Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Özet

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Özet

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Giriş

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protokol

Not: Aksi belirtilmediği sürece, işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Sıcaklık kontrollü inkübatör sinek yetiştirme için sıcaklıkları korumak için kullanılan ve aksi belirtilmediği sürece haçlar vardır.

1. hazırlıklar

1. Sinekler hazırlayın.
   1. oosit koleksiyonları prometafaz zenginleştirilmiş.
      1. Net yetişkin sağlıklı, genç stok veya çapraz kültürlerinden uçar. 25 ° C'de iki gün için yaş şişe.
         Not: Genellikle, iki sağlıklı şişe yeterli olacaktır, daha çok bazı çapraz kültürler için gerekli olabilir, ancak.
      2. İki gün sonra, şişe (bu noktada, 0 ila 2 gün geçmiş) ~ 100 ila 300 kadın toplar. kadın bakire olması gerekmez. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın ve mayalı şişeleri içine 10 ila 15 erkek her koyun. 25 ° C'de iki gün için yaş şişeler.
   2. Oosit Koleksiyonlar metafaz zenginleştirilmiş.
      1. Hisse senedi veya çapraz KÜLTÜR gelen ~ 100 ila 300 kadın toplamakes. Bir şişenin yanına maya hamur dab ekleyin ve 30 kadın yer mayalı şişe içine (ilave hiçbir erkek ile birlikte) her biri. 25 ° C 'de üç ila beş gün için yaş şişeler.
2. Çözümler hazırlayın.
   Not: Aksi belirtilmediği sürece, Solutions, oda sıcaklığında süresiz depolanabilir.
   1. Robb tampon Modifiye hazırlama (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukroz, 275 mM sodyum asetat, 200 mM potasyum asetat, 50 mM glukoz, 6 mM magnezyum klorid, 5 mM kalsiyum klorid. 7.4 pH değerini elde etmek için potasyum hidroksit: 8 sodyum hidroksit: 10 K 11 kullanın. filtrasyon ile sterilize; kaynatmayın. -20 ° C'de saklayın. ~ 1x Robb'un oosit başına hazırlık 200 ml hazırlamak için gerekli olarak çözülme.
   2. Tespit Çözümleri.
      1. Seçenek # 1: formaldehit / heptan tespit hazırlayın. Sabitleme tampon hazırlayın: 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) artı 150 mM sukroz. kullanmak için, 687,5 ul Sabitleme Tampon ve 312,5 ul% 16 formaldehit ile taze yapmakoosit hazırlık başına.
         DİKKAT: Davlumbaz formaldehit çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir.
      2. Seçenek # 2: formaldehit / kakodilat tespit hazırlayın. Düzeltme Mix hazırlayın: 250 mM sükroz, 100 mM potasyum asetat (pH 7.5), 25 mM sodyum asetat (pH 7.0) ve 25 mM EGTA (pH 8.0). kullanmak için, 400 ul taze karışımı saptamak yapmak 100 ul potasyum kakodilat (1 M, pH 7.2), ve oosit prep 500 ul% 16 formaldehid.
         DİKKAT: Potasyum kakodilat Arsenik içerir.
   3. 1x PBS artı% 1 veya% 0.05 Triton X-100 PBS / Triton X-100 hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
   4. 1 x PBS, (ağ / hac)% 0.5 BSA ve% 0.1 Tween-20: PBS-Tween 20 Sığır Serum Albumin (BSA) (PTB) hazırlayın. bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
   5. Situ Hibridizasyon (FISH) Çözümleri floresan.
      1. Hazırlama 20X Sodyum klorür-sodyum sitrat (SSC): 3 M sodyum klorür ve 0.3 M sodyum sitrat.
      2. Hazırlama 2x SSC-Tween-20 (SSCT) 2X SSC artı% 0.1 Tween-20. oosit hazırlık başına taze ~ 20 ml olun.
      3. formamid çözümler hazırlayın: 2 x SSC,% 0.1 Tween-20, ayrıca formamid. 1 ml% 20 formamid, 0.5 mL% 40 formamid, ve oosit hazırlık başına 2 ml% 50 formamid, taze olun.
         DİKKAT: Davlumbaz formamid çözümlerini kullanırken eldiven giyin. kurumsal kurallarına göre bertaraf edilmelidir.
      4. (Ağırlık / hacim) 2X SSC,% 50 formamid,% 10 dekstran sülfat: hibridizasyon çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
   6. BALIK Probes.
      1. Order HPLC ile arıtma sahip oligonükleotid (dizileri için Tablo 1 'e bakınız) ve 5' flüoresan modifikasyonu (örneğin Cy3 veya Cy5) istenen. 50 ng / | il Tris-EDTA (TE) içinde süspanse edin.
         NOT: Her zaman ışık maruz oligos koruyun.

Geç evre Drosophila Oosit 2. Koleksiyonu

1. Gibi plastik ve cam sopa intakt membranlı Drosophila oositlerin öncesi kat bir 5 ml tüp ve PTB ile oosit hazırlık başına bir süspanse içinde.
2. karbon dioksit ile tüm ~ 100 ila 300 mayalı sinekler uyutmak ve ~ 100 ml 1x Robb'un Tamponu içeren bir blender ekleyin. Darbe üç kez (~ 1 sn her). aktivasyonunu önlemek için NOT: Alternatif olarak, oosit dişilerden el-disseke edilebilir. Bu yöntemin avantajı, daha az kadın gerektirmesidir. Ancak, bakım hipoksi ⁷ ile bağlantılı bozulmaları önlemek için sadece birkaç dakikaya kadar karbon dioksite maruz sınırlamak için dikkat edilmelidir.
3. Büyük beden parçalarını kaldırmak için 250 ml behere büyük örgü (~ 1.500 mm) süzülür. Birçok bozulmamış karnı yine örgü, yeniden eziyet ek Robb'un Tampon kullanarak malzeme ve filtre üzerinde kalırsa. Daha sonra mümkün olduğunca büyük vücut parçaları gibi birçok kaldırarak, üst tabaka aspire ~ 2 dk dinlendiriniz.
4. Fi250 ml'lik bir cam kaba, küçük elek (~ 300 um) vasıtasıyla ltresi. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak ilk beher dışına kalan oosit durulayın. yerleşmek ~ 3 dk edelim; oosit dışarı razı olacak. Aspire off ama ~ 10 ml.
5. kaplanmış 5 ml tüp içine sığacak kadar 10 ml kadar dökün. , Yerleşmek sıvı kaldırmak ve kalanı tekrar edelim. Ek Robb adlı ve kaplamalı Pasteur pipet kullanarak kaptan dışarı kalan oosit durulayın. 3-5 dakika ~ 5 ml tüp dinlendiriniz.

3. İlaç Tedavileri (İsteğe bağlı)

1. Coat her oosit hazırlık için PTB ile ikinci 5 ml tüp. 1 ml Robb birbirlerinin oosit hazırlık için, her (Tablo 2), uygun bir çözücü (kontrol) ya da ilaç ekleyin.
2. İkinci kaplanmış 5 ml tüp içine bölünmüş oositler. , Yerleşmek Let sıvı kaldırmak ve bir tüp içine 1 ml Robb en artı çözücü eklemek ve 1 ml Robb en artı ilaç ikinci tüpe. Ilaç tedavisi (Tablo 2) uygun zaman miktarı için Nutate. Let yerleşmek.

4. Sabitleme

1. Aspire tüm sıvı ve hemen 1 ml Fix ekleyin.
2. Seçenek # 1: Formaldehit / heptan sabitleme (Fixation Tampon artı% 5 formaldehit).
   1. Bir nutator 2.5 dakika için düzelt. 1 mi heptan ve 1 dakika vorteksleyin ekleyin. yerleşmek ~ 1 dk olsun.
   2. tüm sıvı çıkarın ve sonra PBS 1x 1 ml ekleyin. Vortex 30 sn. yerleşmek ~ 1 dk olsun.
   3. tüm sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun.
      Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.
3. Seçenek # 2: Formaldehit / kakodilat sabitleme (Mix artı% 8 formaldehit ve 100 mM kakodilat Fix).
   1. Bir nutator 6 dakika düzelt. 2 dakika dinlendiriniz. sıvı çıkarın ve sonra 1x PBS ile tüp doldurun.
      Not: Oositler hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.

5. Membranlar çıkarma ( "Rolling")

1. kaplanmış yeniden süspanse kullanarak, bir cam slayt buzlu (kumlanmış) kısmına ~ 500 ila 1000 oosit ekleyin. tüm vücut parçaları ve yabancı madde kullanarak forseps çıkarın. oosit kurumasına izin vermeyin; gerektiğinde 1x PBS ilave edin.
2. Periyodik mikroskop altında ilerleyişini kontrol (. En iyi şekilde çalışır oosit genelinde lamel kenarına sürükleyerek) kaldırılır tüm membranların kadar oosit ve yavaşça "roll" oosit üstünde bir lamel yerleştirin gerektiğinde daha 1x PBS ekledi. oosit yok edecek çok fazla basınç olarak özen gösterin.
   NOT: immünfloresans sadece, (immünofloresan olan veya olmayan) FISH için Adım 6 ile devam için, Adım 7 ile devam edin.

Drosophila OOSİT 6. Antikor Boyama

1. Ekstraksiyon ve Engelleme
   1. ~ 15 mi, PBS /% 1 Triton X-100 ihtiva eden 15 ml konik bir tüp içine haddelenmiş oosit durulayın. en az 1.5 saat için bu çözüm ve en fazla 2 saat içinde Nutate oositler.Bu adım, antikor nüfuz etmesini sağlar.
   2. oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. Mümkün olduğunca çok sayıda membran ile birlikte sıvı çıkarın, daha sonra PBS ekleme /% 0.05 Triton X-100.
      NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer.
   3. oosit ~ 2 dk yerleşmek izin, sonra tüm ama ~ 1 ml sıvı kaldırmak. Transfer oosit 1.5 ml tüp mezun oldu ve kalan sıvı çıkarın. 1 saat boyunca bloke etmek ve nutate 1 mi ATB ekleyin.
2. antikor Boyama
   1. Embriyoların karşı sekonder antikor Ön emilim.
      Not: Bu adım, Drosophila proteinleri ile spesifik olmayan antikor reaksiyonları arka plan boyaması ortadan kaldırır.
      1. Toplayın ve tipik prosedür ⁸ uyarınca Drosophila embriyolar (~ 25 ul) düzeltmek. -20 ° C'de metanol içinde depolayın.
      2. , Embriyolardan, metanolün çıkması, 15 dakika boyunca 800 ul metanol artı PBS 1X 200 ul ve nutate ekleyin. süpernatan 500 ul çıkarın ve PBS 1X 500 ul ile değiştirin. Daha sonra 15 dakika boyunca nutate. (Yıkar ~ 1 saat olmak üzere toplam) iki kez tekrarlayın ve sonra PTB bitirmek.
         Not: Embriyolar hemen kullanılabilir ya da oda sıcaklığında birkaç saat boyunca nutator tutulabilir.
      3. , Sıvı çıkarın oosit hazırlık başına 200 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda floresan etiketli sekonder antikor ekleyin (son hacim 300 ul olacağını göz önünde bulundurarak;. Adım 7.4) Nutate 4 ° C'de gece boyunca (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
         Not: önceden absorbe antikorlar Aşama 6.2.4 kullanılacaktır.
         NOT: mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta örnekleri tutun.
   2. , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve uygun dilüsyonlarda primer antikorlar ekleyin. 4 ° C'de bir gece boyunca Nutate (tercih edilir) ya da 3 ila 4 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılmıştır.
   3. Yıkama 1 ml PTB 15 dakika her biri için dört kez oosit.
   4. Kaldıroosit, sıvı, embriyolar (sekonder antikor önceden absorbe) üstte yüzen madde 200 ul ekle. Ardından 300 ul PTB ile doldurun. 3 ila 4 saat (tercihen) veya gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında Nutate.
   5. 1 mi PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın, sıvıyı ayırın. Daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin.
   6. 1 mi PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın.
      Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir veya görüntüleme için hazır olana kadar 4 ° C'de PTB depolanabilir.

7. BALIK (Above Adım 5 Devam)

1. ~ 15 ml 2x SSCT içeren 15 ml konik tüp içine yuvarlandı oosit durulayın. oosit ~ 2 dk dinlendiriniz. 0.5 ml sıvı mümkün olduğu kadar çok membran ile birlikte tüm ama ~ çıkarın.
   NOT: Zarlar haddelenmiş oosit daha yavaş geçer.
2. Transferi 0.5 ml tüp oosit ve kalan sıvıyı çıkarın. Arda eklemek ve 500 ul kaldırmak% 20,% 40,% 50 formamid çözeltiler, her çözelti içinde 10 dakika için nutating.
   NOT: Oositler formamid yüksek oranları ile yavaş geçer.
3. daha sonra 1 5 saat boyunca 37 ° C'de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin sıvıyı ayırın.
   NOT: Daha uzun inkubasyon daha sonda penetrasyon ile sonuçlanır.
4. En fazla 100 ° den ul oosit bırakarak sıvı çıkarın ve 36 ul hibridizasyon çözeltisi artı prob 2 ul (50 ng / | il) ve 2 ul su veya ^2. prob (Tablo 1) 2 ul ekle.
5. gece boyunca 37 ° C'de su banyosunda kuluçkaya bırakılır, ardından 3 dakika boyunca (FISH için) ya da 20 dakika (balık artı immünofloresan), 80 ° C, 91 ° C de inkübe edilir.
   Not: Bu adımlar, bir PCR gerçekleştirilebilir.
6. sıvı çıkarmayın. 1 saat boyunca 37 ° C'de 500 ul% 50 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin.
7. , Sıvı kaldırmak, yerleşmek Let 500 ul% 50 formamid çözüm ekleyin, bir1 saat süre ile 37 ° C 'de D nutate.
8. , Sıvının çıkması, yerleşmek izin 10 dakika için oda sıcaklığında 500 ul% 20 formamid çözeltisi ve nutate ekleyin.
9. (Tekrarlama birkaç kez ters, sonra sıvı ekleyin kaldır, yerleşmek izin verin.) 500 ul 2x SSCT üç hızlı yıkar gerçekleştirin yerleşmek edelim, sıvı kaldırmak, daha sonra 4 saat boyunca 500 ul ATB ve nutate ekleyin.

8. Antikor Boyama FISH sonra

1. , Oosit sıvıyı çıkarmak 300 ul PTB ile doldurun ve FITC konjuge 10 ul anti-α-tubulin antikor ekleyin. Seçenek olarak ise, diğer antikorlar, yukarıda protokol izlenerek, kullanılabilir. gece boyunca, oda sıcaklığında Nutate.
2. daha sonra, 7 dakika boyunca 0.5 ul Hoechst 33342 ve 500 ul PTB ve nutate ekleyin sıvının çıkması, 500 ul PTB ile 15 dakika boyunca bir kez oosit yıkayın.
3. 500 ul PTB ile her biri 15 dakika için iki kere oosit yıkayın.
   Not: Oositler hemen slayt üzerine monte edilebilir ya da hazır olana kadar 4 ° C'de PTB depolanabilirgörüntüleme. mümkün olduğu kadar floresan antikorlar eklenmiştir kez karanlıkta oosit tutun.

Tekrarlama Ad	Kromozom	Oligo Sırası *
359	X	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeka	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* Eric Joyce, kişisel iletişim, Sullivan ve ark diğer dizilerden 359 dizisi. 8

Tablo 1: Drosophila sentromerine tekrarlar için FISH probları.

İlaç	çözücü	stok konsantrasyonu	Nihai konsantrasyon	Tedavinin zamanı	Efekt
kolşisin	etanol	125 mM	150 uM	10 dakika ya da 30 dakika	olmayan kinetochore (10 dakika) 9 veya Tüm (30 dakika) mikrotübül destabilize
paklitaksel	DMSO	10 mM	10 uM	10 dk	mikrofona stabilizerotubules
Binucleine 2	DMSO	25 mM	25 uM	20 dakika	Aurora B kinaz 10 inhibe

Tablo 2: İlaç tedavisi.

Sonuçlar

Burada tarif edilen metodlar mayoz üç aşamadan (Şekil 1) temsil eden geç evre Drosophila oosit toplama neden olur. Profaz Oositler karyosome (Şekil 1A) çevreleyen bölgede tübülin sinyal eksikliği ile görünür çekirdek zarfına varlığı ile ayırt edilir. Prometafaz nükleer zarf arıza sırasında iğ monte ediyor sonra dönemdir. Prometafaz sırasında karyosome, farklı bir şekil alır, ana karyosome kütlesi (Şekil 1...

Tartışmalar

Drosophila Oositler evreleme

bir ince uzun karyosome genellikle metafaz oositlerden prometafaz ayırt karyosome şeklini kullanarak, prometafaz oositlerinde görülmekle birlikte sorunlu olabilir. prometafaz sırasında, karyosome, yuvarlak bir şekil olarak başlar uzar ve daha sonra oosit metafaz tutuklama yaklaştıkça bir yuvarlak şekle geri çekilir. Bu, pek çok prometafaz oositler uzatılmış karyosome yok demektir. mutant ya da ilaçla tedavi oosit incele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various