Injection Intrarénale de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Dans un modèle de rat de pyélonéphrite

Résumé

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Résumé

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introduction

Les modèles de rongeurs ont été utilisés pour étudier de nombreuses manifestations de maladies humaines, y compris la pyélonéphrite et les infections urinaires (UTI). Les infections urinaires sont un problème de santé mondial et peuvent avoir un impact sur les enfants, les hommes et les femmes de tous âges. ^{1 , 2 , 3} La manifestation initiale de l'UTI comprend la cystite, et si l'infection augmente le long de l'urètre, une infection rénale (pyélonéphrite) peut suivre. Dans le même temps, la prévalence du diabète touche environ 400 millions de personnes à travers le monde. ^{4 , 5 Il est} important de noter que l'incidence de l'UTI peut être jusqu'à 4 fois plus élevée chez les patients obèses ou qui ont un diabète de type 2, ce qui entraîne un risque accru d'infection à UTI récurrente (UTI), une septicémie, une fibrose rénale de la pyélonéphrite et un dysfonctionnement de la vessie. ^{6 , 7 , 8} RongeurLes modèles sont importants dans l'étude des infections urinaires, car les traitements antibiotiques actuels produisent une réponse préventive et soutenue uniquement dans un sous-ensemble de patients atteints d'UTI. Pour améliorer les soins cliniques d'UTI, les étapes clés sont de comprendre le mécanisme de rUTI et ses processus pathophysiologiques, de l'infection aiguë à l'inflammation à la fibrose, ainsi que l'impact du diabète sucré de type 2.

L'objectif d'améliorer les modèles animaux est de développer des techniques permettant une évaluation plus précise de la progression de la maladie et des interventions thérapeutiques. Plusieurs approches différentes ont été utilisées pour induire une pyélonéphrite chez les rats et / ou les souris pour étudier la pathophysiologie des lésions rénales, l'effet du traitement antibiotique et d'autres aspects du cours naturel des infections urinaires. Une approche commune pour établir une UTI rétrograde est le cathétérisme transurétral. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Cette méthode introduit des bactéries par l'urètre dans la vessie des animaux anesthésiés. Bien que cette technique simule de près la pyélonéphrite humaine, l'incidence et l'ampleur réelles de l'infection pyélonéphrite peuvent être très variables en raison de multiples facteurs, y compris un manque de reflux urétéral spontané ou de sédiment urinaire pendant ou immédiatement après l'inoculation. ¹¹ En conséquence, la variabilité expérimentale pour induire une infection ascendante de pyélonéphrite peut limiter l'utilité de ce modèle pour étudier les infections rénales ainsi que des stratégies thérapeutiques.

Ce rapport décrit un modèle de rat de pyélonéphrite chirurgicale où E. coli est directement injecté dans le rein du rat. Bien que ce modèle de rat soit envahissant, la quantité d' E. Coli délivrée au rein peut être efficacement contrôlée, ce qui permet une infection et une inflammation rénales rénales. ¹⁴ Dans cette procédure, nous décrivons égalementComment ces infections rénales induites peuvent être surveillées longitudinalement avec l'imagerie par résonance magnétique (MRI) in vivo .

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées selon les protocoles approuvés du Comité d'aide et de prise en charge des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université Case Western Reserve. La durée de la procédure chirurgicale décrite ci-dessous est d'environ 45 à 60 minutes. La procédure d'IRM elle-même est d'environ 15 minutes pour chaque point de temps.

1. Anesthésie

1. Anesthésier le rat dans la chambre d'isoflurane réglée à 2% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène pour faciliter la manipulation et la contrainte des animaux avant d'administrer une anesthésie injectable intrapéritonéale.
2. Après 3 à 5 minutes d'exposition à l'isoflurane, vérifiez que l'animal est anesthésié et ne présente aucune réponse au pincement de l'orteil.
3. Plus de rat sédatif avec une injection intra-péritonéale d'un mélange de xylazine et de kétamine: 75 mg / kg de kétamine / 10 mg / kg de xylazine. Lorsque vous effectuez des injections intra-péritonéales, retirez l'aiguille pour s'assurer que des parties de l'intestin ou d'autres organes vitaux n'ont pas été perforées.
4. jeNject 2 mg / kg de bupivacaïne par voie sous-cutanée sur le site d'incision pour fournir un soulagement de la douleur topique.

2. Préparation de la zone chirurgicale

1. Stériliser les instruments et les fournitures chirurgicales avant d'être utilisés pour la chirurgie et disposer sur le coussin chirurgical pour la stérilité. La plupart des instruments et des fournitures peuvent être autoclavés et réutilisés.
2. Utilisez des gants stériles pour toutes les interventions chirurgicales.
3. Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure du côté droit de l'animal. Raser l'animal du fond de la cage thoracique vers le haut de la patte postérieure en fournissant une grande zone sans cheveux pour l'incision.
4. Placez l'animal sur un tampon chirurgical stérile pour isoler la zone désinfectée des zones environnantes.
5. Nettoyer la peau avec un désinfectant comme la povidone iodée ou la betadine. Commencez le lavage au centre du site chirurgical et passez à l'extérieur de manière circulaire. Répétez au moins trois fois avec un nouvel essuyage de povidone iodine ou betadine.
6. Scrub le site chirurgical avec des tampons à alcool de 70% jusqu'à ce que la peau soit claire, car l'iode peut être toxique s'il est absorbé.

3. Procédure chirurgicale

1. Maintenir cette procédure dans des conditions aseptiques.
2. Placez l'animal anesthésié sur un lit de chauffage chaud dans la position de décubitus latéral gauche avec le flanc droit vers le haut.
   REMARQUE: il faut veiller à maintenir la température du corps central de l'animal à 35-37 ° C pour prévenir l'hypothermie. Ce lit chauffant devrait également être stérilisé au besoin pour maintenir les conditions aseptiques.
3. Sentez-vous pour la cage thoracique, et faites une petite incision rétropéritonale dorsale droite de 2-3 cm en utilisant une lame de scalpel stérile de taille 10 commençant au bas de la cage thoracique.
4. Placez la gaze stérile longitudinalement de chaque côté de l'incision.
5. Dissectionner le tissu sous-cutané, la graisse et les muscles afin de visualiser et d'accéder à la cavité abdominale. Utilisez des ciseaux à lame incurvée pour permettre une pénétration plus profondeRayer la plaie et couper les tissus épais.
6. Une fois que le foie est clairement visible et accessible, utilisez une pince serrée pour rétracter le foie vers le haut.
7. À l'aide d'une autre paire de pinces émoussées, d'autre part, exposez le rein droit de sorte qu'il se trouve juste à l'extérieur de la cavité abdominale.
8. Utilisez le doigt du pointeur et le pouce de la main gauche pour maintenir le rein en position. Avec la main droite, injectez lentement et régulièrement une solution de E. coli UTI89 0,1 ml (concentration entre 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) d'une seringue stérile dans le bassin rénal (qui apparaît comme une bulle blanche) ¹⁵ .
   REMARQUE: Préparez le titre bactérien comme décrit dans la référence ¹⁵ .
9. Placez une bande d'hémostatique absorbable sur l'aiguille pour empêcher l'écoulement d'inoculum dans le péritoine. Retirez lentement l'aiguille du bassin rénal.
   REMARQUE: Il faut prendre soin de ne pas percer ou infecter les tissus environnants, ce qui entraîne une infectibilité hors cibleOns et / ou des complications.
10. Utilisez une seringue plus grande pour bien rincer le rein avec une solution saline normale avant de le remettre dans la cavité abdominale.

4. Sutures

Remarque: La suture qui sera enterrée dans les tissus devrait être de 4 à 0 sutures tressées non absorbables. Les sutures absorbantes ou monofilaments peuvent être utilisées pour les surfaces corporelles.

1. Placez les sutures uniformément et aussi près du bord du tissu que possible pour empêcher l'obstruction du flux sanguin; Généralement pas plus de 0,3 cm du bord est nécessaire.
2. Saisissez la peau et évitez-la légèrement à l'aide d'une pince fine à pointe dentée, et faites pivoter le porte-aiguille dans une position pronisée en vue de percer la peau.
3. Conduisez l'aiguille à travers l'épaisseur totale de la peau en supprimant le poignet pour faire pivoter l'aiguille et la passer à travers la peau.
4. Répétez ce processus pour le bord de la peau le plus proche de l'individu exécutant la procédure.
5. SerrerLes sutures suffisent pour s'opposer aux bords des tissus. Tout plus serré entravera l'approvisionnement en sang, cicatrisera lentement et entraînera une déhiscence.
6. Attachez la suture en utilisant des noeuds carrés, comme s'il s'agissait d'un simple point interrompu, sauf que seul le brin court est coupé, laissant environ une queue de 3-4 mm.
7. Une fois que le premier point a été attaché, préparez-vous à placer un deuxième point à environ 3 mm de la première et continuez la suture en cours d'exécution.
8. Une fois la fin de l'incision atteinte, n'attimez pas complètement le dernier point. Au lieu de cela, utilisez la boucle qui est retenue avec le porte-aiguille ici comme brins courts pour attacher l'extrémité distale de la fermeture de suture.
9. En utilisant des attaches d'instruments, attachez la suture en utilisant des noeuds carrés. Il en résulte 3 brins dépassant le nœud terminé à l'extrémité distale.

5. Récupération animale

1. Injecter 2,1 mg / kg de Yohimbine intra-péritonéale après une intervention chirurgicale pour inverser l'anesthésie. UNEOn s'attend à ce que les nimaux se récupèrent complètement de la procédure chirurgicale après 3-5 heures.
2. Gardez l'animal sur un coussin chauffant (pour éviter l'hypothermie) et le lit doux absorbant après la chirurgie.
3. Fournir une réhydratation avec des liquides oraux ou parentéraux jusqu'à ce qu'il puisse revenir à l'alimentation normale (dans les 24 heures). Injecter environ 0,6 ml de solution saline normale par voie peritoneale immédiatement après la chirurgie pour limiter les effets de déshydratation.
4. Fournir une analgésie tel que décrit dans le protocole approuvé par l'IACUC sur les soins et l'utilisation des animaux. Injecter 5 mg / kg de carprofène par voie sous-cutanée pour le traitement de la douleur.
5. Surveillez régulièrement les incisions pour le gonflement, l'exsudat, la douleur ou la déhiscence.

6. Validation par imagerie par résonance magnétique

1. Effectuer des expériences d'IRM n vivo sur des scanners d'IRM à petits animaux sur le terrain.
2. Induire l'anesthésie avec 3% d'isoflurane dans l'oxygène et positionner l'animal avec le rein droit chez isocenter dans le scanner IRM et appropriéA alimenté la bobine radiofréquence. Fournir aux animaux une anesthésie à l'isoflurane à 1-2% en continu tout au long de la procédure d'imagerie par une pointe de nez.
   REMARQUE: Pour les images IRM in vivo représentées sur la figure 1 , une bobine de volume de taille de rat (diamètre intérieur = 72 mm) a été utilisée.
3. Utilisez un système de surveillance et de contrôle des animaux pour maintenir le taux de respiration de chaque animal (40-60 respirations / min) et la température corporelle du corps (35 ± 1 ° C).
4. Utiliser une acquisition d'IRM à écho de spin multicouches et multi-écho pour obtenir des images pondérées en T2 axiales et à haute résolution des reins infectés et contrôlés. Les paramètres typiques d'acquisition de l'IRM sont le temps de répétition = 5 000 ms, le temps d'écho = 40 ms, l'épaisseur de la tranche = 2,0 mm, la résolution spatiale dans le plan = 200 μm, 3 moyennes du signal et un temps d'acquisition de 8 min.

Résultats

Les techniques d'imagerie médicale offrent la possibilité d'évaluer de façon non invasive l'UTI et l'efficacité thérapeutique. Par conséquent, l'IRM a été utilisée pour valider l'induction d'une infection aiguë après injection de 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli et pour visualiser les changements dans le rein avant et après la chirurgie. La figure 1a-b montre une région d'infection rénale qui augmente progressive...

Discussion

La pyélonéphrite aiguë ascendante chez les rongeurs (c.-à-d. Les souris et les rats) peut être produite par un cathétérisme transurétral. ^{16 , 17 , 18} Cette méthode d'infection transurétrale est avantageuse en ce qu'elle est non invasive et imite la pathophysiologie humaine de l'infection ascendante. ^{17 , 18 , ...}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR