حقن إنترارينال من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; في نموذج الجرذ من التهاب الحويضة والكلية

Summary

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Abstract

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introduction

وقد استخدمت نماذج القوارض لدراسة العديد من المظاهر المرض البشري، بما في ذلك التهاب الحويضة والكلية والتهابات المسالك البولية (وتي). عدوى المسالك البولية هي مشكلة صحية عالمية، ويمكن أن تؤثر على الأطفال والرجال والنساء من جميع الأعمار. ^{1 ، 2 ، 3} المظاهر الأولية من التهاب المسالك البولية تشمل التهاب المثانة، وإذا تصعد العدوى على طول الحالب، قد تلحق التهاب الكلى (التهاب الحويضة والكلية). وفي الوقت نفسه، فإن انتشار مرض السكري يقترب من 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم. ^{4 ، 5} الأهم من ذلك، قد يكون معدل التهاب المسالك البولية أعلى إلى 4 مرات في المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة أو لديهم نوع 2 من مرض السكري، مما أدى إلى زيادة خطر الإصابة المتكررة التهاب المسالك البولية (روتي)، الإنتان، والتليف الكلوي من التهاب الحويضة والكلية، وخلل المثانة. ^{6 ، 7 ، 8} القوارضنماذج مهمة في دراسة التهاب المسالك البولية، لأن العلاجات بالمضادات الحيوية الحالية تنتج استجابة مستدامة، وقائية فقط في مجموعة فرعية من مرضى التهاب المسالك البولية. لتحسين الرعاية المسالك البولية السريرية، والخطوات الرئيسية هي لفهم آلية روتي وعملياتها الفيزيولوجية المرضية من العدوى الحادة إلى التهاب في التليف، فضلا عن تأثير داء السكري من النوع 2.

والهدف من تحسين النماذج الحيوانية هو تطوير التقنيات التي تسمح بتقييم أكثر دقة لتطور المرض والتدخلات العلاجية. وقد استخدمت عدة نهج مختلفة للحث على التهاب الحويضة والكلية في الفئران و / أو الفئران لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من تلف الكلى، وأثر العلاج بالمضادات الحيوية، وغيرها من جوانب المسار الطبيعي للعدوى البولية. وهناك نهج مشترك لإنشاء وتي الوراء هو قسطرة عبر الإحليل. ^{10 ، 11 ، 12 ، 13 <}/ سوب> هذا الأسلوب يدخل البكتيريا عبر مجرى البول في المثانة البولية من الحيوانات تخدير. في حين أن هذه التقنية تحاكي عن كثب التهاب الحويضة والكلية البشرية، فإن الإصابة الفعلية وحجم العدوى التهاب الحويضة والكلية يمكن أن تكون متغيرة للغاية بسبب عوامل متعددة بما في ذلك عدم وجود ارتجاع الحالب العفوي أو البولية يفرغ أثناء أو بعد التلقيح مباشرة. ¹¹ ونتيجة لذلك، فإن التباين التجريبي في إحداث العدوى التهاب الحويضة والكلية تصاعدي يمكن أن تحد من فائدة هذا النموذج لدراسة التهابات الكلى فضلا عن الاستراتيجيات العلاجية.

ويصف هذا التقرير نموذج الفئران التهاب الحويضة والكلية الجراحي حيث يتم حقن E. القولونية مباشرة في الكلى الفئران. على الرغم من هذا النموذج الفئران يجري الغازية، وكمية E. القولونية تسليمها إلى الكلى يمكن السيطرة عليها بشكل فعال مما يتيح التهاب الكلى قوية والالتهابات. ¹⁴ وفي هذا اإلجراء، نصف أيضاكيف يمكن رصد هذه الالتهابات الكلوية التي يسببها طوليا مع في الجسم الحي التصوير بالرنين المغناطيسي (مري).

Protocol

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لبروتوكولات اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة كيس ويسترن ريزيرف. مدة العملية الجراحية الموصوفة أدناه حوالي 45-60 دقيقة. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي نفسه حوالي 15 دقيقة لكل نقطة زمنية.

1. التخدير

1. تخدير الفئران في غرفة إيسوفلوران تعيين في 2٪ إيسوفلوران مختلطة مع الأكسجين لتسهيل التعامل مع الحيوانات وضبط النفس قبل إعطاء التخدير عن طريق الحقن داخل البريتونيا.
2. بعد 3-5 دقائق من التعرض ل إيسوفلوران، تحقق من أن الحيوان هو تخدير ويعرض أي رد على قرصة أخمص قدميه.
3. مزيد من الفئران رزين مع حقن داخل البريتوني من مزيج من زيلازين والكيتامين: 75 ملغ / كغ من الكيتامين / 10 ملغ / كغ زيلازين. عند إجراء الحقن داخل البريتوني، ورسم الإبرة للتأكد من أن أجزاء من الأمعاء أو الأعضاء الحيوية الأخرى لم ثقب.
4. أنانجكت 2 ملغ / كغ من بوبيفاكين تحت الجلد في موقع شق لتوفير تخفيف الألم الموضعية.

2. إعداد منطقة الجراحية

1. تعقيم الأدوات الجراحية واللوازم قبل أن يتم استخدامها لعملية جراحية ووضع على لوحة الجراحية للعقم. يمكن تعقيم معظم الأدوات واللوازم وإعادة استخدامها.
2. استخدام قفازات معقمة لجميع العمليات الجراحية.
3. استخدام الحلاقة الكهربائية لحلق الفراء قبالة الجانب الأيمن للحيوان. يحلق الحيوان من الجزء السفلي من القفص الصدري إلى الجزء العلوي من الساق الخلفية توفير منطقة خالية من الشعر كبيرة للشق.
4. وضع الحيوان على لوحة جراحية معقمة لعزل المنطقة المطهرة من المناطق المحيطة بها.
5. فرك الجلد مع مطهر مثل اليود بوفيدون أو بيتادين. بدء الغسل في مركز الموقع الجراحي والانتقال إلى الخارج بطريقة دائرية. كرر ثلاث مرات على الأقل مع مسح جديد من اليود بوفيدون أو بيتادين.
6. فرك الموقع الجراحي مع مسحات الكحول 70٪ حتى الجلد هو واضح، واليود قد تكون سامة إذا امتص.

3. الإجراء الجراحي

1. الحفاظ على هذا الإجراء تحت ظروف معقمة.
2. وضع الحيوان تخدير على سرير التدفئة الدافئة في موقف الأيسر الوحشي الأيسر مع الجناح الأيمن تواجه صعودا.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية للحيوان في 35-37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم. وينبغي أيضا تعقيم هذا السرير الاحترار حسب الحاجة للحفاظ على ظروف العقيم.
3. يشعر القفص الصدري، وجعل صغير 2-3 سم الحق الظهرية خلف الصفاق شق باستخدام حجم العقيمة 10 شفرة مشرط بدءا من الجزء السفلي من القفص الصدري.
4. وضع الشاش العقيمة طوليا على طول جانبي شق.
5. تشريح بعيدا الأنسجة تحت الجلد، والدهون، والعضلات من أجل تصور والوصول إلى تجويف البطن. استخدام مقص منحني مايو مقصوص للسماح اختراق أعمقحصص في الجرح وقطع الأنسجة السميكة.
6. مرة واحدة في الكبد واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها، واستخدام ملقط حادة لسحب الكبد صعودا.
7. باستخدام زوج آخر من ملقط حادة في ناحية أخرى، وفضح الكلى الحق لذلك يجلس خارج تجويف البطن مباشرة.
8. استخدام إصبع المؤشر والإبهام من اليد اليسرى لعقد الكلى في الموقف. مع اليد اليمنى، ببطء وبشكل مطرد حقن 0.1 مل UTI89 E. القولونية الحل (تركيز بين 1 × 10 ⁸ -1 × 10 ⁹ ) من حقنة معقمة في الحوض الكلوي (الذي يظهر كما فقاعة بيضاء) ¹⁵ .
   ملاحظة: إعداد عيار البكتيرية كما هو موضح في المرجع ¹⁵ .
9. وضع شريط من مرقئ قابل للامتصاص على إبرة لمنع تدفق اللقاح في الصفاق. سحب ببطء الإبرة من الحوض الكلوي.
   ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم بيرس أو إصابة الأنسجة المحيطة مما أدى إلى إنفكتي خارج الهدفو / أو المضاعفات.
10. استخدام حقنة أكبر لشطف شامل الكلى مع المياه المالحة العادية قبل وضعها مرة أخرى في تجويف البطن.

4. الغرز

ملاحظة: خياطة التي سيتم دفنها في الأنسجة يجب أن يكون 4-0 غير قابلة للامتصاص خيوط مضفر. يمكن استخدام خيوط امتصاصية أو أحادية الشعاع لأسطح الجسم.

1. وضع الغرز بالتساوي وعلى مقربة من حافة الأنسجة ممكن لمنع انسداد تدفق الدم. وعادة ما لا يزيد عن 0.3 سم من الحافة أمر ضروري.
2. فهم الجلد و إفرت قليلا باستخدام زوج من ملقط مسنن غرامة، وتدوير حامل الإبرة في موقف بروناتد في التحضير لثقب الجلد.
3. دفع الإبرة من خلال سمك كامل من الجلد عن طريق سوبينغ المعصم لتدوير الإبرة وتمريره من خلال الجلد.
4. كرر هذه العملية لحافة الجلد الأقرب إلى الفرد تنفيذ الإجراء.
5. شدالغرز بما فيه الكفاية لمعارضة حواف الأنسجة. أي تشديد سوف تعوق إمدادات الدم، بطيئة التئام الجروح وقد يؤدي إلى التفكك.
6. التعادل قبالة خياطة باستخدام عقدة مربع، كما لو كانت غرزة توقف بسيطة، إلا أنه يتم قطع فقط حبلا قصيرة، وترك حوالي ذيل 3-4 ملم.
7. بعد ربط غرزة الأولى قبالة، وإعداد لوضع غرزة الثانية حوالي 3 ملم بعيدا عن الأول، ومواصلة خياطة تشغيل.
8. مرة واحدة يتم التوصل إلى نهاية شق، لا سحب غرزة الماضي تماما من خلال. بدلا من ذلك، استخدام حلقة التي تعقد مع حامل الإبرة هنا كما حبلا قصيرة من أجل التعادل من نهاية البعيدة من إغلاق خياطة.
9. باستخدام العلاقات أداة، التعادل قبالة خياطة باستخدام عقدة مربع. وهذا يؤدي إلى 3 فروع تلتصق من عقدة الانتهاء في نهاية البعيدة.

5. الحيوان الانتعاش

1. حقن 2.1 ملغ / كغ يوهيمبين داخل البريتونيا بعد الجراحة لعكس التخدير. اومن المتوقع نيمالس للتعافي تماما من الإجراء الجراحي بعد 3-5 ساعة.
2. الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة (لتجنب انخفاض حرارة الجسم) والفراش لينة ماصة بعد الجراحة.
3. توفير الإماهة مع السوائل عن طريق الفم أو الوريدية حتى يمكن العودة إلى التغذية الطبيعية (في غضون 24 ساعة). حقن حوالي 0.6 مل من محلول ملحي عادي البريتوني مباشرة بعد الجراحة للحد من آثار الجفاف.
4. توفير تسكين كما هو موضح في إاكوك وافق رعاية الحيوان واستخدام بروتوكول. حقن 5 ملغ / كغ كاربروفين تحت الجلد لإدارة الألم.
5. مراقبة الشقوق بانتظام للتورم، الافرازات، ألم، أو التفكك.

6. التحقق من صحة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي

1. إجراء أنا فيفو تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي على حقل كبير الماسحات الضوئية التصوير بالرنين المغناطيسي الحيوانات الصغيرة.
2. إزالة التخدير مع 3٪ الأيزوفلورين في الأكسجين ووضع الحيوان مع الكلى الحق في إزوسنتر في الماسح الضوئي والتصوير بالرنين المغناطيسيأكلت الترددات الراديوية لفائف. توفير الحيوانات مع 1-2٪ إيسوفلوران التخدير بشكل مستمر في جميع أنحاء إجراء التصوير عن طريق نوسكون.
   ملاحظة: بالنسبة للصور التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي هو مبين في الشكل 1 ، تم استخدام لفائف حجم الفئران الحجم (القطر الداخلي = 72 ملم).
3. استخدام نظام مراقبة الحيوان ومراقبة للحفاظ على معدل التنفس كل حيوان (40-60 الأنفاس / دقيقة) ودرجة حرارة الجسم الأساسية (35 ± 1 درجة مئوية).
4. استخدام متعددة شريحة، متعددة صدى تدور صدى الحصول على التصوير بالرنين المغناطيسي للحصول على دقة عالية، محوري T2 المرجحة الصور من كل من المصابة والسيطرة على الكلى. معلمات اكتساب التصوير بالرنين المغناطيسي النموذجية هي زمن التكرار = 5000 ميللي ثانية، وقت صدى = 40 ميللي ثانية، سمك شريحة = 2.0 ملم، في المكان القرار المكاني = 200 ميكرون، 3 متوسطات إشارة، ووقت اكتساب من 8 دقائق.

النتائج

تقنيات التصوير الطبي توفر الفرصة لتقييم غير جراحية التهاب المسالك البولية والفعالية العلاجية. لذلك، تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي للتحقق من صحة تحريض العدوى الحادة بعد حقن 1-2 × 10 ⁷ UTI89 E. القولونية ، وتصور التغيرات في الكلى قبل وبع...

Discussion

يمكن أن تنتج التهاب الحويضة والكلية الحاد في القوارض (أي الفئران والجرذان) عن طريق القسطرة عبر الإحليل. ^{16 ، 17 ، 18} هذا الأسلوب العدوى عبر الإحليل هو مفيد في أنه غير الغازية ويحاكي الفيزيولوجيا المرضية البشرية من ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR