Intrarenale Injektion von<em&gt; Escherichia coli</em&gt; In einem Rattenmodell der Pyelonephritis

Zusammenfassung

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Zusammenfassung

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Einleitung

Nagetier-Modelle wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Erkrankungen Manifestationen, einschließlich Pyelonephritis und Harnwegsinfektionen (UTI) zu studieren. UTIs sind ein globales Gesundheitsproblem und können Kinder, Männer und Frauen aller Altersstufen beeinflussen. ^{1 , 2 , 3} Die anfängliche Manifestation von UTIs umfasst Zystitis, und wenn die Infektion entlang des Harnleiters steigt, kann eine Niereninfektion (Pyelonephritis) folgen. Gleichzeitig nähert sich die Prävalenz von Diabetes 400 Millionen Menschen weltweit. ^{4 , 5} Wichtig ist, dass die UTI-Inzidenz bei Patienten, die fettleibig sind oder einen Typ-2-Diabetes mellitus haben, bis zu 4-mal höher sein kann, was zu einem erhöhten Risiko einer rezidivierenden UTI-Infektion (RUTI), Sepsis, Nierenfibrose aus Pyelonephritis und Blasenfunktionsstörungen führt. ^{6 , 7 , 8} NagetierModelle sind wichtig für das Studium von UTIs, da aktuelle Antibiotika-Therapien eine nachhaltige, präventive Reaktion nur in einer Teilmenge von UTI-Patienten produzieren. Zur Verbesserung der klinischen UTI-Pflege sind die wichtigsten Schritte, um den Mechanismus von RUTI und seine pathophysiologischen Prozesse von akuten Infektionen bis hin zur Entzündung der Fibrose sowie die Auswirkungen von Typ-2-Diabetes mellitus zu verstehen.

Das Ziel der Verbesserung der Tiermodelle ist die Entwicklung von Techniken, die eine genauere Bewertung der Krankheitsprogression und therapeutische Interventionen ermöglichen. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Pyelonephritis bei Ratten und / oder Mäusen zu induzieren, um die Pathophysiologie der Nierenschäden, die Wirkung der Antibiotika-Behandlung und andere Aspekte des natürlichen Verlaufs von UTIs zu untersuchen. Eine gemeinsame Herangehensweise, um retrograde UTI zu etablieren, ist die transurethrale Katheterisierung. ^{10 , 11 , 12 , 13 <}/ Sup> Diese Methode führt Bakterien über die Harnröhre in die Harnblase der betäubten Tiere ein. Während diese Technik die menschliche Pyelonephritis genau simuliert, kann die tatsächliche Inzidenz und Größe der Pyelonephritis-Infektion sehr variabel sein, da mehrere Faktoren, einschließlich des Mangels an spontanem ureterischem Reflux oder Harnverhalten während oder unmittelbar nach der Inokulation. ¹¹ Als Ergebnis kann die experimentelle Variabilität bei der Induktion einer aufsteigenden Pyelonephritis-Infektion den Nutzen dieses Modells einschränken, um Niereninfektionen sowie therapeutische Strategien zu untersuchen.

Dieser Bericht beschreibt ein chirurgisches Pyelonephritis-Rattenmodell, bei dem E. coli direkt in die Rattenniere injiziert wird. Trotz dieses Rattenmodells, das invasiv ist, kann die Menge an E. coli, die an die Niere abgegeben wird, effektiv kontrolliert werden, was eine robuste Niereninfektion und eine Entzündung ermöglicht. ¹⁴ In diesem Verfahren beschreiben wir auchWie diese induzierten Niereninfektionen in Längsrichtung mit in vivo Magnetresonanztomographie (MRT) überwacht werden können.

Protokoll

Alle Tierstudien wurden nach den genehmigten Protokollen des örtlichen Tierpflege- und -nutzungsausschusses (IACUC) an der Case Western Reserve University durchgeführt. Die Dauer des nachstehend beschriebenen chirurgischen Verfahrens beträgt ca. 45-60 min. Die MRT-Prozedur selbst beträgt ca. 15 min für jeden Zeitpunkt.

1. Anästhesie

1. Anästhesieren Sie die Ratte in der Isoflurankammer, die auf 2% Isofluran eingestellt ist, um mit dem Tier gemischt zu werden, um die Tierbehandlung und die Zurückhaltung zu erleichtern, bevor die injizierbare Anästhesie intraperitoneal verabreicht wird.
2. Nach 3-5 min Exposition gegenüber Isofluran ist zu prüfen, ob das Tier anästhesiert ist und keine Reaktion auf Zehenknecht zeigt.
3. Weitere sedierte Ratte mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Xylazin und Ketamin: 75 mg / kg Ketamin / 10 mg / kg Xylazin. Bei der Durchführung von intra-peritonealen Injektionen, ziehen Sie die Nadel zurück, um sicherzustellen, dass Teile des Darms oder anderer lebenswichtiger Organe nicht punktiert wurden.
4. ich2 mg / kg Bupivacain subkutan an der Stelle des Einschnitts injizieren, um eine topische Schmerzlinderung zu liefern.

2. Vorbereitung des chirurgischen Bereichs

1. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente und Vorräte, bevor sie für die Chirurgie verwendet werden und legen Sie auf dem chirurgischen Pad für Sterilität. Die meisten Instrumente und Zubehör können autoklaviert und wiederverwendet werden.
2. Verwenden Sie sterile Handschuhe für alle chirurgischen Eingriffe.
3. Verwenden Sie ein elektrisches Rasiermesser, um das Fell von der rechten Seite des Tieres zu rasieren. Rasiere das Tier von der Unterseite des Brustkorbes bis zur Oberseite des Hinterbeins, was einen großen haarfreien Bereich für den Schnitt bietet.
4. Lege das Tier auf eine sterile chirurgische Auflage, um den desinfizierten Bereich von den umliegenden Gebieten zu isolieren.
5. Die Haut mit einem Desinfektionsmittel wie Povidonjod oder Betadin scheuern. Starten Sie das Schrubben in der Mitte des chirurgischen Geländes und bewegen Sie sich kreisförmig nach außen. Wiederholen Sie mindestens dreimal mit einem neuen Tuch von Povidon Jod oder Betadin.
6. Schrubben Sie die chirurgische Stelle mit 70% Alkoholtupfern, bis die Haut klar ist, da Jod giftig ist, wenn es absorbiert wird.

3. Chirurgische Vorgehensweise

1. Halten Sie diese Vorgehensweise unter aseptischen Bedingungen ein.
2. Das anästhesierte Tier auf ein warmes Heizbett in der linken seitlichen Dekubitusposition bringen, wobei die rechte Flanke nach oben zeigt.
   HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die Kerntemperatur des Tieres bei 35-37 ° C gehalten wird, um eine Unterkühlung zu verhindern. Dieses Erwärmungsbett sollte auch nach Bedarf sterilisiert werden, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
3. Fühlen Sie sich für den Brustkorb und machen Sie einen kleinen 2-3 cm rechten dorsalen retroperitonealen Einschnitt mit einer sterilen Größe 10 Skalpell Klinge beginnend am unteren Rand des Brustkorbes.
4. Lege sterile Gaze in Längsrichtung auf beiden Seiten des Schnittes.
5. Das subkutane Gewebe, Fett und Muskeln zerlegen, um die Bauchhöhle zu visualisieren und zugänglich zu machen. Verwenden Sie eine gekrümmte Mayo-Schere, um tieferes Penet zuzulassenRation in Wunde und schneiden dicke Gewebe.
6. Sobald die Leber deutlich sichtbar und zugänglich ist, verwenden Sie stumpfe Pinzette, um die Leber nach oben zurückzuziehen.
7. Mit einem anderen Paar von stumpfen Pinzetten in der anderen Hand, stellen Sie die richtige Niere, so dass es sitzt gerade außerhalb der Bauchhöhle.
8. Benutze den Zeiger Finger und Daumen der linken Hand, um die Niere in Position zu halten. Mit der rechten Hand langsam und stetig 0,1 ml UTI89 E. coli- Lösung (Konzentration zwischen 1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ) aus einer sterilen Spritze in das Nierenbecken (das als weiße Blase erscheint) einspritzen ¹⁵ .
   HINWEIS: Den Bakterientiter wie in Referenz ¹⁵ beschrieben vorbereiten.
9. Legen Sie einen Streifen absorbierbaren Hämostat über die Nadel, um den Ausfluss des Inokulums in das Peritoneum zu verhindern. Ziehen Sie langsam die Nadel aus dem Nierenbecken.
   HINWEIS: Es ist darauf zu achten, dass die umlaufenden Gewebe nicht durchbohrt oder infiziert werden, was zu einem Ziel-Infecti führtOns und / oder komplikationen.
10. Verwenden Sie eine größere Spritze, um die Niere gründlich mit normaler Kochsalzlösung zu spülen, bevor Sie sie wieder in die Bauchhöhle legen.

4. Nähte

Anmerkung: Naht, die in Geweben begraben wird, sollte 4-0 nicht resorbierbare geflochtene Nähte sein. Für Körperoberflächen können absorbierbare oder monofile Nähte verwendet werden.

1. Setzen Sie die Nähte gleichmäßig und so nah wie möglich an die Gewebekante, um eine Verstopfung des Blutflusses zu verhindern. Typischerweise ist nicht mehr als 0,3 cm von der Kante notwendig.
2. Fassen Sie die Haut an und verjüngen Sie sie leicht mit einem Paar feiner Zahnpinzette und drehen Sie den Nadelhalter in eine pronierte Position in Vorbereitung für das Durchstechen der Haut.
3. Führen Sie die Nadel durch die volle Dicke der Haut, indem Sie das Handgelenk anspannen, um die Nadel zu drehen und es durch die Haut zu führen.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Hautkante, die dem Einzelnen am nächsten liegt.
5. SpannenDie Nähte genug, um den Gewebekanten entgegenzutreten. Je enger wird die Blutversorgung versperren, langsame Wundheilung und kann zu Dehiszenzen führen.
6. Binden Sie die Naht mit quadratischen Knoten, als ob es eine einfache unterbrochene Stich wäre, außer dass nur der kurze Strang geschnitten wird, so dass ein 3-4 mm Schwanz.
7. Nachdem die erste Masche abgebunden ist, bereite ich mich vor, um eine zweite Masche ca. 3 mm von der ersten weg zu setzen und die laufende Naht fortzusetzen.
8. Sobald das Ende des Einschnitts erreicht ist, ziehen Sie nicht die letzte Stich vollständig durch. Verwenden Sie stattdessen die Schlaufe, die mit dem Nadelhalter hier als Kurzstrang gehalten wird, um das distale Ende des Nahtverschlusses zu verkleben.
9. Mit Instrumentenbindungen, binden Sie die Naht mit quadratischen Knoten. Dies führt dazu, dass 3 Stränge aus dem fertigen Knoten am distalen Ende aufstehen.

5. Tierrückgewinnung

1. Injizieren Sie 2,1 mg / kg Yohimbin intra-peritoneal nach der Operation, um die Anästhesie umzukehren. EINNimals wird erwartet, um vollständig von der chirurgischen Prozedur nach 3-5 Stunden zu erholen.
2. Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen (um Hypothermie zu vermeiden) und saugfähige weiche Bettwäsche nach der Operation.
3. Rehydrierung mit oralen oder parenteralen Flüssigkeiten bereitstellen, bis es zur normalen Fütterung zurückkehren kann (innerhalb von 24 Stunden). Injektion von etwa 0,6 ml normaler Kochsalzlösung sofort nach der Operation, um die Dehydratationseffekte zu begrenzen.
4. Bereitstellung von Analgesie, wie im IACUC zugelassenen Tierpflege- und Verwendungsprotokoll beschrieben. 5 mg / kg Carprofen subkutan zur Schmerztherapie injizieren.
5. Überwachen Sie die Schnitte regelmäßig auf Schwellungen, Exsudate, Schmerzen oder Dehiszenzen.

6. Validierung mittels Magnetresonanztomographie

1. Führen Sie i n vivo MRT-Experimente auf Hochfeld-Kleintier-MRT-Scannern durch.
2. Anästhesie mit 3% Isofluran in Sauerstoff induzieren und das Tier mit der rechten Niere bei Isocenter im MRT-Scanner positionieren und entsprechendeAte Hochfrequenzspule. Bereitstellung von Tieren mit 1-2% Isofluran-Anästhesie kontinuierlich während des Imaging-Verfahrens über einen Nosecone.
   HINWEIS: Für die in Fig. 1 gezeigten in vivo- MRI-Bilder wurde eine Rattenvolumenspule (Innendurchmesser = 72 mm) verwendet.
3. Verwenden Sie ein Tierüberwachungs- und Kontrollsystem, um die Atmungsrate jedes Tieres (40-60 Atemzüge / min) und die Kernkörpertemperatur (35 ± 1 ° C) aufrechtzuerhalten.
4. Verwenden Sie eine Multi-Slice-, Multi-Echo-Spin-Echo-MRT-Erfassung, um hochauflösende, axiale T2-gewichtete Bilder sowohl der infizierten als auch der Kontroll-Nieren zu erhalten. Typische MRT-Erfassungsparameter sind Wiederholungszeit = 5.000 ms, Echozeit = 40 ms, Scheibendicke = 2,0 mm, flache Raumauflösung = 200 μm, 3 Signaldurchschnitte und eine Erfassungszeit von 8 min.

Ergebnisse

Medizinische Bildgebungsverfahren bieten die Möglichkeit, die UTI und die therapeutische Wirksamkeit nicht invasiv zu beurteilen. Daher wurde MRT verwendet, um die Induktion einer akuten Infektion nach der Injektion von 1-2 x 10 ⁷ UTI89 E. coli zu validieren und die Veränderungen in der Niere vor und nach der Operation zu visualisieren. Abbildung 1a-b zeigt eine zunehmend zunehmende Region der Niereninfektion (gelbe Pfeile). MRT-Bilder, die für jed...

Diskussion

Aufsteigende akute Pyelonephritis bei Nagetieren (dh Mäusen und Ratten) kann durch transurethrale Katheterisierung hergestellt werden. ^{16 , 17 , 18} Diese transurethrale Infektionsmethode ist insofern vorteilhaft, als sie nicht invasiv ist und die menschliche Pathophysiologie der aufsteigenden Infektion nachahmt. ^{17 , 18 , 19} ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR