טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

Summary

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Abstract

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Introduction

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protocol

הערה: ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. חממות שבשליטת טמפרטורה משמשים כדי לשמור על טמפרטורות עבור גידול זבוב וחוצה אלא אם צוין אחרת.

1. הכנות

1. הכן זבובים.
   1. Prometaphase מועשר אוספי ביצית.
      1. מבוגר מנקה זבובים מתרבויות מניות או צלב בריאות, צעירות. בקבוקי גיל ליומיים של 25 מעלות צלזיוס.
         הערה: באופן כללי שני בקבוקים בריאים יספיקו, אם כי יותר עשוי להיות נחוץ עבור בתרבויות מסוימות צלב.
      2. לאחר יומיים, לאסוף ~ 100 עד 300 נקבות (שהינם 0 עד 2 בימים ההם בשלב זה) מהבקבוקים. הנקבות לא צריכות להיות בתולות. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות ו -10 עד 15 גברים כל לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל לימים של 25 מעלות צלזיוס.
   2. Metaphase מועשר אוספי ביצית.
      1. אסוף ~ 100 עד 300 נקבות מן cultur מניות או צלבes. להוסיף טיפה של רסק שמרים לצד בקבוקון ולמקם 30 נקבות כל (ללא זכרים הוסיפו) לתוך צלוחיות yeasted. בקבוקוני גיל במשך שלושה עד חמישה ימים ב- C ° 25.
2. הכינו פתרונות.
   הערה: הפתרונות עשויים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.
   1. הכן שונה מאגר של רוב (5x): 500 מ"מ HEPES, 500 סוכרוז מ"מ, 275 מ"מ נתרן אצטט, 200 אצטט אשלגן מ"מ, 50 מ"מ גלוקוז, 6 מגנזיום כלוריד מ"מ, סידן כלורי 5 מ"מ. השתמש 10 N 11: סודיום הידרוקסיד 8: הידרוקסיד אשלגן להביא pH ל -7.4. לעקר על ידי סינון; לא חיטוי. חנות ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר לפי הצורך להכין ~ 200 מ"ל של הכנה לכל הביצית של 1x Robb.
   2. פתרונות קיבוע.
      1. אפשרות מס '1: כן קיבעון פורמלדהיד / heptane. כן הצפת קיבוע: 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 150 סוכרוז מ"מ. כדי להשתמש, לעשות טרי עם 687.5 μl הצפת קיבוע 312.5 μl 16% פורמלדהידלכל הכנת ביצית.
         זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות פורמלדהיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות.
      2. # 2 אפשרות: כן קיבעון פורמלדהיד / cacodylate. הכינו תערובת תקן: 250 סוכרוז מ"מ, 100 אצטט אשלגן מ"מ (pH 7.5), אצטט נתרן 25 מ"מ (pH 7.0), ו -25 מ"מ EGTA (pH 8.0). כדי להשתמש, לעשות טרי עם 400 μl תקן מיקס, 100 cacodylate אשלגן μl (1 M, pH 7.2), ו -500 μl 16% פורמלדהיד לכל הכנה הביצית.
         זהירות: אשלגן cacodylate מכיל ארסן.
   3. כן PBS / טריטון X-100: 1x PBS בתוספת 1% או 0.05% Triton X-100. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. הכן PBS-Tween 20-שור סרום אלבומין (BSA) (PTB): PBS 1x, 0.5% BSA (w / v), ו -0.1% Tween-20. עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
   5. קרינת הכלאה באתרו (FISH) פתרונות.
      1. כן כלוריד-נתרן 20X ציטראט (SSC): 3 M נתרן כלורי 0.3 M נתרן ציטרט.
      2. הכן 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC פלוס 0.1% Tween-20. הפוך טרי, ~ 20 מ"ל לכל הכנת ביצית.
      3. הכינו פתרונות לפוראמיד: 2x SSC, 0.1% Tween-20, פלוס לפוראמיד. הפוך טרי, 1 מ"ל 20% לפוראמיד, 0.5 מ"ל 40% לפוראמיד, ו -2 מ"ל 50% לפוראמיד לכל הכנה הביצית.
         זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת שימוש פתרונות לפוראמיד במנדף. מפנה את הפסולת בהתאם להנחיות מוסדיות.
      4. כן פתרון הכלאה: 2x SSC, 50% לפוראמיד, ו -10% סולפט dextran (w / v). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
   6. בדיקות FISH.
      1. Oligonucleotides להזמין (ראה לוח 1 עבור רצפים) עם טיהור HPLC ורצוי 5 'שינוי ניאון (למשל, Cy3 או Cy5). Resuspend ב טריס-EDTA (TE) ב 50 ng / μl.
         הערה: גן oligos מחשיפה לאור בכל העת.

2. אוסף של ביציות תסיסנית בשלבים מתקדמים

1. כפי ש ביציות תסיסנית עם קרומים שלמים ידבק פלסטיק וזכוכית, מראש המעיל הפנימי של אחד 5 מ"ל צינור ואחד פסטר pipet לכל הכנה הביצית עם PTB.
2. להרדים כל ~ 100 עד 300 זבובי yeasted עם פחמן דו חמצני ומוסיף בבלנדר המכיל ~ 100 מיליליטר 1x ההצפה של רוב. פעמים דופקות שלוש (~ 1 שניות כל אחד). שמור ביציות ב Robb של עבור <20 דק 'כדי להימנע מהפעלת.
   הערה: לחלופין, ביציות ניתן יד גזורה מן הנקבות. היתרון של שיטה זו הוא בכך שהיא דורשת נקבות פחות. עם זאת, יש להקפיד על מנת להגביל את החשיפה לפחמן דו-חמצני כדי רק כמה דקות, כדי למנוע חפצים הקשורים היפוקסיה ^7.
3. סינון דרך רשת גדולה (~ 1,500 מיקרומטר) לתוך כוס 250 מ"ל להסיר חלקי גוף גדול. אם בטן שלמה רבה נותרה על חומר רשת, מחדש לטחון באמצעות ההצפה של רוב נוספת, ולסנן שוב. בואו להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את השכבה העליונה, הסרת כמה שיותר חלקי גוף גדול ככל האפשר.
4. אלחוטיLTER דרך רשת קטנה (~ 300 מיקרומטר) לתוך מבחנה 250 מ"ל. לשטוף ביציות הנותרות מתוך המבחנה הראשונה באמצעות ומצופה pipet פסטר של רוב נוספים. בואו להתיישב ~ 3 דקות; ביציות יישבו בחוץ. לשאוב את כל אבל ~ 10 מ"ל.
5. יוצקים כמה שיותר 10 מ"ל כמו ייכנס לתוך הצינור 5 מ"ל מצופה. בואו להתיישב, להסיר את הנוזל, וחזרו עם שארית. לשטוף ביציות הנותרות מתוך מבחנה באמצעות ו של רוב נוסף pipet פסטר מצופה. בואו להתיישב צינור 5 מ"ל ~ 3-5 דקות.

3. טיפולים תרופתיים (אופציונלי)

1. מעיל צינור 5 מ"ל השני עם PTB לכל הכנה הביצית. להוסיף ממס מתאים (שליטה) או תרופה עד 1 מיליליטר רוב של כל עבור כל הכנת ביצית (טבלה 2).
2. ביציות פיצול לתוך הצינור השני מצופה 5 מ"ל. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, ולהוסיף 1 מ"ל Robb של פלוס ממס לתוך צינור אחד ו 1 מ"ל Robb של פלוס התרופה לתוך הצינור השני. Nutate עבור משך הזמן המתאים עבור טיפול תרופתי (טבלה 2). Let להתיישב.

קיבוע 4.

1. לשאוב את כל הנוזל ומיד להוסיף 1 מ"ל תקן.
2. אפשרות # 1: פורמלדהיד / heptane קיבעון (קיבוע הצפה בתוספת 5% פורמלדהיד).
   1. תקן עבור 2.5 דקות על nutator. להוסיף heptane 1 מ"ל ו מערבולת 1 דקות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
   2. הסר את כל נוזל, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל 1x PBS. וורטקס 30 שניות. בואו להתיישב ~ 1 דק '.
   3. הסר את כל הנוזל, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
3. # 2 אפשרות: קיבעון פורמלדהיד / cacodylate (תקן Mix Plus 8% פורמאלדהיד 100 מ"מ cacodylate).
   1. תקן עבור 6 דקות על nutator. בואו להתיישב 2 דקות. הסר נוזלי, ולאחר מכן למלא צינור עם 1x PBS.
      הערה: ביציות ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.

5. הסרת ממברנות ( "רולינג")

1. שימוש pipet פסטר מצופה, להוסיף ~ 500 1,000 ביציות לחלק (חול-מותז) החלבי של שקופית זכוכית. הסר את כל חלקי הגוף באמצעות מלקחי חומר זרים. אל תתנו ביציות להתייבש; להוסיף 1x PBS במידת הצורך.
2. מניחים coverslip על גבי ביציות בעדינות ביציות "גליל" עד שכל ממברנות מוסרים (גרירת בקצה coverslip ברחבי ביציות עובד הכי טוב.) מדי פעם לבדוק את ההתקדמות מתחת למיקרוסקופ, הוספת עוד PBS 1x לפי הצורך. תשמור על עצמך כמו יותר מדי לחץ יהרוס את הביציות.
   הערה: לקבלת immunofluorescence בלבד, להמשיך עם שלב 6. לדגים (עם או בלי immunofluorescence), להמשיך עם שלב 7.

6. מכתים נוגדן של תסיסנית ביציות

1. כריית חסימה
   1. לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל PBS / 1% Triton X-100. ביציות Nutate בפתרון זה עבור לא פחות מ -1.5 שעות ולא יותר מ -2 שעות.שלב זה מאפשר חדירת נוגדן.
   2. בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. סר נוזל יחד עם ממברנות רבות ככל האפשר, ולאחר מכן להוסיף PBS / 0.05% Triton X-100.
      הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו.
   3. תנו ביציות להתיישב ~ 2 דקות, ולאחר מכן להסיר את כל אבל ~ 1 מ"ל נוזל. העברת ביציות כדי סיימו צינור 1.5 מיליליטר ולהסיר נוזל נותר. הוסף 1 מ"ל PTB עבור חסימת nutate עבור שעה 1.
2. מכתים נוגדן
   1. בולמי Pre של נוגדנים משני נגד עוברים.
      הערה: צעד זה מבטל מכתים רקע מאינטראקציות נוגדן הלא ספציפית עם חלבונים תסיסנית.
      1. אסוף ולתקן עוברים תסיסנית (~ 25 μl) לכל הליך טיפוסי ^8. אחסן מתנול ב -20 ° C.
      2. הסר מתנול מעוברים, להוסיף 800 מתנול μl בתוספת 200 μl 1x PBS, nutate במשך 15 דקות. הסר 500 μl של supernatant ולהחליף עם 500 μl 1x PBS. ואז nutate במשך 15 דקות. חזור פעמיים (עבור סכום כולל של ~ 1 hr שוטף), ולאחר מכן לסיים ב PTB.
         הערה: עוברים ניתן להשתמש מיד או שמרו על nutator במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר.
      3. סר נוזלי, מתמלא PTB 200 μl לכל הכנת ביצית, ולהוסיף נוגדנים משני שכותרתו fluorescently ב דילולים מתאימים (יש לזכור כי ההיקף הסופי יהיה 300 μl;. ראה שלב 7.4) Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
         הערה: נוגדנים מראש נספג ישמש בשלב 6.2.4.
         הערה: שמור דגימות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.
   2. הסר נוזל ביציות, מתמלא PTB 300 μl, ולהוסיף נוגדנים עיקריים ב דילולים מתאימים. Nutate ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה (עדיף) או בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות.
   3. לשטוף ביציות ארבע פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
   4. לְהַסִירנוזל ביציות, להוסיף 200 μl של supernatant מעובר (נוגדנים משני שקוע מראש). ואז למלא עם PTB 300 μl. Nutate בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 4 שעות (עדיף) או על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 1 מ"ל PTB, להסיר את נוזל. לאחר מכן מוסיפים 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
   6. לשטוף ביציות פעמיים במשך 15 דקות כל אחד עם 1 מ"ל PTB.
      הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן הדמיה.

7. FISH (והמשך משלב 5 לעיל)

1. לשטוף ביציות התגלגל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל ~ 15 מ"ל 2x SSCT. בואו ביציות להתיישב ~ 2 דק '. הסר את כל אבל ~ 0.5 מ"ל נוזל יחד עם ממברנות רבים ככל האפשר.
   הערה: ממברנות יישב איטיים יותר ביציות התגלגלו.
2. העברת ביציות כדי צינור 0.5 מ"ל ולהסיר הנוזל הנותר. ברציפות להוסיף ולהסיר 500 μl20%, 40%, ופתרונות לפוראמיד 50%, nutating במשך 10 דקות בכל פתרון.
   הערה: ביציות יישב איטיות עם אחוזים גבוהים של לפוראמיד.
3. הסר נוזלי, ולאחר מכן להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, ו nutate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 5 שעות.
   הערה: incubations יותר לגרום חדירת בדיקה טובה יותר.
4. הסר נוזלי, והותיר אחריו לא יותר מ ~ 100 ביציות μl, ולהוסיף 36 μl הכלאה פתרון בתוספת 2 μl של החללית (50 ng / μl) ו -2 μl של מים או 2 μl של החללית 2 ^nd (טבלה 1).
5. לדגור על 91 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות (FISH בלבד) או 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (FISH בתוספת immunofluorescence), ואחריו הדגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: פעולות אלה עשויות להתבצע ב thermocycler.
6. אל תסיר נוזלי. הוסף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד ואת nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
7. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 50% פתרון לפוראמיד, גידולד nutate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
8. בואו להתיישב, להסיר את נוזל, להוסיף 500 μl 20% פתרון לפוראמיד, ו nutate בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
9. בצע שלושה שוטף מהיר 500 μl 2x SSCT (בוא להתיישב, להסיר ולאחר מכן להוסיף נוזל, להפוך מספר פעמים, חזור.) בוא להתיישב, להסיר את הנוזל, ולאחר מכן להוסיף 500 μl PTB ו nutate עבור 4 שעות.

8. נוגדן מכתים לאחר FISH

1. הסר נוזל ביציות, מתמלאות PTB 300 μl, ולהוסיף 10 μl נוגדן אנטי α-טובולין מצומדות כדי FITC. לחלופין, נוגדנים אחרים יכולים לשמש, בעקבות בפרוטוקול לעיל. Nutate בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
2. לשטוף ביציות פעם במשך 15 דקות עם 500 PTB μl, להסיר את נוזל, ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl Hoechst 33342 ו 500 μl PTB ו nutate עבור 7 דקות.
3. לשטוף ביציות פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם 500 μl PTB.
   הערה: ביציות יכולות להיות מותקנות בשקופית מייד או ניתן לאחסן PTB על 4 מעלות צלזיוס עד מוכןהַדמָיָה. שמור ביציות בחושך ככל האפשר פעם נוגדנים ניאון נוספו.

שם חזור	כרומוזום	רצף אוליגו *
359	איקס	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 רצף מאריק ג'ויס, תקשורת אישית, רצפים אחרים מהעמוד סאליבן et al. 8

טבלה 1: בדיקות FISH עבור חזרות centromeric תסיסנית.

תְרוּפָה	מֵמֵס	ריכוז מניות	ריכוז סופי	זמן טיפול	השפעה
קולכיצין	אתנול	125 מ"מ	150 מיקרומטר	10 דקות או 30 דקות	לערער-קינטוכור הלא (10 דק ') 9 או כל (30 דקות) microtubules
פקליטקסל	DMSO	10 מ"מ	10 מיקרומטר	10 דק '	לייצב מיקרופוןrotubules
Binucleine 2	DMSO	25 מ"מ	25 מיקרומטר	20 דק '	לעכב קינאז אורורה B 10

טבלה 2: טיפול תרופתי.

תוצאות

השיטות שתיארנו כאן תוביל גביית ביציות תסיסנית בשלב מאוחר המייצגים שלושה שלבי המיוזה (איור 1). ביציות ב prophase מאופיינים בנוכחות מעטפת הגרעין, אשר גלוי על ידי חוסר האות טובולין באזור המקיף את karyosome (איור 1 א). Prometaphase היא התקופה לאחר...

Discussion

Staging תסיסנית ביציות

אם כי karyosome מוארך נראה בדרך כלל ב ביציות prometaphase, באמצעות karyosome צורה להבחין prometaphase מ ביציות metaphase יכול להיות בעייתי. במהלך prometaphase, את karyosome מתחיל כמו צורה עגולה, מתארך, ולאחר מכן חזר בו כדי צורה עגולה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various