réponse à une pincée forte indique une anesthésie adéquate.
   6. Nettoyer le site d'injection avec 70% d'alcool isopropylique.
   7. Injecter 30 ul de TMEV infectant stocks dans l'hémisphère cérébral droit par injection à main levée (figure 1). Le site d'injection est à mi-chemin entre la ligne des yeux et de l'oreille et juste à côté de la ligne médiane.
   8. Retour de la souris dans sa cage de retenue une fois pleinement alerte et mobiles (généralement de 3 - 5 min).
   9. Euthanize souris par exsanguination cardiaque ou une perfusion de 3 à 6 mois après l'infection TMEV, en fonction de la rapidité du développement de la maladie.

2. Rotarod Analyse

1. L'appareil Rotarod
   1. souris d'essai avant l'infection TMEV afin de les familiariser avec lemachine et d'évaluer leur contrôle de la coordination de la balance de base et le moteur normal.
   2. Démarrez le protocole d'adaptation sur les jours -5 après l'infection (dpi, soit 5 jours avant l' infection TMEV).
   3. Laisser les souris s'acclimater à la salle d'essai pendant au moins 30 min avant Rotarod tests, afin de leur permettre d'adapter à l'environnement.
   4. Assurez - vous que l'unité Rotarod et l'ordinateur sont branchés et connectés les uns aux autres (figure 2).
   5. Pré-régler le Rotarod avec les ppp -5 paramètres de protocole de formation, comme décrit dans le tableau 1.
   6. Enregistrez le fichier de travail avec la date et l'identification des informations.
   7. Déplacer la cage contenant l'équipe à tester du rack à une table à côté de la Rotarod. Les souris sont généralement testés dans des escouades de 4.
   8. Ramassez une souris par la queue et le placer sur la tige, opposée à l'opérateur. Répétez l'opération pour la deuxième à la quatrième souris. Si une souris falls ou des sauts, placez-le dans sa voie sur le Rotarod jusqu'à ce que toutes les souris sont en position. Ignorer si des souris se tournent pour faire face à l'opérateur.
   9. Après le chargement de toutes les souris, appuyez sur la touche "Entrée" pour commencer l'expérience. Observer les minuteries démarrent automatiquement et les rotations par minute (rpm) sur l'écran pour chaque voie.
      1. Étant donné que chaque animal tombe de la tige, enregistrer la vitesse de la tige au moment de la chute, ainsi que la durée du temps de l'animal est resté sur la tige. La tige continuera à tourner jusqu'à ce que le dernier animal est tombé de l'ensemble de tige.
   10. Après toutes les souris ont chuté, utiliser un mouchoir pour enlever toute boli fécales et l'urine de la tige. La présence de l'urine et des matières fécales peut affecter la capacité des souris à saisir la tige.
       1. Après un repos de 3 minutes, donner aux souris un second, puis un troisième procès. Le temps maximum par procès unique est de 240 sec. Administrer un total de 3 essais au cours de chaque journée de test.
   11. Retour les souris dans leur cage et les retourner à la crémaillère. A la fin de la session expérimentale, nettoyer le Rotarod avec de l'eau et du savon pour enlever toute la matière fécale de la machine.
   12. Essuyer la plaque de base avec de l'éthanol à 70%. Arroser toute la machine avec du dioxyde de chlore pour désinfecter.
   13. Les jours - 4, - 3, - 2 et - 1 pi, pré-régler le Rotarod avec les paramètres de protocole de formation appropriés, tel que décrit dans le tableau 1, et répétez les étapes 2.1.2 à 2.1.12.
   14. Après avoir obtenu les mesures de base, d'infecter les souris avec TMEV. Prévoyez une période de récupération de pi 6 jours.

Protocole	Journée Test	La fréquence	Vitesse de démarrage (rpm)	MaxVitesse (rpm)	Accélération	Les procès	ITI
					(rpm / sec)	(N x sec)	(min)
Entraînement	- 5 dpi	Un jour	1	12	01/03	3x240 sec	3
	- 4 dpi	Un jour	1	13	01/03	3x240 sec	3
	- 3 dpi	Un jour	1	14	01/03	3x240 sec	3
	- 2; - 1 dpi	Un jour	5	40	01/03	3x240 sec	3
Expérimental	De 7-50 dpi	2 semaines	5	40	05/30	3x240 sec	3
	À partir de 51-150 dpi	1 semaine	5	40	05/30	3x240 sec	3

Tableau 1: Rotarod Paramètres dans la formation et des protocoles expérimentaux.

2. Le protocole expérimental Rotarod
   1. Sur +7 dpi, pré-régler le Rotarod avec les paramètres de protocole expérimentaux appropriés, tel que décrit dans le tableau 1. Répétez les étapes 2.1.2 à 2.1.10.
   2. À la fin du procès n ° 3, peser chaque souris et faire une note du poids du corps sur la feuille de données. Nettoyer et désinfecter le Rotarod comme par étapes 2.1.11 et 2.1.12.
   3. Tester les souris deux fois par semaine pendant les 6 semaines suivantes, tel que décrit ci-dessus. Au bout de 6 semaines (dans laquelle les souris ont probablement atteint une phase de plateau) ^8,9, tester les souris une fois par semaine avec le même experimental protocole. Le protocole de test réel dure en moyenne 150 jours, selon le cours de la maladie spécifique.
3. Index fonctionnelle neurologique
   1. Exporter les données brutes dans un fichier tableur et analyser les résultats.
   2. Data Express comme temps de fonctionnement (figure 3A): ceci est le temps de fonctionnement normal , plus le temps de rotation passive , moins le temps de retard de rotation (tableau 2) ^10. Calculer le temps moyen en cours d'exécution des trois essais par jour.
   3. Exprimer les données comme un indice neurologique fonctionnel (NFI, figure 3B).
      1. Calculez le seuil de performance de base de chaque souris individuelle. Le seuil de performance de base est déterminée comme étant la moyenne de toutes les durées de fonctionnement du jour + 15 à + 45 pi de ^6,7.
      2. Calculer le NFI comme la moyenne des trois derniers temps moyens de fonctionnement divisé par le seuil de performance de base de ce que ^6,7 de souris spécifique ^</ Sup>.
         NOTE: Si le test de fois en cours d'exécution pour une souris le jour + 72, + 76 et + 79 pi sont 55 sec, 45 sec et 50 sec, et le temps de référence pour la même souris était de 135 sec, le NFI pour que la souris sur +79 dpi sera [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 ou 0,37.
   4. Exprimer les données comme un NFI ajusté (adjNFI; Figure 3C): ajuster les données NFI par une valeur de la population pour l'expérience unique.
      1. Calculer la adjNFI en divisant la valeur NFI par le NFI moyen obtenu par le groupe témoin traité ce jour-là en particulier.

Terme	Définition
temps de fonctionnement normal	Le temps total de la souris passe en cours d' exécution activement sur la tige tournante, à savoir, la latence à l' automne.
temps de rotation passive	Le Amontage de fois que la souris est restée sur la tige dans le mode de rotation passive.
temps de retard de rotation	La durée pendant laquelle la souris reste sur la tige pendant le mode de rotation passive
Mode de rotation passive	Lorsque la souris saisit la tige et tourne sans avoir à déambuler.
temps de session total	Montant total du temps de la souris reste sur la tige tournante pendant la session.
la performance de base	les performances du moteur pré-dommages évalués pour déterminer le seuil de performance minimum.
Neurologique fonction index (NFI)	Index clinique, qui compare chaque performance du moteur de la souris, à savoir, temps de fonctionnement, à tout moment à ses performances de pointe.
Ajusté indice de la fonction neurologique (de adjNFI)	Quand un processus de normalisation est appliquée pour ajuster les données NFI par une valeur de la populationl'expérience unique.
valeur de la population	Valeur moyenne NFI obtenue par le groupe témoin traité à un jour précis.

Tableau 2: Définitions des Rotarod paramètres adoptés pour Quantifier neurologiques.

Résultats

Le but de cette expérience représentative était de comparer l'incapacité neurologique induite par la souche Daniels (DA) et la souche bean de TMEV. Aux fins de la présente étude, un groupe de 32 souris SJL femelles ont été infectées par voie intracrânienne avec TMEV, soit la souche DA (n = 16) ou la souche BEAN (n = 16), et leurs signes cliniques ont été suivis au fil du temps. Un groupe supplémentaire de 20 souris a été simulée traitée (ie, une solution sal...

Discussion

Malgré certaines limites, le test de performance Rotarod représente un outil important pour l'évaluation de la fonction motrice et le dysfonctionnement dans TMEV-IDD ainsi que l'effet des interventions pharmacologiques sur la progression du handicap chez les souris.

Le test Rotarod a été décrite pour la première en 1957 comme un outil de mesure des déficits neurologiques chez les rongeurs ^11. Rongeurs doivent marcher sur une tige tournante, avec l'augmentation ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old	Envigo	#052
TMEV virus stock
Isoflurane vaporizer	Harvard Apparatus	#340471
Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc	BD	#328203
Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software	Columbus Instruments	#0890M