הזרקת Intranenal של<em&gt; Escherichia coli</em&gt; במודל עכברוש של Pyelonephritis

Summary

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Abstract

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introduction

מודלים מכרסמים שימשו כדי לחקור תופעות רבות של המחלה האנושית, כולל pyelonephritis וזיהומים בדרכי השתן (UTI). UTI הם בעיה בריאותית גלובלית, והוא יכול להשפיע על ילדים, גברים ונשים בכל הגילאים. ^{1 , 2 , 3} הביטוי הראשוני של UTI כולל דלקת שלפוחית ​​השתן, ואם הזיהום עולה לאורך השופכן, זיהום כליות (pyelonephritis) עשוי לעקוב. במקביל, שכיחות הסוכרת מתקרבת ל -400 מיליון איש ברחבי העולם. ^{4 , 5} חשוב לציין כי שכיחות UTI עשויה להיות גבוהה פי 4 בחולים הסובלים מהשמנת יתר או סוכרת מסוג 2, מה שמוביל לסיכון מוגבר לדלקת UTI חוזרת (rUTI), אלח דם, פיברוזיס כליות מדלקת פילונפריטיס, וחוסר תפקוד של שלפוחית ​​השתן. ^{6 , 7 , 8} מכרסמיםמודלים חשובים לחקר UTI, משום שטיפולים אנטיביוטיים עכשוויים מייצרים תגובה מתמשכת ומניעה רק בקבוצת משנה של חולי UTI. כדי לשפר את הטיפול UTI הקליני, הצעדים העיקריים הם להבין את המנגנון של RUTI ואת התהליכים הפתופיזיולוגיים שלה מפני דלקת חריפה לדלקת פיברוזיס, כמו גם את ההשפעה של סוכרת מסוג 2.

המטרה של שיפור מודלים של בעלי חיים היא לפתח טכניקות המאפשרות הערכה מדויקת יותר של התקדמות המחלה והתערבויות טיפוליות. כמה גישות שונות שימשו כדי לגרום pyelonephritis חולדות ו / או עכברים ללמוד את הפתופיזיולוגיה של נזק לכליות, את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי, וכן היבטים אחרים של הקורס הטבעי של UTIs. גישה נפוצה להקים UTI מדרדר הוא צנתור transurethral. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> שיטה זו מציגה חיידקים דרך השופכה לתוך שלפוחית ​​השתן של בעלי חיים הרדים. בעוד טכניקה זו מקרוב מדמה pyelonephritis האדם, ההיארעות בפועל ואת גודל של זיהום pyelonephritis יכול להיות משתנה מאוד בגלל מספר גורמים, כולל חוסר ריפלוקס אוורטרי ספונטנית או הימנעות השתן במהלך או מיד לאחר חיסון. ¹¹ כתוצאה מכך, השתנות הניסוי בגידול זיהום pyelonephritis עולה יכול להגביל את התועלת של מודל זה כדי לחקור זיהומים כליות, כמו גם אסטרטגיות טיפוליות.

דוח זה מתאר מודל כירורגי pyelonephritis חולדה שבו E. coli מוזרק ישירות לתוך הכליה חולדה. למרות מודל חולדה זה פולשני, כמות E. coli נמסר כליה ניתן לשלוט באופן יעיל המאפשר דלקת כליות חזקה דלקת. ¹⁴ במסגרת הליך זה, אנו מתארים גםאיך אלה המושרה זיהומים כליות ניתן לפקח longitudinally עם in vivo מגנטית תהודה הדמיה (MRI).

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו על פי פרוטוקולים מאושרים לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב. משך הליך כירורגי המתואר להלן הוא כ 45-60 דקות. הליך MRI עצמו הוא כ 15 דקות עבור כל נקודת זמן.

1. הרדמה

1. הרדים עכברוש בחדר isoflurane להגדיר ב 2% isoflurane מעורבב עם חמצן כדי להקל על טיפול בבעלי חיים וריסון לפני מתן הרדמה הזרקת תוך - peritoneally.
2. לאחר 3-5 דקות של חשיפה isoflurane, לבדוק כי החיה הוא הרדים ולא מציג שום תגובה על קמצוץ הבוהן.
3. עוד חולדה מסודר עם זריקה תוך-צפית של תערובת של xylazine ו ketamine: 75 מ"ג / ק"ג קטמין / 10 מ"ג / ק"ג xylazine. בעת ביצוע זריקות intra-פריטונאלי, למשוך בחזרה את המחט כדי להבטיח חלקים של המעי או איברים חיוניים אחרים לא נקברו.
4. אנידלקת 2 מ"ג / ק"ג של bupivacaine תת עורית באתר החתך לספק הקלה על כאב מקומי.

2. הכנת אזור כירורגי

1. לעקר מכשירים כירורגי ואספקה ​​לפני שהם משמשים לניתוח לפרוס על כרית כירורגי סטריליות. רוב המכשירים והאספקה ​​יכול להיות autoclaved ושימוש חוזר.
2. השתמש כפפות סטריליות עבור כל הליכים כירורגיים.
3. השתמש תער חשמלי לגלח את הפרווה מן הצד הימני של החיה. לגלח את החיה מהחלק התחתון של הצלעות כלוב לחלק העליון של הרגל האחורית מתן אזור גדול ללא שיער עבור החתך.
4. מניחים את החיה על כרית כירורגי סטרילי לבודד את האזור מחטא מן האזורים הסמוכים.
5. לשפשף את העור עם חיטוי כגון povidone יוד או betadine. התחל את קרצוף במרכז האתר כירורגית ולעבור החוצה באופן מעגלי. חזור לפחות שלוש פעמים עם מחיקת חדש של יוד פובידון או betadine.
6. לשפשף את האתר כירורגי עם 70% אלכוהול ספוגי עד העור הוא ברור, כמו יוד עשוי להיות רעיל אם נספג.

3. הליך כירורגי

1. שמור על הליך זה בתנאים aseptic.
2. למקם את החיה הרדים על המיטה חימום חם בעמדה decubitus שמאל לרוחב עם האגף הימני פונה כלפי מעלה.
   הערה: יש להקפיד לשמור על טמפרטורת הגוף הליבה של החולה ב 35-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע היפותרמיה. מיטה זו התחממות צריך גם להיות מעוקרים לפי הצורך כדי לשמור על תנאים aseptic.
3. להרגיש על כלוב צלעות, ולעשות חתך קטן 2-3 ס"מ ימין retroperitoneal הגב באמצעות גודל סטרילי 10 להב סכין מנתח החל בחלק התחתון של הצלעות כלוב.
4. המקום גזה סטרילית longitudinally לאורך כל צד של החתך.
5. לנתח משם את הרקמה התת עורית, שומן, ואת השרירים על מנת לדמיין ולגשת חלל הבטן. השתמש מספריים Mayo מעוקל להב לאפשר חדירה עמוקה יותרRation לתוך הפצע ו לחתוך רקמות עבות.
6. לאחר הכבד הוא גלוי בבירור ונגיש, להשתמש מלקחיים קהה כדי לסגת את הכבד כלפי מעלה.
7. באמצעות זוג אחר של מלקחיים קהה ביד השנייה, לחשוף את הכליות הנכונה כך שהוא יושב ממש מחוץ חלל הבטן.
8. השתמש באצבע המצביע ובאגודל היד השמאלית כדי להחזיק את הכליה במצב. עם היד הימנית, לאט לאט בהזרקה 0.1 מ"ל UTI89 E. coli פתרון (ריכוז בין 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) מזרק סטרילי לתוך האגן הכליות (המופיע כמו בועה לבנה) ¹⁵ .
   הערה: הכן את titer בקטריאלי כמתואר בסעיף ¹⁵ .
9. מניחים רצועת המוסטאט absorbable מעל המחט כדי למנוע יצוא של inoculum לתוך הצפק. לאט לאט למשוך את המחט מתוך האגן הכליות.
   הערה: יש להקפיד לא לחדור או להדביק הרקמות הסובבות וכתוצאה מכך infecti היעדו / או סיבוכים.
10. השתמש מזרק גדול לשטוף היטב את הכליה עם מלוחים רגילים לפני הצבת אותו בחזרה חלל הבטן.

4. התפרים

הערה: תפר כי יהיה קבור ברקמות צריך להיות 4-0 לא absorbable קלוע sutures. ניתן להשתמש בחומרי תפירה נספגים או מונופילמנטיים למשטחי גוף.

1. מניחים את התפרים באופן שווה, קרוב ככל האפשר לקצה רקמות כדי למנוע חסימה של זרימת הדם; בדרך כלל לא יותר מ 0.3 ס"מ מן הקצה יש צורך.
2. לתפוס את העור להסיט אותו מעט באמצעות זוג מלקחיים שיניים בסדר, לסובב את המחט בעל למצב pronated לקראת פירסינג העור.
3. כונן את המחט דרך עובי מלא של העור על ידי supinating את פרק כף היד כדי לסובב את המחט ולהעביר אותו דרך העור.
4. חזור על תהליך זה על קצה העור הקרוב ביותר לאדם המבצע את ההליך.
5. לְהַדֵקהתפרים מספיק כדי להתנגד קצוות רקמות. כל לחץ חזק יותר יפריע לאספקת הדם, ריפוי פצעים איטי ויכול לגרום להרס.
6. לקשור את תפר באמצעות קשרים מרובעים, כאילו זה היה תפר קטוע פשוט, אלא רק את גדיל קצר הוא חתך, משאיר על זנב 3-4 מ"מ.
7. לאחר תפר הראשון כבר כבוי, להכין למקום תפר השני על 3 מ"מ מן הראשון, ולהמשיך את תפר פועל.
8. לאחר סיום החתך הוא הגיע, לא למשוך את תפר האחרון לחלוטין דרך. במקום זאת, להשתמש בלולאה אשר מוחזק עם מחזיק מחט כאן כמו גדיל קצר על מנת לקשור את קצה דיסטלי של תפר הסגירה.
9. באמצעות קשרים המכשיר, לקשור את תפר באמצעות קשרים מרובעים. התוצאה היא 3 גדילי דבק מן הקשר הושלמה בקצה הדיסטלי.

5. התאוששות בעלי חיים

1. להזריק 2.1 מ"ג / ק"ג Yohimbine intra-peritoneally לאחר הניתוח כדי להפוך את ההרדמה. אNimals צפויים להתאושש לחלוטין מהליך כירורגי לאחר 3-5 שעות.
2. שמור את החיה על כרית חימום (כדי למנוע היפותרמיה) ו מצעים רכים סופג לאחר הניתוח.
3. לספק rehydration עם נוזלים אוראליים או פרקטראליים עד שהוא יכול לחזור להאכלה רגילה (בתוך 24 שעות). להזריק כ 0.6 מ"ל של תמיסת מלח תמיסת peritoneally מיד לאחר הניתוח להגביל את ההשפעות התייבשות.
4. ספק כאבים כפי שתואר IACUC אישרה טיפול בבעלי חיים פרוטוקול שימוש. להזריק 5 מ"ג / ק"ג carprofen תת עורית לניהול כאב.
5. מעקב אחר חתכים באופן קבוע עבור נפיחות, exudate, כאב, או dehiscence.

6. אימות באמצעות הדמיה תהודה מגנטית

1. התנהגות i vivo MRI ניסויים על שדה גבוה בעלי חיים קטנים MRI סורקים.
2. להשרות הרדמה עם isoflurane 3% חמצן ומיקום החיה עם הכליה הנכונה ב isocenter בסורק ה- MRI ו מתאיםאכלו רדיו. לספק לבעלי חיים 1-2% הרדמה isoflurane ברציפות לאורך כל הליך הדמיה באמצעות nosecone.
   הערה: בתמונות MRI של vivo שמוצג באיור 1 , נעשה שימוש בגליל נפח של חולדה (בקוטר פנימי = 72 מ"מ).
3. השתמש ניטור בבעלי חיים מערכת בקרה כדי לשמור על קצב הנשימה של כל חיה (40-60 נשימות / דקות) ואת טמפרטורת הגוף הליבה (35 ± 1 ° C).
4. השתמש רב פרוסה, הד הד ספין MRI הרכישה כדי להשיג ברזולוציה גבוהה, T2 משוקלל תמונות משוקלל של כליות נגוע והבקרה. פרמטרים אופייניים לרכישת MRI הם זמן חזרה = 5,000 msec, זמן הד = 40 msec, עובי פרוסה = 2.0 מ"מ, רזולוציה מרחבית במטוס = 200 מיקרומטר, 3 ממוצעי אותות וזמן רכישה של 8 דקות.

תוצאות

טכניקות ההדמיה הרפואית מציעות את האפשרות להעריך באופן לא פולשני את היעילות של UTI ואת היעילות הטיפולית. לכן, MRI נוצל כדי לאמת אינדוקציה של זיהום חריף לאחר הזרקה של 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli , וכן לדמיין את השינויים בכליה לפני ואחרי הניתוח. איור 1a-b

Discussion

עולה pyelonephritis חריפה מכרסמים (כלומר עכברים וחולדות) יכול להיות מיוצר על ידי צנתור transurethral. ^{16 , 17 , 18} שיטה זו זיהום transurethral הוא יתרון בכך שהוא לא פולשני ומחקה את הפתופיזיולוגיה האנושית של זיהום עולה. ^{17 ...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR