Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso<em&gt; Drosophila</em&gt; ovociti

Riepilogo

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Abstract

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Introduzione

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protocollo

Nota: Le procedure sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. incubatori a temperatura controllata sono utilizzati per mantenere temperature per volare allevamento e attraversa se non diversamente specificato.

1. preparati

1. Preparare mosche.
   1. Prometafase arricchito collezioni ovocita.
      1. Cancella adulto vola da sani, giovani stock o trasversali culture. bottiglie di età per due giorni a 25 ° C.
         NOTA: Generalmente due bottiglie sani sarà sufficiente, anche se più può essere necessaria per alcune culture trasversali.
      2. Dopo due giorni, raccogliere ~ 100 a 300 femmine (che vanno da 0 a 2 giorni di età, a questo punto) dalle bottiglie. Le femmine non hanno bisogno di essere vergini. Aggiungere una piccola quantità di pasta di lievito al lato di una fiala e inserire 30 femmine e 10 a 15 maschi ciascuno nelle fiale yeasted. fiale di età per due giorni a 25 ° C.
   2. Metafase-arricchito ovociti Collezioni.
      1. Raccogliere ~ 100 a 300 femmine a magazzino o cross cultures. Aggiungere una piccola quantità di pasta di lievito al lato di una fiala e posizionare 30 femmine ogni (senza maschi aggiunti) nelle fiale yeasted. fiale di età per tre-cinque giorni a 25 ° C.
2. Preparare soluzioni.
   Nota: Le soluzioni possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.
   1. Preparare Modified Buffer di Robb (5x): 500 mM HEPES, 500 mM di saccarosio, 275 mM acetato di sodio, acetato di potassio 200 mM, 50 mM di glucosio, 6 mM cloruro di magnesio, cloruro di calcio e 5 mM. Utilizzare 10 N 11: 8 idrossido di sodio: idrossido di potassio per portare il pH a 7,4. Sterilizzare per filtrazione; Non sterilizzare in autoclave. Conservare a -20 ° C. Scongelare come necessario per preparare ~ 200 ml di 1x Robb per ovocita prep.
   2. Soluzioni fissazione.
      1. Opzione # 1: Preparare la formaldeide / fissazione eptano. Preparare Fixation Buffer: soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) più 150 mM saccarosio. Per utilizzare, rendere fresco con 687,5 ml Fixation Buffer e 312,5 ml 16% di formaldeideper ovocita prep.
         ATTENZIONE: Indossare guanti durante l'utilizzo di soluzioni di formaldeide in una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.
      2. Opzione # 2: Preparare la formaldeide / fissazione cacodilato. Preparare Mix Fix: 250 mm saccarosio, 100 mM acetato di potassio (pH 7,5), 25 mM di sodio acetato (pH 7,0), e 25 mM EGTA (pH 8,0). Per utilizzare, fare fresco con 400 ml Fix Mix, 100 cacodilato ml di potassio (1 M, pH 7,2), e 500 microlitri di formaldeide al 16% per ovocita prep.
         ATTENZIONE: cacodilato potassio contiene arsenico.
   3. Preparare PBS / Triton X-100: 1x PBS + 1% o 0,05% Triton X-100. Conservare a 4 ° C.
   4. Preparare PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v), e 0,1% Tween-20. Può essere conservato a 4 ° C per una settimana.
   5. Ibridazione in situ fluorescente (FISH) Solutions.
      1. Preparare 20X Sodio cloruro-sodio citrato (SSC): 3 M di cloruro di sodio e 0,3 M di sodio citrato.
      2. Preparare 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC più 0,1% di Tween-20. Fare freschi, ~ 20 ml per ovocita prep.
      3. Preparare soluzioni formammide: 2x SSC, 0,1% Tween-20, più formammide. Fare fresco, 1 ml 20% formammide, 0,5 ml 40% formammide, e 2 ml di 50% formammide per ovocita prep.
         ATTENZIONE: Indossare guanti durante l'utilizzo di soluzioni formammide in una cappa aspirante. Smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.
      4. Preparare la soluzione di ibridazione: 2x SSC, 50% formammide, e il 10% di solfato di destrano (w / v). Conservare a 4 ° C.
   6. Sonde pesce.
      1. Ordine oligonucleotidi (vedi Tabella 1 per le sequenze) con la purificazione HPLC e desiderato 5 modifica 'fluorescente (per esempio, Cy3 o Cy5). Risospendere in Tris-EDTA (TE) a 50 ng / ml.
         NOTA: Proteggere oligonucleotidi da esposizione alla luce in ogni momento.

2. Raccolta di ritardo-fase di Drosophila ovociti

1. Come ovociti Drosophila con membrane intatte si attacca alla plastica e vetro, pre-rivestire l'interno di un tubo 5 ml e una pipetta Pasteur per ovocita preparazione con PTB.
2. Anestetizzare tutti ~ 100 a 300 mosche yeasted con anidride carbonica e aggiungere ad un frullatore contenente ~ 100 ml di 1x tampone di Robb. Pulse tre volte (~ 1 sec ciascuno). Mantenere gli ovociti in Robb di per <20 min per evitare l'attivazione.
   NOTA: In alternativa, gli ovociti possono essere sezionati a mano dalle femmine. Il vantaggio di questo metodo è che richiede meno femmine. Tuttavia, la cura deve essere presa per limitare l'esposizione al biossido di carbonio a solo pochi minuti per evitare artefatti associata con ipossia ^7.
3. Filtrare maglie larghe (~ 1.500 micron) in 250 ml bicchiere per rimuovere grandi parti del corpo. Se molti addomi intatte rimangono ancora sul materiale della maglia, ri-macinare con ulteriore buffer di Robb, e filtro. Lasciare riposare ~ 2 min, poi aspirare al largo strato superiore, eliminando come molti dei grandi parti del corpo il più possibile.
4. Filtro attraverso piccoli mesh (~ 300 micron) in un becher da 250 ml. Risciacquare rimanenti ovociti su primo bicchiere usando aggiuntivo di Robb e rivestito Pasteur pipetta. Lasciare riposare ~ 3 min; ovociti si depositerà fuori. Aspirare fuori tutti ma ~ 10 ml.
5. Versare la maggior quantità di 10 ml, come si inserisce nel tubo rivestito da 5 ml. Lasciare riposare, rimuovere il liquido, e ripetere con resto. Risciacquare ovociti rimanenti di coppa con ulteriore Pasteur pipetta di Robb e rivestito. Lasciate stabilirsi in 5 ml di tubo per ~ 3-5 minuti.

3. Trattamenti farmacologici (Opzionale)

1. Coat un secondo tubo 5 ml con PTB per ogni preparazione ovocita. Aggiungere solvente appropriato (controllo) o farmaco per 1 ml di Robb ciascuno per ogni prep ovocita (Tabella 2).
2. ovociti diviso in seconda rivestito tubo 5 ml. Lasciare riposare, rimuovere il liquido e aggiungere 1 ml di Robb più solventi in un tubo e 1 ml di Robb più farmaco nel secondo tubo. Nutate un'adeguata quantità di tempo per il trattamento farmacologico (Tabella 2). Let stabilirsi.

4. Fissazione

1. Aspirare fuori tutto il liquido e subito aggiungere 1 ml Fix.
2. Opzione # 1: Formaldeide / eptano fissazione (fissazione Buffer più 5% di formaldeide).
   1. Fix per 2,5 minuti su un nutator. Aggiungere 1 ml di eptano e vortex 1 min. Lasciare riposare ~ 1 min.
   2. Rimuovere tutto il liquido, e quindi aggiungere 1 ml di PBS 1x. Vortex 30 sec. Lasciare riposare ~ 1 min.
   3. Rimuovere tutto il liquido, e quindi riempire il tubo con PBS 1x.
      NOTA: Gli oociti possono essere utilizzati immediatamente o conservare sul nutator per diverse ore a temperatura ambiente.
3. Opzione # 2: la fissazione Formaldeide / cacodilato (Fix Mix più 8% di formaldeide e 100 mm cacodilato).
   1. Fix per 6 minuti su un nutator. Lasciare riposare 2 minuti. Rimuovere il liquido, e quindi riempire il tubo con PBS 1x.
      NOTA: Gli oociti possono essere utilizzati immediatamente o conservare sul nutator per diverse ore a temperatura ambiente.

5. Rimozione Membrane ( "Rolling")

1. Utilizzando rivestito pipetta Pasteur, aggiungere ~ 500 a 1.000 ovociti alla parte (sabbiato) smerigliato di un vetrino. Rimuovere tutte le parti del corpo e dei materiali con pinze estranei. Non lasciate che gli ovociti asciugare; aggiungere 1x PBS come necessario.
2. Posizionare un vetrino in cima degli ovociti e delicatamente ovociti "Roll", fino tutte le membrane vengono rimossi (trascinando il bordo del vetrino attraverso gli ovociti funziona meglio.) Controllare periodicamente i progressi sotto il microscopio, l'aggiunta più 1x PBS, se necessario. Fare attenzione a come troppa pressione distruggerà gli ovociti.
   NOTA: Per immunofluorescenza solo continuare con il passo 6. Per il pesce (con o senza immunofluorescenza), passare al punto 7.

6. Anticorpo colorazione di Drosophila ovociti

1. Estrazione e Blocco
   1. Risciacquare ovociti arrotolato in un tubo da 15 ml contenente ~ 15 ml di PBS / 1% Triton X-100. ovociti Nutate in questa soluzione per non meno di 1,5 ore e non più di 2 ore.Questo passaggio consente la penetrazione degli anticorpi.
   2. Lasciate ovociti stabilirsi ~ 2 min. Rimuovere il liquido insieme con il maggior numero possibile di membrane, quindi aggiungere PBS / 0,05% Triton X-100.
      NOTA: Le membrane si depositerà più lento di ovociti laminati.
   3. Lasciate ovociti depositano ~ 2 minuti, quindi rimuovere tutti tranne ~ 1 ml di liquido. ovociti Trasferire graduato da 1,5 ml di tubo e rimuovere il liquido restante. Aggiungere 1 ml PTB per il blocco e nutate per 1 ora.
2. colorazione degli anticorpi
   1. Pre-assorbimento di anticorpi secondari contro embrioni.
      NOTA: Questo passaggio elimina la colorazione di fondo da non specifici anticorpi interazioni con le proteine di Drosophila.
      1. Raccogliere e risolvere embrioni di Drosophila (~ 25 microlitri) per procedura tipica ^8. Conservare in metanolo a -20 ° C.
      2. Rimuovere metanolo da embrioni, aggiungere 800 ml di metanolo più 200 ml 1x PBS, e nutate per 15 min. Togliere 500 ml di surnatante e sostituire con 500 microlitri PBS 1x. Poi nutate per 15 min. Ripetere due volte (per un totale di ~ 1 ora di lavaggi) e quindi completare in PTB.
         NOTA: Gli embrioni possono essere utilizzati immediatamente o mantenimento in nutator per diverse ore a temperatura ambiente.
      3. Rimuovere liquido, riempire con PTB a 200 ml per ovocita di preparazione, e aggiungere anticorpi secondari fluorescenza marcata in opportune diluizioni (tenendo presente che il volume finale sarà di 300 ml;. Vedi punto 7.4) Nutate a 4 ° C per una notte (preferibile) oa temperatura ambiente per 3 a 4 ore.
         NOTA: Gli anticorpi pre-assorbito saranno utilizzati nel passaggio 6.2.4.
         NOTA: I campioni al buio per quanto possibile, una volta sono stati aggiunti anticorpi fluorescenti.
   2. Rimuovere il liquido da ovociti, riempire con PTB a 300 ml, e aggiungere anticorpi primari a diluizioni appropriate. Nutate a 4 ° C per una notte (preferibile) oa temperatura ambiente per 3 a 4 ore.
   3. Lavare ovociti quattro volte per 15 minuti ciascuno con 1 ml PTB.
   4. Rimuovereliquido da ovociti, aggiungere 200 ml di surnatante da embrioni (pre-assorbito anticorpi secondari). Poi riempire con PTB a 300 ml. Nutate a temperatura ambiente per 3 a 4 ore (preferibile) sia a 4 ° C durante la notte.
   5. Lavare ovociti una volta per 15 minuti con 1 ml PTB, rimuovere il liquido. Quindi aggiungere 0,5 ml Hoechst 33342 e 500 microlitri PTB e nutate per 7 minuti.
   6. Lavare ovociti due volte per 15 minuti ciascuno con 1 ml PTB.
      NOTA: ovociti possono essere montati su una slitta immediatamente o possono essere conservati in PTB a 4 ° C fino al momento imaging.

7. FISH (continuare dal punto 5 di cui sopra)

1. Risciacquare ovociti laminati in un tubo da 15 ml contenente 15 ml ~ 2x SSCT. Lasciate ovociti stabilirsi ~ 2 min. Rimuovere tutti ma ~ 0,5 ml di liquido lungo con il maggior numero possibile di membrane.
   NOTA: Le membrane si depositerà più lento di ovociti laminati.
2. Trasferimento ovociti a 0,5 ml di tubo e rimuovere il liquido restante. Successivamente aggiungere e rimuovere 500 microlitri20%, 40%, e 50% formammide soluzioni, oscillante per 10 min in ciascuna soluzione.
   NOTA: Gli oociti si depositerà più lento con percentuali più elevate di formammide.
3. Rimuovere il liquido, quindi aggiungere soluzione formammide 500 microlitri 50%, e nutate a 37 ° C per 1 a 5 ore.
   NOTA: più lunga incubazione si traducono in una migliore penetrazione della sonda.
4. Rimuovere il liquido, lasciando non più di ~ 100 microlitri oociti, e aggiungere la soluzione di ibridazione 36 microlitri più 2 ml di sonda (50 ng / ml) e 2 ml di acqua o 2 microlitri di una sonda 2 ^nd (Tabella 1).
5. Incubare a 91 ° C per 3 min (solo FISH) o 80 ° C per 20 min (FISH più immunofluorescenza), seguita da incubazione in un bagno d'acqua a 37 ° C durante la notte.
   NOTA: Questi passaggi possono essere eseguite in un termociclatore.
6. Non rimuovere il liquido. Aggiungere 500 microlitri soluzione al 50% formammide e nutate a 37 ° C per 1 ora.
7. Lasciare riposare, rimuovere il liquido, aggiungere la soluzione formammide 500 microlitri 50%, und nutate a 37 ° C per 1 ora.
8. Lasciare riposare, rimuovere il liquido, aggiungere la soluzione formammide 500 microlitri 20%, e nutate a temperatura ambiente per 10 min.
9. Eseguire tre lavaggi rapidi in 500 microlitri 2x SSCT (lasciare riposare, eliminare e aggiungere liquido, capovolgere diverse volte, ripetere.) Lasciare riposare, rimuovere il liquido, quindi aggiungere 500 microlitri PTB e nutate per 4 ore.

8. colorazione degli anticorpi dopo la FISH

1. Rimuovere il liquido da ovociti, riempire con PTB a 300 ml e aggiungere 10 ml di anticorpi anti-α-tubulina coniugato con FITC. In alternativa, altri anticorpi possono essere utilizzati, seguendo il protocollo sopra. Nutate a temperatura ambiente per una notte.
2. Lavare ovociti una volta per 15 minuti con 500 microlitri PTB, rimuovere il liquido, quindi aggiungere 0,5 ml Hoechst 33342 e 500 microlitri PTB e nutate per 7 minuti.
3. Lavare ovociti due volte per 15 minuti ciascuno con 500 microlitri PTB.
   NOTA: Gli oociti possono essere montati su una slitta immediatamente o possono essere conservati in PTB a 4 ° C fino al momentoimaging. Mantenere ovociti al buio per quanto possibile, una volta sono stati aggiunti anticorpi fluorescenti.

Ripetere Nome	Cromosoma	Oligo Sequenza *
359	X	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 sequenza di Eric Joyce, comunicazione personale, altre sequenze di Sullivan et al. 8

Tabella 1: sonde FISH per Drosophila ripete centromeriche.

Droga	Solvente	la concentrazione della	concentrazione finale	Tempo di trattamento	Effetto
colchicina	etanolo	125 mm	150 pM	10 min o 30 min	destabilizzare non cinetocore (10 min) 9 o tutti i microtubuli (30 min)
paclitaxel	DMSO	10 mM	10 mM	10 minuti	stabilizzare microtubules
Binucleine 2	DMSO	25 mM	25 micron	20 min	inibire Aurora B chinasi 10

Tabella 2: Trattamento farmacologico.

Risultati

I metodi che abbiamo descritto qui comporterà la raccolta di fase tardo-ovociti Drosophila che rappresentano tre fasi della meiosi (Figura 1). Gli ovociti in profase si distinguono per la presenza della membrana nucleare, che è visibile dalla mancanza di segnale di tubulina nella regione circostante il cariosoma (Figura 1A). Prometafase è il periodo dopo la rottura membrana nucleare durante il quale le assembla mandrino. Durante prometafase, ...

Discussione

Messa in scena Drosophila ovociti

Anche se un cariosoma allungata è spesso visto in ovociti prometafase, utilizzando cariosoma forma di distinguere prometafase da ovociti in metafase può essere problematico. Durante prometafase, il cariosoma inizia come una forma rotonda, si allunga, e poi si ritrae ad una forma rotonda come l'ovocita si avvicina l'arresto metafase. Ciò significa che molti ovociti prometafase non hanno un cariosoma allungata. Inoltre, se ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various