JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Abstract

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Introduction

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster1. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans2. A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley3, Zou et al.4, and Dernburg et al.5. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.6. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protocol

يتم تنفيذ الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك: مذكرة. وتستخدم حاضنات التحكم في درجة حرارته للحفاظ على درجات الحرارة لتربية ذبابة ويعبر ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. التحضيرات

  1. إعداد الذباب.
    1. مجموعات بويضة طليعة الطور التالي التخصيب.
      1. الذباب الكبار واضحا من الشباب الأصحاء الأسهم أو عبر الثقافات. زجاجات العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
        ملاحظة: عموما زجاجتين صحية تكفي، على الرغم من أن أكثر قد تكون هناك حاجة لبعض الثقافات عبر.
      2. بعد يومين، وجمع ~ 100-300 الإناث (الذين هم 0-2 أيام من العمر في هذه النقطة) من الزجاجات. الإناث لا تحتاج إلى أن تكون العذارى. إضافة لمسة من معجون الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 من الإناث و 10 إلى 15 من الذكور كل في قارورة yeasted. قارورة العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
    2. الطورية التخصيب مجموعة سيت.
      1. جمع ~ 100-300 الإناث من الأسهم أو عبر الثقافيهوفاق. إضافة لمسة من معجون الخميرة إلى جانب قارورة ووضع 30 الإناث كل (مع عدم وجود الذكور المضافة) في قارورة yeasted. قارورة العمر لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
  2. إعداد الحلول.
    ملاحظة: قد تكون مخزنة حلول أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة، ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. استعد التعديل العازلة روب ل(5X): 500 ملي HEPES، 500 ملي السكروز، 275 ملي خلات الصوديوم، 200 ملي خلات البوتاسيوم، 50 ملي الجلوكوز، كلوريد المغنيسيوم 6 مم، و 5 ملي كلوريد الكالسيوم. استخدام 10 N 11: 8 هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد البوتاسيوم لجلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تعقيم عن طريق الترشيح. لا الأوتوكلاف. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد عند الحاجة لإعداد ~ 200 مل من 1X روب نصيب بويضة الإعدادية.
    2. حلول التثبيت.
      1. الخيار رقم 1: إعداد الفورمالديهايد / هيبتان التثبيت. إعداد التثبيت العازلة: مخزنة المالحة الفوسفات 1X (PBS)، بالإضافة إلى 150 ملي السكروز. لاستخدام، وجعل جديدة مع 687.5 ميكرولتر التثبيت العازلة و312.5 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايدفي الإعدادية بويضة.
        تنبيه: ارتداء قفازات أثناء استخدام حلول الفورمالديهايد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      2. الخيار رقم 2: إعداد الفورمالديهايد / كاكوديلات التثبيت. إعداد فيكس ميكس: 250 ملم السكروز، 100 ملي البوتاسيوم خلات (7.5 درجة الحموضة)، و 25 ملي خلات الصوديوم (7.0 درجة الحموضة)، و 25 ملي EGTA (8.0 درجة الحموضة). لاستخدام، وجعل جديدة مع 400 ميكرولتر إصلاح ميكس، 100 ميكرولتر كاكوديلات البوتاسيوم (1 م، ودرجة الحموضة 7.2)، و 500 ميكرولتر 16٪ الفورمالديهايد في الإعدادية بويضة.
        تنبيه: كاكوديلات البوتاسيوم يحتوي على الزرنيخ.
    3. إعداد برنامج تلفزيوني / تريتون X-100: برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 1٪ أو 0.05٪ تريتون X-100. تخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. إعداد برنامج تلفزيوني توين 20-الأبقار مصل الزلال (BSA) (PTB): برنامج تلفزيوني 1X، 0.5٪ BSA (ث ت /)، و 0.1٪ توين-20. ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
    5. مضان في حلول التهجين الموضعي (FISH).
      1. إعداد 20X الصوديوم كلوريد الصوديوم السيترات (SSC): 3 M كلوريد الصوديوم و 0.3 M سيترات الصوديوم.
      2. إعداد 2X SSC-توين-20 (SSCT): 2X SSC بالإضافة إلى 0.1٪ توين-20. جعل جديدة، ~ 20 مل لكل الإعدادية بويضة.
      3. إعداد الحلول الفورماميد: 2X SSC، 0.1٪ توين 20، بالإضافة إلى الفورماميد. جعل طازجة، 1 مل 20٪ الفورماميد، 0.5 مل 40٪ الفورماميد، و 2 مل 50٪ الفورماميد في الإعدادية بويضة.
        تنبيه: ارتداء قفازات أثناء استخدام حلول الفورماميد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
      4. يعد حل التهجين: 2X SSC، 50٪ الفورماميد، و 10٪ كبريتات ديكستران (ث / ت). تخزينها في 4 درجات مئوية.
    6. تحقيقات الأسماك.
      1. [أليغنوكليوتيد النظام (انظر الجدول رقم 1 لمتواليات) مع تنقية HPLC والمرجوة 5 'تعديل فلوري (على سبيل المثال، و Cy3 أو Cy5). resuspend في تريس، EDTA (TE) في 50 نانوغرام / ميكرولتر.
        ملاحظة: حماية oligos من التعرض للضوء في جميع الأوقات.

2. جمع في وقت متأخر من مرحلة ذبابة الفاكهة البويضات

  1. مثل البويضات ذبابة الفاكهة مع الأغشية سليمة ستلتزم البلاستيك والزجاج، قبل معطف داخل أنبوب واحد 5 مل والماصة باستور واحد لكل الإعدادية بويضة مع PTB.
  2. تخدير جميع ~ 100-300 الذباب yeasted مع ثاني أكسيد الكربون وإضافة إلى خلاط تحتوي على ~ 100 مل 1X العازلة روب ل. نبض ثلاث مرات (~ 1 ثانية لكل منهما). إبقاء البويضات والتي روب ل <20 دقيقة لتجنب التنشيط.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، البويضات يمكن تسليم تشريح-من الإناث. وميزة هذا الأسلوب هو أنه يتطلب أقل من الإناث. ومع ذلك، يجب توخي الحذر للحد من التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون لبضع دقائق فقط لتجنب القطع الأثرية مرتبطة بنقص الأكسجة 7.
  3. تصفية من خلال شبكة كبيرة (~ 1500 ميكرون) إلى 250 مل دورق لإزالة أجزاء الجسم الكبيرة. إذا لا تزال العديد من بطون سليمة على مواد شبكة، وإعادة طحن باستخدام إضافية العازلة روب، ووالفلتر مرة أخرى. دعونا تسوية ~ 2 دقيقة، ثم نضح من الطبقة العليا، وإزالة أكبر عدد ممكن من أجزاء الجسم كبيرة ممكن.
  4. فايlter من خلال شبكة صغيرة (~ 300 ميكرون) في كوب 250 مل. شطف المتبقية البويضات من الكأس الأول باستخدام إضافي لروب والمغلفة باستور الماصة. دعونا تسوية ~ 3 دقائق. والبويضات يستقر بها. نضح قبالة جميع ولكن ~ 10 مل.
  5. صب أكبر قدر من 10 مل كما سوف تناسب المغلفة أنبوب 5 مل. دعونا تسوية، وإزالة السائل، وكرر مع بقية. شطف البويضات المتبقية من الدورق باستخدام إضافية روب والمغلفة باستور الماصة. دعونا تسوية في 5 مل أنبوب ل~ 3-5 دقيقة.

3. العلاج بالعقاقير (اختياري)

  1. معطف الثاني أنبوب 5 مل مع PTB لكل الإعدادية بويضة. إضافة مذيب مناسب (السيطرة) أو المخدرات إلى 1 مل روب في كل لكل الإعدادية بويضة (الجدول 2).
  2. البويضات انقسم الى المغلفة الثانية أنبوب 5 مل. دعونا تسوية، وإزالة السائل، وإضافة 1 مل من روب بالإضافة إلى المذيبات في أنبوب واحد وفي 1 مل روب بالإضافة إلى المخدرات في أنبوب الثاني. Nutate لكمية مناسبة من الوقت لمعالجة مدمني المخدرات (الجدول 2). Lوآخرون تسوية.

4. التثبيت

  1. نضح قبالة كل السائل وعلى الفور إضافة 1 مل الإصلاح.
  2. الخيار رقم 1: الفورمالديهايد / تثبيت هيبتان (التثبيت العازلة بالإضافة إلى 5٪ الفورمالديهايد).
    1. إصلاح مقابل 2.5 دقيقة على nutator. إضافة 1 مل هيبتان ودوامة 1 دقيقة. دعونا تسوية ~ 1 دقيقة.
    2. إزالة جميع السائل، ثم إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني 1X. دوامة 30 ثانية. دعونا تسوية ~ 1 دقيقة.
    3. إزالة جميع السائل، ومن ثم ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X.
      ويمكن استخدام البويضات على الفور أو تبقى على nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة: ملاحظة.
  3. الخيار رقم 2: الفورمالديهايد / كاكوديلات تثبيت (فيكس ميكس بالإضافة إلى 8٪ الفورمالديهايد و 100 كاكوديلات ملم).
    1. إصلاح لمدة 6 دقائق على nutator. دعونا تسوية 2 دقيقة. إزالة السائل، ومن ثم ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني 1X.
      ويمكن استخدام البويضات على الفور أو تبقى على nutator لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة: ملاحظة.

5. إزالة الأغشية ( "المتداول")

  1. باستخدام المغلفة باستور الماصة، إضافة ~ 500 إلى 1000 البويضات إلى الجزء بلوري (الرمال انتقد) من شريحة زجاجية. إزالة جميع أجزاء الجسم وملقط المواد باستخدام الدخيلة. لا تدع البويضات تجف. إضافة برنامج تلفزيوني 1X عند الضرورة.
  2. وضع ساترة على أعلى من البويضات وبلطف البويضات "لفة" حتى جميع أغشية يتم إزالة (سحب حافة ساترة عبر البويضات يعمل على نحو أفضل.) فحص دوري التقدم تحت المجهر، إضافة المزيد من برنامج تلفزيوني 1X الضرورة. رعاية مثل الكثير من الضغط سوف يدمر البويضات.
    ملاحظة: للحصول المناعي فقط، تستمر مع الخطوة 6. بالنسبة للأسماك (مع أو بدون المناعي)، تواصل مع الخطوة 7.

6. تلوين الأجسام المضادة من ذبابة الفاكهة البويضات

  1. استخراج والحجب
    1. شطف البويضات توالت في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على ~ 15 مل PBS / 1٪ تريتون X-100. البويضات Nutate في هذا الحل لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة ولا يزيد عن 2 ساعة.هذه الخطوة تتيح اختراق الأجسام المضادة.
    2. السماح البويضات تستقر ~ 2 دقيقة. إزالة السائل جنبا إلى جنب مع العديد من الأغشية وقت ممكن، ثم إضافة برنامج تلفزيوني / 0.05٪ تريتون X-100.
      ملاحظة: سوف الأغشية يستقر أبطأ من البويضات تدحرجت.
    3. اسمحوا البويضات تستقر ~ 2 دقيقة، ثم إزالة كافة ولكن ~ 1 مل السائل. نقل البويضات لتخرج أنبوب 1.5 مل وإزالة ما تبقى السائل. إضافة 1 مل PTB من أجل الحيلولة دون وnutate لمدة 1 ساعة.
  2. الأجسام المضادة تلطيخ
    1. قبل امتصاص الأجسام المضادة الثانوية ضد الأجنة.
      ملاحظة: هذه الخطوة يلغي تلوين الخلفية من التفاعلات الأجسام المضادة غير محددة مع البروتينات ذبابة الفاكهة.
      1. جمع وتحديد الأجنة ذبابة الفاكهة (~ 25 ميكرولتر) في إجراء نموذجي 8. تخزين في الميثانول في -20 درجة مئوية.
      2. إزالة الميثانول من الأجنة، إضافة 800 ميكرولتر الميثانول بالإضافة إلى 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X، وnutate لمدة 15 دقيقة. إزالة 500 ميكرولتر من طاف واستبدالها مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. ثم nutate لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين (أي ما مجموعه ~ 1 ساعة يغسل)، وبعد ذلك تنتهي في PTB.
        ملاحظة: الأجنة يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها على nutator لعدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      3. إزالة السائل، وملء مع PTB إلى 200 ميكرولتر في الإعدادية بويضة، وإضافة الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في التخفيفات المناسبة (مع الأخذ في الاعتبار أن الحجم النهائي سيكون 300 ميكرولتر؛ انظر الخطوة 7.4) Nutate في 4 درجات مئوية خلال الليل (الأفضل) أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات.
        ملاحظة: سيتم استخدام الأجسام المضادة استيعابها مسبقا في الخطوة 6.2.4.
        ملاحظة: حافظ على عينات في الظلام قدر الإمكان مرة واحدة تم إضافة الأجسام المضادة الفلورسنت.
    2. إزالة السائل من البويضات، وملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر وإضافة الأجسام المضادة الأولية في التخفيفات المناسبة. Nutate في 4 درجات مئوية خلال الليل (الأفضل) أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات.
    3. غسل البويضات أربع مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 1 مل PTB.
    4. إزالةالسائل من البويضات، إضافة 200 ميكرولتر من طاف من الأجنة (قبل يمتص الأجسام المضادة الثانوية). ثم ملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر. Nutate في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 4 ساعات (الأفضل) أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    5. غسل البويضات مرة واحدة لمدة 15 دقيقة مع 1 مل PTB، وإزالة السائل. ثم يضاف 0.5 ميكرولتر هويشت 33342 و 500 PTB ميكرولتر وnutate لمدة 7 دقائق.
    6. غسل البويضات مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 1 مل PTB.
      ملاحظة: قد يتم تنظيمها البويضات على شريحة فورا أو قد تكون مخزنة في PTB في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتصوير.

7. FISH (تابع من الخطوة 5 أعلاه)

  1. شطف البويضات توالت في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 15 مل ~ 2X SSCT. السماح البويضات تستقر ~ 2 دقيقة. إزالة كافة ولكن ~ 0.5 مل السائل جنبا إلى جنب مع العديد من الأغشية ممكن.
    ملاحظة: سوف الأغشية يستقر أبطأ من البويضات تدحرجت.
  2. نقل البويضات إلى 0.5 مل أنبوب وإزالة ما تبقى السائل. تباعا إضافة وإزالة 500 ميكرولتر20٪، 40٪، و 50٪ حلول الفورماميد، الإيماء لمدة 10 دقيقة في كل حل.
    ملاحظة: سوف البويضات يستقر أبطأ مع نسب أعلى من الفورماميد.
  3. إزالة السائل، ثم تضاف حل الفورماميد 500 ميكرولتر 50٪، وnutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1-5 ساعة.
    ملاحظة: أطول حضانات تؤدي إلى اختراق أفضل التحقيق.
  4. إزالة السائل، مخلفة وراءها ما لا يزيد عن 100 ~ البويضات ميكرولتر وإضافة 36 ميكرولتر حل التهجين زائد 2 ميكرولتر من التحقيق (50 نانوغرام / ميكرولتر) و 2 ميكرولتر من الماء أو 2 ميكرولتر من التحقيق الثانية 2 (الجدول 1).
  5. احتضان عند 91 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (FISH فقط) أو 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (FISH زائد المناعي)، تليها الحضانة في 37 ° C حمام الماء بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: قد يتم تنفيذ هذه الخطوات في thermocycler.
  6. لا تقم بإزالة السائل. إضافة 500 ميكرولتر 50٪ محلول الفورماميد وnutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  7. دعونا تسوية، وإزالة السائل، إضافة 500 ميكرولتر 50٪ محلول الفورماميد، لد nutate عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. دعونا تسوية، وإزالة السائل، إضافة حل الفورماميد 500 ميكرولتر 20٪، وnutate في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  9. تنفيذ ثلاث يغسل سريعة في 500 ميكرولتر 2X SSCT (السماح تسوية، إزالة ثم إضافة السائل، عكس عدة مرات، وتكرار.) واسمحوا تسوية، وإزالة السائل، ثم إضافة 500 ميكرولتر PTB وnutate لمدة 4 ساعة.

8. تلوين الأجسام المضادة بعد FISH

  1. إزالة السائل من البويضات، وملء مع PTB إلى 300 ميكرولتر وإضافة 10 ميكرولتر مكافحة α-تويولين الضد مترافق FITC. بدلا من ذلك، والأجسام المضادة الأخرى يمكن استخدامها، بعد بروتوكول أعلاه. Nutate في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  2. غسل البويضات مرة واحدة لمدة 15 دقيقة مع 500 ميكرولتر PTB، وإزالة السائل، ثم يضاف 0.5 ميكرولتر هويشت 33342 و 500 PTB ميكرولتر وnutate لمدة 7 دقائق.
  3. غسل البويضات مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع 500 ميكرولتر PTB.
    قد يتم تنظيمها البويضات على شريحة فورا أو قد تكون مخزنة في PTB في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لل: ملاحظةالتصوير. إبقاء البويضات في الظلام قدر الإمكان مرة واحدة تم إضافة الأجسام المضادة الفلورسنت.
تكرار اسم كروموسوم بنسبة ضئيلة تسلسل *
359 X GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 تسلسل من إريك جويس، والاتصالات الشخصية، سلاسل أخرى من سوليفان وآخرون. 8

الجدول 1: تحقيقات FISH ليكرر القسيم المركزي ذبابة الفاكهة.

عقار مذيب تركيز الأسهم التركيز النهائي وقت العلاج تأثير
الكولشيسين الإيثانول 125 ملي 150 ميكرومتر 10 دقيقة أو 30 دقيقة زعزعة الاستقرار في غير الحيز الحركي (10 دقيقة) 9 أو كل (30 دقيقة) ميكروتثبول
باكليتاكسيل [دمس] 10 ملي 10 ميكرومتر 10 دقائق استقرار هيئة التصنيع العسكريrotubules
Binucleine 2 [دمس] 25 ملي 25 ميكرومتر 20 دقيقة تمنع كيناز أورورا B 10

الجدول 2: العلاج من تعاطي المخدرات.

النتائج

سوف الأساليب التي وصفناها هنا يؤدي إلى مجموعة من المراحل المتأخرة من البويضات ذبابة الفاكهة تمثل ثلاث مراحل الانقسام الاختزالي (الشكل 1). وتتميز البويضات في الطور الأول من وجود الغلاف النووي، وهو أمر واضح بسبب عدم وجود إشارة تويولين ف?...

Discussion

انطلاق ذبابة الفاكهة البويضات

على الرغم من أن جسيم نووي ممدود غالبا ما ينظر في البويضات طليعة الطور التالي، وذلك باستخدام جسيم نووي شكل للتمييز طليعة الطور التالي من البويضات الطورية يمكن أن يكون مشكلة. خلال طليعة ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Christian Lehner for providing the CENP-C antibody and Eric Joyce for recommendations on FISH. Work in the McKim lab was funded by a grant from NIH (GM101955).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml conical tubesVarious
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakersVarious
5 ml tubesVarious
active dry yeastVariousmix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITCSigmaF2168clone DM1A
Binucleine 2SigmaB1186HAZARDOUS
blenderVarious
bovine serum albuminSigmaA4161
calcium chlorideVarious
colchicineSigmaC-9754HAZARDOUS
coverslipsVWR48366-227No. 1 1/2
dextran sulfateVarious
DMSOVarious
EGTAVarious
ethanolVarious
forcepsTed Pella, Inc.5622Dumont tweezers high precision grade style 5
formamideSigma47670-250ML-F
glass slidesVWR48312-003
glucoseVarious
graduated 1.5 ml tubesVarious
HEPESVWREM-5330available from several venders
Hoechst 33342Various
magnesium chlorideVarious
methanolVarious
large mesh (~1,500 µm)VWRAA43657-NKvariety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)Spectrum labs146 424variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutatorVarious
Pasteur pipetsVarious
potassium acetateVarious
Cacodylic acidSigmaC0125HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxideVarious
sodium acetateVarious
sodium chlorideVarious
sodium citrateVarious
sodium hydroxideVarious
sucroseVarious
taxol (paclitaxel)SigmaT1912HAZARDOUS
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
vortexVarious

References

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544 (2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605 (2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 FISH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved