腎内注射<em&gt;大腸菌</em&gt;腎盂腎炎のラットモデル

要約

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

要約

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

概要

齧歯類モデルは、腎盂腎炎および尿路感染症（UTI）を含む多数のヒト疾患の症状を研究するために使用されている。 UTIは世界的な健康問題であり、すべての年齢の子供、男性、および女性に影響を与える可能性があります。 ^1、2、3のUTIの初期症状は、膀胱炎を含む、感染は尿管に沿って上昇した場合、腎臓感染（腎盂腎炎）が続いてもよいです。同時に、糖尿病の罹患率は世界中で4億人に達しています。 ^4、5重要なことに、UTIの発生率がアップ肥満であるか、または再発性UTI感染（rUTI）、敗血症、腎盂腎炎から腎線維症、及び膀胱機能不全の危険性の増大をもたらす、2型糖尿病を有する患者の4倍であることができます。 ^6、7、8げっ歯類現在の抗生物質療法はUTI患者のサブセットにおいてのみ持続的かつ予防的応答を生じるため、モデルはUTIの研究において重要である。臨床UTIケアを改善するために、主要なステップは、急性感染から炎症、線維症へのrUTIおよびその病態生理学的プロセスのメカニズムならびに2型糖尿病の影響を理解することである。

動物モデルを改善する目的は、疾患の進行および治療的介入のより正確な評価を可能にする技術を開発することである。ラットおよび/またはマウスにおいて、腎臓損傷の病態生理学、抗生物質治療の効果、およびUTIの自然経過の他の側面を研究するために、腎盂腎炎を誘発するためにいくつかの異なるアプローチが用いられてきた。逆行性UTIを確立するための一般的なアプローチは経尿道カテーテル法である。 ^{10、11、12、13 <}この方法は、麻酔した動物の膀胱に尿道を介して細菌を導入する。この技術はヒト腎盂腎炎と非常によく似ていますが、腎盂腎炎感染の実際の発生率と規模は、接種中または直後の自然尿管逆流または尿排尿の欠如を含む複数の要因のため、 ¹¹その結果、昇順腎盂腎炎の感染を誘導する実験的な変動は、腎臓の感染症などの治療戦略を研究するために、このモデルの有用性を制限することができます。

この報告では、 大腸菌をラット腎臓に直接注射する外科的腎盂腎炎ラットモデルが記載されている。このラットモデルが侵襲的であるにもかかわらず、腎臓に送達される大腸菌の量は効果的に制御され、強力な腎臓感染および炎症を可能にする。 ¹⁴この手順の中で、我々はまた、記述これらの誘発された腎臓感染を、生体内磁気共鳴画像法（MRI）で縦方向にどのように監視することができるかを示す。

プロトコル

すべての動物実験は、Case Western Reserve Universityで承認された動物実験および使用委員会（IACUC）のプロトコールに従って実施した。以下に記載される外科的処置の持続時間は、約45〜60分である。 MRI手順自体は、各時点で約15分である。

1.麻酔

1. 注射可能な麻酔を腹腔内投与する前に、動物の取り扱いおよび拘束を容易にするために、イソフルランチャンバーを酸素と混合した2％イソフルランでラットを麻酔する。
2. イソフルランに3〜5分間暴露した後、動物が麻酔され、つま先にピンチに反応しないことを確認する。
3. キシラジンとケタミンの混合物の腹腔内注射：75mg / kgケタミン/ 10mg / kgキシラジンを用いてラットをさらに鎮静させる。腹腔内注射を行う際には、腸やその他の重要な器官の一部に穿刺されていないことを確認するために針を引き戻します。
4. 私切開部位に2mg / kgのブピバカインを皮下投与して、局所的な痛みを軽減する。

2.外科手術領域の準備

1. 外科用器具および消耗品を手術前に滅菌し、滅菌のために外科用パッド上に配置する。ほとんどの器具および消耗品は、オートクレーブして再使用することができます。
2. すべての外科手術に無菌手袋を使用する。
3. 動物の右側から毛皮を剃るために電気かみそりを使用してください。胸郭の底から後ろの脚の上まで動物を剃り、切開のための大きなヘアフリーエリアを提供する。
4. 消毒された外科用パッドの上に動物を置き、消毒された領域を周囲の領域から隔離する。
5. ポビドンヨードやベタジンなどの消毒剤で皮膚を擦る。手術部位の中心でスクラビングを開始し、円形に外側に移動する。ポビドンヨードまたはベタジンの新しいワイプで少なくとも3回繰り返します。
6. 皮膚が透明になるまで、70％のアルコール綿棒で手術部位を擦る。ヨウ素が吸収されると毒性を示すことがある。

3.手術手順

1. 無菌条件下でこの手順を維持する。
2. 麻酔した動物を暖かい床の上に置いて、右腹を上にして左臥位にする。
   注：低体温を防ぐために、動物の中核体温を35〜37℃に維持するように注意する必要があります。この加温ベッドは、無菌状態を維持するために必要に応じて滅菌する必要があります。
3. 胸郭のために感じ、胸郭の底部から始まる滅菌されたサイズ10のメスの刃を使用して、右後部背部の腹腔内の小さな2〜3cmの切開を行う。
4. 切開の両側に滅菌ガーゼを縦に置きます。
5. 腹腔を視覚化してアクセスするために、皮下組織、脂肪、および筋肉を切除する。湾曲した羽毛のはさみを使用してより深く浸透させる傷口に入れ、厚い組織を切る。
6. 肝臓がはっきりと見えてアクセス可能になったら、鈍い鉗子を用いて肝臓を上方に収縮させる。
7. 一方、鈍い鉗子の別のペアを使用して、それは腹腔のすぐ外に座るように右の腎臓を公開する。
8. 腎臓を所定の位置に保持するには、指の指と左手の親指を使用します。右手でゆっくりとしっかりとゆっくりと着実に滅菌注射器からUTI89 大腸菌溶液（濃度は1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ）を腎盂（白い泡として現れる）に注入する¹⁵ 。
   注：参考文献^15に記載されているように、細菌力価を調製する。
9. 腹膜への接種物の流出を防ぐために、吸収性止血剤のストリップを針の上に置く。ゆっくりと腎盂から針を抜き取る。
   注：周辺組織に穴をあけたり感染させたりしないでください。その結果、標的外の感染が起こりますオンザ及び/又は合併症を引き起こす。
10. 大型注射器を使用して腹腔内に戻す前に、腎臓を生理食塩水で十分にすすいでください。

4.縫合

注：組織に埋め込まれる縫合糸は、4-0の非吸収性編組縫合糸でなければなりません。身体表面に吸収性またはモノフィラメント縫合糸を使用することができる。

1. 血流の閉塞を防ぐために、縫合糸をできるだけ均等に、組織の縁の近くに置く。典型的には縁から0.3cm以下が必要である。
2. 皮膚をつかみ、細かい歯の鉗子を使って軽く傷つけ、針のホルダーを回して皮膚を刺す準備をします。
3. 手首を動かして針を回転させ、皮膚に通すことによって、皮膚の全厚を通して針を駆動する。
4. プロシージャを実行する個人に最も近いスキンエッジに対してこのプロセスを繰り返します。
5. 締める組織の縁に十分に縫合することができる。どんなに硬くても、血液供給が遅くなり、創傷治癒が遅くなり、裂開することになります。
6. 短い鎖だけが切断され、約3〜4 mmの尾を残すことを除いて、単純な中断された縫い目のように、正方形の結び目を使用して縫合糸を結ぶ。
7. 最初のステッチを締め込んだ後、最初のステッチを約3mm離して準備し、実行中の縫合を続けます。
8. 切開の終わりに達すると、最後のステッチを完全に引っ張らないでください。代わりに、ここではニードルホルダーで保持されているループを短いストランドとして使用して、縫合閉鎖の遠位端を結ぶ。
9. 器具の結び目を使用して、正方形の結び目を使用して縫合糸を結びます。これにより、3つのストランドが遠位端の完成した結び目から突き出てしまう。

5.動物の回復

1. 手術後に麻酔を逆行させるために、2.1mg / kgヨヒンビンを腹腔内に注射する。 A3~5時間後に外科処置から完全に回復することが期待される。
2. 動物は暖房パッド（低体温症を避けるため）と吸収剤の柔らかい寝具の手術後に保管してください。
3. 通常の授乳に戻るまで（24時間以内）、経口または非経口の液体で再水和を行います。脱水効果を制限するために、手術直後に約0.6mlの生理食塩水溶液を腹膜内に注射する。
4. IACUCが承認したAnimal Care and Use Protocolに記載されているように鎮痛剤を提供する。疼痛管理のために皮下に5mg / kgのカルプロフェンを注射する。
5. 腫れ、滲出、痛み、裂開のために定期的に切開を監視する。

磁気共鳴イメージング経由 6.検証

1. ハイフィールド小動物MRIスキャナーで生体内 MRI実験を行う。
2. 麻酔を酸素中のイソフルラン3％で行い、MRIスキャナー内のアイソセンタで適切な腎臓に動物を配置し、適切にするラジオ周波数のコイルを食べた。動物にノセコンを介して連続的に1％〜2％のイソフルラン麻酔を与える。
   注記： 図1に示すインビボ MRI画像では、ラットサイズのボリュームコイル（内径= 72mm）を利用した。
3. 各動物の呼吸速度（40〜60呼吸/分）および中核体温（35±1℃）を維持するために、動物監視および制御システムを使用する。
4. 感染した腎臓とコントロール腎臓の両方の高分解能、軸方向のT2強調画像を得るには、マルチスライス、マルチエコースピンエコーMRI撮影を使用します。典型的なMRI取得パラメータは、反復時間= 5000msec、エコー時間= 40msec、スライス厚さ= 2.0mm、面内空間分解能=200μm、3つの信号平均、および8分間の取得時間である。

結果

医療画像技術は、非侵襲的にUTIおよび治療効果を評価する機会を提供する。したがって、MRIを利用して、1〜2×10 ⁷個のUTI89 大腸菌の注射後の急性感染の誘導を確認し、手術前後の腎臓の変化を視覚化した。 図1a-bは、腎臓感染の漸増領域（黄色の矢印）を示す。感染後1および4日目に各動物について得られたMRI画像は、急性腎盂腎炎感染の成...

ディスカッション

げっ歯類（すなわち、マウスおよびラット）における急性腎盂腎炎の上昇は経尿道カテーテル法によって生じ得る。それは上昇感染症の非侵襲的および模倣ヒト病態である^{16、17、18、}この経尿道感染法が有利です。 ^{17、18、19、20...}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbing Pad	Fisher	14-127-47
Sterile Cotton Gauze Pad	Fisher	22-415-469
Latex Surgical Gloves	Henry Schein Animal Health	21540
Curved Mayo Scissors	Fisher	S17341
Straight Blunt Foreceps	Fisher	08-895
Scalpel Handle	Fisher	08-913-5
Sterile Scalpel Blades	Fisher	53220
1 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	309628	For bacterial injections
20 ml Luer-Lok Syringe	BD Biosciences	301031	For saline wash
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in. Needle	BD Biosciences	305143
30 G 1 in. Needle	BD Biosciences	305128
U-100 Insulin Syringe	Exel International	25846	For medication injections
Isoflurane	Henry Schein Animal Health	050033
Xylazine	Henry Schein Animal Health	33197	Inject IP
Ketamine	Patterson Vetrinary	07-881-9413	Inject IP
Yohimbine (Atipamezole)	Patterson Vetrinary	07-867-7097	Inject IP after surgery
Bupivacaine (Marcaine)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	Inject SQ at site of incision
4-0 Chromic Gut Suture	Ethicon Inc.	U203H
4-0 Braided Vicryl Suture	Ethicon Inc.	J304H
1 ml SubQ Syringe	BD Biosciences	309597
E. coli  UTI89 or CFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	Bruker	94/20 USR