Injecção Intrarenal de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Em um modelo de rato de peleonefrite

Resumo

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Resumo

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Introdução

Os modelos de roedores têm sido utilizados para estudar numerosas manifestações de doenças humanas, incluindo pielonefrite e infecções do trato urinário (UTI). As UTIs são um problema de saúde global e podem afetar crianças, homens e mulheres de todas as idades. ^{1 , 2 , 3} A manifestação inicial de UTIs inclui cistite, e se a infecção ascende ao longo do ureter, pode ocorrer uma infecção renal (pielonefrite). Ao mesmo tempo, a prevalência de diabetes está se aproximando de 400 milhões de pessoas em todo o mundo. ^{4 , 5} Importante, a incidência de UTI pode ser até 4 vezes maior em pacientes obesos ou com diabetes mellitus tipo 2, resultando em maior risco de infecção recorrente de UTI (rUTI), sepse, fibrose renal de pielonefrite e disfunção da bexiga. ^{6 , 7 , 8} RoedorOs modelos são importantes no estudo de UTI, porque as terapias antibióticas atuais produzem uma resposta preventiva sustentada somente em um subconjunto de pacientes com UTI. Para melhorar o atendimento clínico de UTI, os principais passos são compreender o mecanismo da rUTI e seus processos fisiopatológicos de infecção aguda a inflamação à fibrose, bem como o impacto do diabetes mellitus tipo 2.

O objetivo de melhorar os modelos animais é desenvolver técnicas que permitam uma avaliação mais precisa da progressão da doença e das intervenções terapêuticas. Várias abordagens diferentes foram empregadas para induzir pielonefrite em ratos e / ou camundongos para estudar a fisiopatologia do dano renal, o efeito do tratamento antibiótico e outros aspectos do curso natural das UTIs. Uma abordagem comum para estabelecer UTI retrógrada é o cateterismo transuretral. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Este método introduz bactérias através da uretra na bexiga urinária de animais anestesiados. Embora esta técnica simula de perto a pielonefrite humana, a incidência real e a magnitude da infecção por pielonefrite podem ser altamente variáveis ​​devido a múltiplos fatores, incluindo a falta de refluxo ureteriano espontâneo ou micção urinária durante ou imediatamente após a inoculação. ¹¹ Como resultado, a variabilidade experimental na indução de uma infecção de pielonefrite ascendente pode limitar a utilidade deste modelo para estudar infecções renais, bem como estratégias terapêuticas.

Este relatório descreve um modelo de rato de pielonefrite cirúrgico onde E. coli é diretamente injetado no rim do rato. Apesar de este modelo de rato ser invasivo, a quantidade de E. coli administrada ao rim pode ser efetivamente controlada, possibilitando uma infecção e inflamação robusta do rim. ¹⁴ Dentro deste procedimento, também descrevemosComo essas infecções renais induzidas podem ser monitoradas longitudinalmente com a Ressonância Magnética In vivo (MRI).

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais (IACUC) na Case Western Reserve University. A duração do procedimento cirúrgico descrito abaixo é de aproximadamente 45-60 min. O procedimento de ressonância magnética em si é de aproximadamente 15 min para cada ponto do tempo.

1. Anestesia

1. Anestesiar o rato na câmara de isoflurano ajustada a 2% de isoflurano misturado com oxigênio para facilitar o manuseio e restrição de animais antes da administração de anestesia injetável intraperitoneal.
2. Após 3-5 minutos de exposição ao isoflurano, verifique se o animal é anestesiado e não exibe resposta à pitada do dedo do pé.
3. Mais rato sedado com injeção intraperitoneal de uma mistura de xilazina e cetamina: 75 mg / kg de cetamina / 10 mg / kg de xilazina. Ao realizar injeções intraperitoneais, retire a agulha para garantir que partes do intestino ou outros órgãos vitais não tenham sido perfurados.
4. EuNjeção 2 mg / kg de bupivacaína subcutaneamente no local da incisão para fornecer alívio da dor tópica.

2. Preparação da área cirúrgica

1. Esterilizar instrumentos e suprimentos cirúrgicos antes de serem utilizados para cirurgia e colocar na almofada cirúrgica para esterilidade. A maioria dos instrumentos e suprimentos podem ser autoclavados e reutilizados.
2. Use luvas estéreis para todos os procedimentos cirúrgicos.
3. Use uma lâmina elétrica para raspar a pele do lado direito do animal. Raspar o animal do fundo da caixa torácica até o topo da perna traseira proporcionando uma grande área livre de cabelo para a incisão.
4. Coloque o animal em uma almofada cirúrgica estéril para isolar a área desinfectada das áreas circundantes.
5. Esfregue a pele com um desinfetante, como povidona iodo ou betadina. Comece a esfregar no centro do local cirúrgico e se mova para o exterior de forma circular. Repita pelo menos três vezes com uma nova limpeza de povidona iodo ou betadina.
6. Esfregue o local cirúrgico com 70% de cotonete com álcool até a pele ficar clara, pois o iodo pode ser tóxico se for absorvido.

3. Procedimento cirúrgico

1. Mantenha este procedimento em condições assépticas.
2. Posicione o animal anestesiado em uma cama de aquecimento quente na posição de decúbito lateral esquerdo com o flanco direito voltado para cima.
   NOTA: Deve-se ter cuidado para manter a temperatura corporal central do animal a 35-37 ° C para prevenir a hipotermia. Esta cama de aquecimento também deve ser esterilizada conforme necessário para manter condições assépticas.
3. Sinta-se para a caixa torácica e faça uma pequena incisão retroperitoneal dorsal direita de 2-3 cm usando uma lâmina de bisturi esterilizada de tamanho 10 começando no fundo da caixa torácica.
4. Coloque a gaze estéril longitudinalmente ao longo de cada lado da incisão.
5. Dissecte o tecido subcutâneo, gordura e músculos para visualizar e acessar a cavidade abdominal. Use tesoura de ponta curvada para permitir uma penetração mais profundaRacionar em ferida e cortar tecidos grossos.
6. Uma vez que o fígado é claramente visível e acessível, use fórceps sem corte para retrair o fígado para cima.
7. Usando outro par de fórceps contundentes, por outro lado, exponha o rim direito, então fica sentado fora da cavidade abdominal.
8. Use o ponteiro do dedo e o polegar da mão esquerda para segurar o rim na posição. Com a mão direita, injete lentamente e de forma constante 0,1 ml de solução de E. coli UTI89 (concentração entre 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) de uma seringa estéril para a pelve renal (que aparece como uma bolha branca) ¹⁵ .
   NOTA: Prepare o título bacteriano conforme descrito na referência ¹⁵ .
9. Coloque uma tira de hemostato absorvível sobre a agulha para evitar a saída de inóculo no peritoneu. Puxe lentamente a agulha para fora da pelve renal.
   NOTA: Deve-se ter cuidado para não perfurar ou infectar os tecidos circundantes, resultando em infecções fora do alvoOns e / ou complicações.
10. Use uma seringa maior para enxaguar completamente o rim com solução salina normal antes de colocá-lo de volta na cavidade abdominal.

4. Suturas

Nota: A sutura que será enterrada nos tecidos deve ser 4-0 sutura trançada não absorvível. Suturas absorventes ou monofilamentos podem ser utilizadas para superfícies do corpo.

1. Coloque as suturas de forma uniforme e tão perto da borda do tecido quanto possível para evitar a obstrução do fluxo sanguíneo; Normalmente não é necessário mais de 0,3 cm da borda.
2. Segure a pele e evite-a ligeiramente usando um par de fórceps com dentes finos e gire o suporte da agulha em uma posição pronada em preparação para perfurar a pele.
3. Dirija a agulha através da espessura total da pele, supinando o pulso para girar a agulha e passá-la através da pele.
4. Repita este processo para a borda da pele mais próxima do indivíduo que executa o procedimento.
5. ApertarAs suturas são suficientes para se opor às bordas dos tecidos. Qualquer mais apertado irá obstruir o suprimento de sangue, cicatrização lenta e pode resultar em deiscência.
6. Amarre a sutura usando nós quadrados, como se fosse um simples ponto interrompido, exceto que apenas a corda curta é cortada, deixando cerca de uma cauda de 3-4 mm.
7. Após o primeiro ponto ter sido amarrado, prepare-se para colocar um segundo ponto a cerca de 3 mm de distância do primeiro e continue com a sutura em execução.
8. Uma vez que o fim da incisão é atingido, não puxe o último ponto completamente. Em vez disso, use o loop que está sendo mantido com o suporte da agulha aqui como a corda curta para amarrar a extremidade distal do fechamento da sutura.
9. Usando laços do instrumento, amarre a sutura usando nós quadrados. Isso resulta em 3 strands que sobrescrevem do nó preenchido na extremidade distal.

5. Recuperação de animais

1. Injete 2,1 mg / kg de Yohimbina intraperitonealmente após a cirurgia para reverter a anestesia. UMAEspera-se que os nimais se recuperem completamente do procedimento cirúrgico após 3-5 horas.
2. Mantenha o animal em uma almofada de aquecimento (para evitar hipotermia) e roupa de cama suave absorvente após a cirurgia.
3. Fornecer reidratação com líquidos orais ou parenterais até que ele possa retornar à alimentação normal (dentro de 24 horas). Injetar aproximadamente 0,6 ml de solução salina normal peritonealmente imediatamente após a cirurgia para limitar os efeitos de desidratação.
4. Forneça analgesia conforme descrito no protocolo de uso e cuidado de animais aprovado pela IACUC. Injete 5 mg / kg de carprofen por via subcutânea para o tratamento da dor.
5. Monitorar incisões regularmente para inchaço, exsudato, dor ou deiscência.

6. Validação por imagem de Ressonância Magnética

1. Realizar i n vivo em experiências MRI alto campo animal pequeno ressonância magnética.
2. Induzir anestesia com 3% de isoflurano em oxigênio e posicionar o animal com o rim direito no isocentro no scanner MRI e apropriadoComia bobina de radiofrequência. Fornecer animais com 1-2% de anestesia com isoflurano continuamente ao longo do procedimento de imagem por meio de uma nosecone.
   NOTA: Para as imagens de MRI in vivo mostradas na Figura 1 , utilizou-se uma bobina de volume de tamanho de rato (diâmetro interno = 72 mm).
3. Use um sistema de monitoramento e controle de animais para manter a taxa de respiração de cada animal (40-60 respirações / min) e temperatura corporal central (35 ± 1 ° C).
4. Use uma aquisição de MRI de eco de rotação multi-fatia e multi-eco para obter imagens ponderadas axiais de alta resolução de ambos os rins infectados e de controle. Os parâmetros típicos de aquisição de MRI são o tempo de repetição = 5,000 ms, tempo de eco = 40 ms, espessura da fatia = 2,0 mm, resolução espacial no plano = 200 μm, 3 médias de sinal e um tempo de aquisição de 8 min.

Resultados

As técnicas de imagem médica oferecem a oportunidade de avaliar de forma não invasiva UTI e eficácia terapêutica. Portanto, a RM foi utilizada para validar a indução de infecção aguda após a injeção de 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli e para visualizar as alterações no rim antes e após a cirurgia. A Figura 1a-b mostra uma região progressivamente crescente de infecção renal (setas amarelas). As imagens de ressonância magnética obtidas para ...

Discussão

A pielonefrite aguda ascendente em roedores (por exemplo, ratos e ratos) pode ser produzida por cateterismo transuretral. ^{16 , 17 , 18} Este método de infecção transuretral é vantajoso por não ser invasivo e simula a fisiopatologia humana da infecção ascendente. ^{17 , 18 , 19 , 20} No ent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR