Iniezione intrarenale di<emEscherichia coli</em&gt; In un modello di ratto di pielonefriti

Riepilogo

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Abstract

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introduzione

I modelli di roditori sono stati usati per studiare numerose manifestazioni di malattia umana, tra cui le pielonefriti e le infezioni delle vie urinarie (UTI). Le UTI sono un problema di salute globale e possono influenzare i bambini, gli uomini e le donne di tutte le età. ^{1 , 2 , 3} La manifestazione iniziale di UTI comprende la cistite, e se l'infezione sale lungo l'uretere, può verificarsi un'infezione renale (pyelonephritis). Allo stesso tempo, la prevalenza del diabete sta avvicinando 400 milioni di persone in tutto il mondo. ^{4 , 5 È} importante notare che l'incidenza di UTI può essere fino a 4 volte superiore nei pazienti obesi o in diabete mellito di tipo 2, con conseguente aumento del rischio di infezione urinaria ricorrente (rUTI), sepsi, fibrosi renale da pielonefritica e disfunzione della vescica. ^{6 , 7 , 8} RoditoreI modelli sono importanti nello studio degli UTI, in quanto le terapie antibiotiche attuali producono una risposta preventiva e sostenibile solo in un sottoinsieme di pazienti UTI. Per migliorare la cura clinica dell'UTI, i passaggi chiave sono quello di comprendere il meccanismo del rUTI e dei suoi processi patofisiologici da infezioni acute all'infiammazione alla fibrosi, così come l'impatto del diabete mellito di tipo 2.

L'obiettivo di migliorare i modelli animali è quello di sviluppare tecniche che consentano una valutazione più accurata della progressione della malattia e degli interventi terapeutici. Sono stati impiegati diversi approcci diversi per indurre la pielonefrite nei ratti e / o nei topi per studiare la fisiopatologia dei danni renali, l'effetto del trattamento antibiotico e altri aspetti del corso naturale delle UTI. Un approccio comune per stabilire l'UTI retrogrado è la cateterizzazione transuretrale. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Questo metodo introduce batteri attraverso l'uretra nella vescica urinaria degli animali anestetizzati. Mentre questa tecnica simula attentamente la pielonefrite umana, l'incidenza effettiva e la grandezza dell'infezione da pielonefrite possono essere molto variabili a causa di più fattori, tra cui una mancanza di reflusso uretrico spontaneo o di annullamento urinario durante o subito dopo inoculazione. ¹¹ Di conseguenza, la variabilità sperimentale nell'indurre un'infezione pielonefrite ascendente può limitare l'utilità di questo modello per studiare le infezioni renali, nonché le strategie terapeutiche.

Questo rapporto descrive un modello di ratto chirurgico pielonefrite in cui E. coli viene iniettato direttamente nel rene del ratto. Nonostante questo modello di ratto sia invasivo, la quantità di E. coli consegnata al rene può essere efficacemente controllata che consente una forte infezione renale e infiammazione. ¹⁴ In questa procedura descriviamo ancheCome queste infezioni renali indotte possono essere monitorate in modo longitudinale con la risonanza magnetica in vivo (MRI).

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso la Case Western Reserve University. La durata della procedura chirurgica descritta di seguito è di circa 45-60 min. La procedura MRI stessa è di circa 15 minuti per ogni punto temporale.

1. Anestesia

1. Anestetizzare il ratto nella camera isoflurana impostata al 2% di isoflurano mescolata all'ossigeno per facilitare la manipolazione e la ritenzione degli animali prima di somministrare anestesia iniettabile intraperitoneale.
2. Dopo 3-5 minuti di esposizione all'isoflurano, verificare che l'animale sia anestetizzato e non presenta alcuna risposta al pizzico del piede.
3. Ulteriore ratto sedativo con iniezione intraperitoneale di miscela di xilazina e ketamina: 75 mg / kg di ketamina / 10 mg / kg di xilazina. Durante l'esecuzione di iniezioni intraperitoneali, tirare indietro l'ago per assicurare che parti dell'intestino o altri organi vitali non siano stati forati.
4. ioSomministrare 2 mg / kg di bupivacaina sottocutanea al sito di incisione per fornire sollievo al dolore topico.

2. Preparazione dell'area chirurgica

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e le forniture prima di essere utilizzati per l'intervento chirurgico e posare sul panno chirurgico per la sterilità. La maggior parte degli strumenti e delle forniture possono essere autoclavate e riutilizzate.
2. Utilizzare guanti sterili per tutte le procedure chirurgiche.
3. Utilizzare un rasoio elettrico per rasare la pelliccia dal lato destro dell'animale. Rasare l'animale dalla parte inferiore della gabbia alla cima della gamba posteriore fornendo una grande zona senza capelli per l'incisione.
4. Posizionare l'animale su un rilievo chirurgico sterile per isolare l'area disinfettata dalle aree circostanti.
5. Scrub la pelle con un disinfettante come povidone iodio o betadina. Avviare lo scrubbaggio al centro del sito chirurgico e spostarsi all'esterno in modo circolare. Ripetere almeno tre volte con una nuova strofinata di povidone iodio o betadina.
6. Scrub il sito chirurgico con tamponi alcolici al 70% fino a quando la pelle non è chiara, in quanto iodio può essere tossico se assorbito.

3. Procedura chirurgica

1. Mantenere questa procedura in condizioni asettiche.
2. Posizionare l'animale anestetizzato su un letto caldo riscaldante in posizione di decubito laterale sinistra con il lato destro rivolto verso l'alto.
   NOTA: Si deve prestare attenzione a mantenere la temperatura corporea del corpo animale a 35-37 ° C per prevenire l'ipotermia. Questo letto di riscaldamento deve anche essere sterilizzato come necessario per mantenere le condizioni asettiche.
3. Sentitevi per la gabbia toracica e fate una piccola incisione retroperitoneale dorsale di 2-3 cm, usando una lama sterile di 10 scalpelli che inizia dalla parte inferiore della gabbia.
4. Mettere la garza sterile longitudinalmente lungo entrambi i lati dell'incisione.
5. Eliminare il tessuto sottocutaneo, il grasso e i muscoli per visualizzare e accedere alla cavità addominale. Utilizzare le forbici Mayo a lame curve per consentire una penetrazione più profondaRazione in ferita e tagliare i tessuti spessi.
6. Una volta che il fegato è chiaramente visibile e accessibile, utilizzare pinze sbilanciate per ritirare il fegato verso l'alto.
7. Utilizzando un'altra coppia di pinze sbarrate dall'altra mano, esporre il rene destro in modo che si trovi appena fuori dalla cavità addominale.
8. Usa il dito del puntatore e il pollice della mano sinistra per tenere il rene in posizione. Con la mano destra, lentamente e in modo costante iniettare 0,1 ml di soluzione Uci89 E. coli (concentrazione tra 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) da una siringa sterile nel bacino renale (che appare come una bolla bianca) ¹⁵ .
   NOTA: Preparare il titolo batterico come descritto nel riferimento ¹⁵ .
9. Mettere una striscia di hemostat assorbibile sopra l'ago per impedire l'uscita di inoculo nel peritoneo. Tirare lentamente l'ago dalla vaschetta renale.
   NOTA: Si dovrebbe prestare attenzione a non perforare o infettare i tessuti circostanti causando infezioni fuori bersaglioOns e / o complicazioni.
10. Usare una siringa più grande per risciacquare accuratamente il rene con una normale soluzione salina prima di riportarla nella cavità addominale.

4. Suture

Nota: La sutura che sarà sepolta nei tessuti deve essere 4-0 non sagomatura intrecciata assorbibile. Possono essere utilizzate delle suture assorbibili o di monofilamento per le superfici del corpo.

1. Posizionare le suture in modo uniforme e più vicino al bordo del tessuto possibile per prevenire l'ostruzione del flusso sanguigno; In genere non è più di 0,3 cm dal bordo è necessario.
2. Afferrare la pelle e aggiungerla leggermente usando una coppia di pinze a dentatura fine e ruotare il portautensile in una posizione pronata in preparazione per il piercing della pelle.
3. Guidare l'ago attraverso lo spessore completo della pelle, sovrastando il polso per ruotare l'ago e passarlo attraverso la pelle.
4. Ripetere questo processo per il bordo della pelle più vicino all'operatore che esegue la procedura.
5. serrareLe suture abbastanza per opporsi ai bordi del tessuto. Qualsiasi più stretta ostacola l'approvvigionamento di sangue, la lenta guarigione delle ferite e può provocare la dehiscenza.
6. Togliere la sutura usando nodi quadrati, come se fosse un semplice punto interrotto, tranne che solo il filo corto è tagliato, lasciando circa una coda di 3-4 mm.
7. Dopo che il primo punto è stato legato, preparatevi a posizionare un secondo punto di circa 3 mm dalla prima e continuare la sutura in esecuzione.
8. Una volta raggiunta la fine dell'incisione, non tirare completamente l'ultimo punto. Invece, utilizzare il loop che viene tenuto con il porta-ago come filo corto per tirare l'estremità distale della chiusura a sutura.
9. Usando i legami dello strumento, legare la sutura usando i nodi quadrati. Ciò provoca 3 fili che si adattano dal nodo finale all'estremità distale.

5. Recupero degli animali

1. Iniettare 2,1 mg / kg di Yohimbine intra-peritoneale dopo l'intervento chirurgico per invertire l'anestesia. UNSi prevede che i nomi si riprenderanno completamente dalla procedura chirurgica dopo 3-5 ore.
2. Mantenere l'animale su un tappetino di riscaldamento (per evitare l'ipotermia) e biancheria morbida assorbente dopo l'intervento chirurgico.
3. Fornire la reidratazione con i fluidi orali o parenterali finché non può tornare alla normale alimentazione (entro 24 ore). Iniettare circa 0,6 ml di soluzione salina normale peritonealmente immediatamente dopo l'intervento chirurgico per limitare gli effetti di disidratazione.
4. Fornire analgesia come descritto nel protocollo Animal Care and Use, approvato dalla IACUC. Iniettare 5 mg / kg di carprofen sottocutanea per la gestione del dolore.
5. Monitor incisioni regolarmente per gonfiore, esudazione, dolore o dehiscenza.

6. Convalida tramite la risonanza magnetica

1. Eseguire esperimenti MRI in vivo su scanner MRI di piccole dimensioni in campo.
2. Indurre l'anestesia con il 3% di isoflurano nell'ossigeno e posizionare l'animale con il rene destro nell'isocentro nello scanner MRI e appropriatoBere una radiofrequenza. Fornire animali con un'anestesia isoflurana 1-2% in modo continuo per tutta la procedura di imaging tramite un nosecone.
   NOTA: Per le immagini MRI in vivo mostrate in Figura 1 è stata utilizzata una bobina di volume di dimensioni corporee (diametro interno = 72 mm).
3. Utilizzare un sistema di controllo e controllo degli animali per mantenere il tasso di respirazione di ciascun animale (40-60 respiri / min) e la temperatura corporea (35 ± 1 ° C).
4. Utilizzare un'acquisizione MRI multi-fice multi-echo spin echo per ottenere immagini ad alta risoluzione, T2, ponderate assiali sia dei reni infetti che del controllo. I parametri di acquisizione MRI tipici sono il tempo di ripetizione = 5.000 msec, echo time = 40 msec, spessore della fetta = 2.0 mm, risoluzione spaziale in piano = 200 μm, 3 media di segnale e un tempo di acquisizione di 8 min.

Risultati

Le tecniche di imaging medico offrono l'opportunità di valutare non invasivamente l'UTI e l'efficacia terapeutica. Pertanto, la RM è stata utilizzata per convalidare l'induzione di infezione acuta dopo l'iniezione di 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli e per visualizzare le alterazioni del rene prima e dopo l'intervento chirurgico. La figura 1a-b mostra una regione progressiva di infezione renale (frecce gialle). Le immagini MRI ottenut...

Discussione

La pielonefrite acuta ascendente nei roditori (ad es. Topi e ratti) può essere prodotta mediante cateterizzazione transuretrale. ^{16 , 17 , 18} Questo metodo di infezione transuretrale è vantaggioso in quanto non invasivo e imita la fisiopatologia umana dell'infezione ascendente. ^{17 , 18 , 19 ,}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR