Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Zusammenfassung

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Zusammenfassung

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Einleitung

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protokoll

Anmerkung: Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die temperaturgeregelte Inkubatoren verwendet werden Temperaturen für das Fliegenzucht zu halten und Kreuze, sofern nicht anders vermerkt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie Flies.
   1. Oozyten Sammlungen Prometaphase angereicherte.
      1. Klar erwachsenen Fliegen von gesunden, jungen Aktien oder Quer Kulturen. Alter Flaschen für zwei Tage bei 25 ° C.
         HINWEIS: In der Regel zwei gesunde Flaschen genügt, wenn auch für einige Quer Kulturen benötigt werden.
      2. Nach zwei Tagen sammeln ~ 100 bis 300 Frauen (die zu diesem Zeitpunkt 0 bis 2 Tage alt sind) aus den Flaschen. Die Weibchen müssen nicht Jungfrauen zu sein. Fügen Sie einen Klecks Hefe-Paste auf die Seite eines Fläschchens und legen 30 Frauen und 10 bis 15 Männer jeweils in die yeasted Fläschchen. Alter Phiolen für zwei Tage bei 25 ° C.
   2. Metaphase angereicherte Oozyten Kollektionen.
      1. Sammeln Sie ~ 100 bis 300 Frauen ab Lager oder Quer cultures. Fügen Sie einen Klecks Hefe-Paste auf die Seite eines Fläschchens und legen 30 Frauen jeweils (ohne Männchen hinzugefügt) in die yeasted Fläschchen. Alter Phiolen für drei bis fünf Tage bei 25 ° C.
2. Bereiten Sie Lösungen.
   Hinweis: Die Lösungen werden bei Raumtemperatur unbegrenzt gelagert, wenn nicht anders angegeben.
   1. Prepare Modifizierte Robb-Puffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM Sucrose, 275 mM Natriumacetat, 200 mM Kaliumacetat, 50 mM Glucose, 6 mM Magnesiumchlorid und 5 mM Calciumchlorid. Verwenden 10 N 11: 8 Natriumhydroxid: Kaliumhydroxid pH auf 7,4 zu bringen. Sterilisieren durch Filtration; nicht im Autoklaven. Lagerung bei -20 ° C. nach Bedarf auftauen ~ 200 ml 1x Robb prep pro Eizelle vorzubereiten.
   2. Fixation Solutions.
      1. Option # 1: Vorbereiten Formaldehyd / Heptan-Fixierung. Vorbereitung Fixation Buffer: 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) plus 150 mM Saccharose. Verwenden zu können, machen frisch mit 687,5 ul Fixation Buffer und 312,5 ul 16% Formaldehydpro Eizelle prep.
         ACHTUNG: Handschuhe tragen bei der Verwendung von Formaldehydlösungen in einem Abzug. Entsorgen von Abfällen gemäß gültiger Richtlinien.
      2. Option # 2: Vorbereiten Formaldehyd / Cacodylat Fixierung. Vorbereitung Fix Mix: 250 mM Sucrose, 100 mM Kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM Natriumacetat (pH 7,0) und 25 mM EGTA (pH 8,0). Zur Verwendung machen frisch mit 400 ul Fix-Mix, 100 ul Kaliumcacodylat (1 M, pH 7,2) und 500 & mgr; l 16% Formaldehyd pro Eizelle prep.
         ACHTUNG: Kaliumcacodylat enthält Arsen.
   3. Bereiten PBS / Triton X-100: 1x PBS plus 1% oder 0,05% Triton X-100. Lagerung bei 4 ° C.
   4. Bereiten PBS-Tween 20-Rinderserumalbumin (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v) und 0,1% Tween-20. Kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden.
   5. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Lösungen.
      1. Bereiten 20X Natriumchlorid-Natriumcitrat (SSC): 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat.
      2. Bereiten 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Machen Sie frische, ~ 20 ml pro Eizelle prep.
      3. Bereiten Formamid-Lösungen: 2 x SSC, 0,1% Tween-20, sowie Formamid. Machen Sie frische, 1 ml 20% Formamid, 0,5 ml 40% Formamid und 2 ml 50% Formamid pro Eizelle prep.
         ACHTUNG: Handschuhe tragen, während Formamid Lösungen in einem Abzug mit. Entsorgen von Abfällen gemäß gültiger Richtlinien.
      4. Bereiten Hybridisierungslösung: 2x SSC, 50% Formamid und 10% Dextransulfat (w / v). Lagerung bei 4 ° C.
   6. FISH-Sonden.
      1. Bestellen Oligonukleotide (Tabelle 1 für Sequenzen sehen) mit HPLC - Reinigung und Wunsch 5 'fluoreszierende Modifikation (zB Cy3 oder Cy5). Resuspendieren in Tris-EDTA (TE) bei 50 ng / & mgr; l.
         Hinweis: Schützen Sie Oligos von Lichtexposition zu allen Zeiten.

2. Sammlung der Late-Stage Drosophila Oozyten

1. Wie Drosophila Oozyten mit Membranen intakt haften auf Kunststoff und Glas, Pre-Beschichtung der Innenseite einer 5 - ml - Röhrchen und einer Pasteur - Pipette pro Eizelle prep mit PTB.
2. Anesthetize alle ~ 100 bis 300 yeasted Fliegen mit Kohlendioxid und fügen Sie in einen Mischer enthält ~ 100 ml 1x Robb Buffer. Pulse dreimal (~ 1 Sekunde pro Stück). Halten Sie Eizellen in Robb für <20 min Aktivierung zu vermeiden.
   HINWEIS: Alternativ Eizellen von Frauen von Hand präpariert werden können. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es weniger Weibchen erfordert. Allerdings ist darauf zu Exposition gegenüber Kohlendioxid nur wenige Minuten in Anspruch zu nehmen Artefakte mit Hypoxie assoziiert ⁷ zu vermeiden.
3. Filter durch große Netz (~ 1500 & mgr; m) in 250-ml-Becher große Körperteile zu entfernen. Wenn viele intakte abdomens bleiben auf Mesh, Nachschliff Material zusätzliche Robb Puffer und Filter wieder. Lassen Sie siedeln ~ 2 min, dann obere Schicht absaugen, da viele der großen Körperteile wie möglich zu entfernen.
4. Filter durch kleine Maschen (~ 300 & mgr; m) in einen 250-ml-Becher. Spülen restlichen Eizellen aus den ersten Becher mit zusätzlichen Robb und beschichteten Pasteur-Pipette. Lassen Sie settle ~ 3 min; Eizellen werden absetzen. Aspirieren aber ~ 10 ml ab.
5. Gießen Sie so viel von den 10 ml wie in beschichteten 5-ml-Röhrchen passen. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, und wiederholen Sie mit Rest. Spülen restlichen Eizellen aus Becherglas mit zusätzlichen Robb und beschichteten Pasteur-Pipette. Lassen Sie siedeln in 5-ml-Tube für ~ 3-5 min.

3. Behandlungen mit Arzneimitteln (Optional)

1. Mantel ein zweites 5-ml-Röhrchen mit PTB für jede Eizelle prep. Hinzufügen geeigneten Lösungsmittel (Kontrolle) oder Arzneimittel zu 1 ml Robbs jeweils für jede Oocyte prep (Tabelle 2).
2. Split Eizellen in die zweite beschichtete 5-ml-Tube. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit und 1 ml Robb plus Lösungsmittel in ein Röhrchen und 1 ml Robb plus Medikament in die zweite Röhre. Nutation für entsprechende Menge an Zeit für die Arzneimittelbehandlung (Tabelle 2). Let begleichen.

4. Fixation

1. Absaugen alle Flüssigkeit und fügen sofort 1 ml Fix.
2. Option 1: Formaldehyd / Heptan Fixation (Fixation Buffer plus 5% Formaldehyd).
   1. Fix für 2,5 min auf einer Nutator. 1 ml Heptan und Wirbel 1 min. Lassen Sie settle ~ 1 min.
   2. Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und fügen Sie dann 1 ml 1x PBS. Vortex 30 Sekunden. Lassen Sie settle ~ 1 min.
   3. Entfernen Sie alle Flüssigkeit, und dann füllen Rohr mit 1x PBS.
      HINWEIS: Die Oocyten können sofort oder gehalten auf der Nutator mehrere Stunden bei Raumtemperatur verwendet werden.
3. Option 2: Formaldehyd / Cacodylat Fixierung (Fix Mix plus 8% Formaldehyd und 100 mM Cacodylat).
   1. Fix für 6 min auf einem Nutator. Lassen Sie 2 Minuten absetzen. Entfernen Sie Flüssigkeit, und dann füllen Rohr mit 1x PBS.
      HINWEIS: Die Oocyten können sofort oder gehalten auf der Nutator mehrere Stunden bei Raumtemperatur verwendet werden.

5. Die Membranen Entfernen ( "Rolling")

1. Mit beschichteten Pasteur-Pipette, fügen ~ 500 bis 1.000 Eizellen zur mattiert (sandgestrahlte) Teil eines Glasträger. Entfernen Sie alle Körperteile und Fremdmaterial mit einer Pinzette. Lassen Sie sich nicht Eizellen austrocknen; 1x PBS bei Bedarf hinzufügen.
2. Legen Sie ein Deckglas auf der Eizellen und sanft "rollen" Eizellen, bis alle Membranen werden entfernt (Ziehen der Kante des Deckglases über die Eizellen am besten funktioniert.) Überprüfen Sie regelmäßig die Fortschritte unter dem Mikroskop, das Hinzufügen von mehr 1x PBS wie nötig. Achten Sie darauf, wie zu viel Druck wird die Eizellen zerstören.
   HINWEIS: Nur für Immunofluoreszenz mit 6. Schritt weiter für Fische (mit oder ohne Immun), fahren Sie mit Schritt 7.

6. Antikörper - Färbung von Drosophila Oozyten

1. Extraktion und Blockierung
   1. Spülen gewalzten Oozyten in ein 15 ml konisches Röhrchen mit ~ 15 ml PBS / 1% Triton X-100. Nutation Oozyten in dieser Lösung nicht weniger als 1,5 Stunden und nicht mehr als 2 Stunden.Dieser Schritt ermöglicht Antikörper Penetration.
   2. Lassen Sie Eizellen absetzen ~ 2 min. Entfernen Flüssigkeit zusammen mit so vielen Membranen wie möglich, dann fügen PBS / 0,05% Triton X-100.
      HINWEIS: Die Membranen werden siedeln langsamer als gerollt Eizellen.
   3. Lassen Eizellen absetzen ~ 2 min, dann entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml Flüssigkeit. Transfer-Oozyten abgestuft bis 1,5-ml-Röhrchen und restliche Flüssigkeit zu entfernen. 1 ml der PTB für die Sperrung und Nutation für 1 Stunde.
2. Antikörper-Färbung
   1. Pre-Absorption von sekundären Antikörpern gegen Embryonen.
      HINWEIS: Dieser Schritt eliminiert Hintergrundfärbung von nicht-spezifischen Antikörper - Wechselwirkungen mit Drosophila - Proteine.
      1. Sammeln und beheben Drosophila - Embryos (~ 25 & mgr; l) pro typisches Verfahren ^8. Speichern in Methanol bei -20 ° C.
      2. Entfernen von Methanol aus Embryonen, fügen Sie 800 ul Methanol plus 200 ul 1x PBS und Nutation für 15 min. Entfernen Sie 500 ul Überstand und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Dann nutiert für 15 min. Wiederholen Sie zweimal (für insgesamt ca. 1 Stunde von Waschungen) und dann in der PTB zu beenden.
         HINWEIS: Die Embryonen verwendet werden können, sofort oder auf der Nutator für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gehalten.
      3. Entfernen Sie Flüssigkeit füllen mit PTB bis 200 & mgr; l pro Eizelle prep, und fügen Sie fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper in geeigneten Verdünnungen (wenn man bedenkt, dass das endgültige Volumen von 300 & mgr; l wird, vgl. Schritt 7.4) Nutation bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden.
         HINWEIS: Die vorge absorbierte Antikörper werden in Schritt 6.2.4 verwendet werden.
         HINWEIS: Bewahren Sie Proben im Dunkeln, so viel wie möglich, sobald fluoreszierende Antikörper hinzugefügt wurden.
   2. Entfernen von Flüssigkeit aus Oozyten, füllen mit PTB bis 300 & mgr; l, und fügen Sie primären Antikörper bei geeigneten Verdünnungen. Nutiert bei 4 ° C über Nacht (bevorzugt) oder bei Raumtemperatur für 3 bis 4 Stunden.
   3. Wasch Oozyten viermal für jeweils 15 min mit 1 ml PTB.
   4. EntfernenFlüssigkeit aus Oozyten wurden 200 ul Überstand von Embryonen (vorabsorbiert Sekundärantikörper) hinzuzufügen. Dann füllen sich mit PTB bis 300 & mgr; l. über Nacht nutiert für 3 bis 4 h (bevorzugt) oder bei 4 ° C bei Raumtemperatur.
   5. Waschen Sie Eizellen einmal für 15 Minuten mit 1 ml PTB, entfernen Flüssigkeit. Dann fügen 0,5 ul Hoechst 33342 und 500 ul PTB und Nutation für 7 min.
   6. Waschen Oozyten zweimal für jeweils 15 min mit 1 ml PTB.
      HINWEIS: Die Oocyten können unmittelbar an einem Schlitten montiert werden, oder kann für die Bildgebung in PTB bei 4 ° C bis bereit gespeichert werden.

7. FISH (weiter von Schritt 5 oben)

1. Spülen Sie rollte Eizellen in eine 15 ml konischen Röhrchen mit ~ 15 ml 2x SSCT-. Lassen Sie Eizellen absetzen ~ 2 min. Entfernen Sie alle ~ 0,5 ml Flüssigkeit zusammen mit so vielen Membranen wie möglich.
   HINWEIS: Die Membranen werden siedeln langsamer als gerollt Eizellen.
2. Transfer-Oozyten bis 0,5-ml-Röhrchen und entfernen restliche Flüssigkeit. Nacheinander hinzufügen und 500 ul entfernen20%, 40% und 50% Formamid-Lösungen, Taumel für 10 min in jeder Lösung.
   HINWEIS: Die Oozyten werden mit einem höheren Prozentsatz an Formamid langsamer absetzen.
3. Entfernen Sie Flüssigkeit, fügen Sie dann 500 ul 50% Formamid-Lösung und Nutation bei 37 ° C für 1 bis 5 Stunden.
   HINWEIS: Längere Inkubationen führen zu einer besseren Sonde Penetration.
4. Entfernen Flüssigkeit und hinterlässt nicht mehr als ~ 100 & mgr; l - Oozyten und fügen 36 ul Hybridisierungslösung plus 2 & mgr; l Sonde (50 ng / ul) und 2 ul Wasser oder 2 & mgr; l einer 2 ^nd Sonde (Tabelle 1).
5. bei 91 ° C inkubieren 3 min (FISH only) oder 80 ° C für 20 min (FISH und Immunofluoreszenz), gefolgt von einer Inkubation über Nacht in einem Wasserbad 37 ° C.
   Hinweis: diese Schritte in einem Thermocycler durchgeführt werden.
6. Entfernen Sie nicht flüssig. Hinzufügen 500 ul 50% Formamid-Lösung und nutiert bei 37 ° C für 1 Stunde.
7. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, 500 & mgr; l 50% Formamid-Lösung eind nutiert bei 37 ° C für 1 Stunde.
8. Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, 500 & mgr; l 20% Formamid-Lösung und Nutation bei Raumtemperatur für 10 min.
9. Führen Sie drei schnelle Waschungen in 500 ul 2x SSCT- (lassen, Entfernen dann Flüssigkeit hinzufügen, kehren mehrmals wiederholen.) Lassen Sie, Entfernen Flüssigkeit, dann fügen Sie 500 ul PTB und Nutation für 4 Stunden.

8. Antikörper-Färbung nach FISH

1. Entfernen von Flüssigkeit aus Oozyten, füllen mit PTB bis 300 & mgr; l, und dann werden 10 & mgr; l anti-α-Tubulin-Antikörper an FITC konjugiert. Alternativ können auch andere Antikörper verwendet werden, nach oben Protokoll. über Nacht bei Raumtemperatur Nutation.
2. Waschen Sie Eizellen einmal für 15 Minuten mit 500 ul PTB, entfernen Flüssigkeit, dann fügen 0,5 ul Hoechst 33342 und 500 ul PTB und Nutation für 7 min.
3. Waschen Oozyten zweimal für 15 min mit jeweils 500 ul PTB.
   HINWEIS: Die Oocyten können unmittelbar an einem Schlitten montiert werden, oder sie können für in PTB bei 4 ° C bis bereit gespeichert werdenBildgebung. Halten Sie Eizellen im Dunkeln, so viel wie möglich, sobald fluoreszierende Antikörper hinzugefügt wurden.

Wiederholen Sie Namen	Chromosom	Oligo Sequenz *
359	X	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodeca	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1,686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 - Sequenz von Eric Joyce, persönliche Kommunikation, andere Sequenzen von Sullivan et al. 8

Tabelle 1: FISH - Sonden für Drosophila zentromerischen wiederholt.

Droge	Lösungsmittel	Auf Konzentration	Die Endkonzentration	Behandlungszeit	Bewirken
Colchicin	Ethanol	125 mM	150 & mgr; M	10 min oder 30 min	destabilisieren nicht kinetochore (10 min) 9 oder alle (30 min) Mikrotubuli
Paclitaxel	DMSO	10 mM	10 & mgr; M	10 Minuten	stabilisieren microtubules
Binucleine 2	DMSO	25 mM	25 & mgr; M	20 Minuten	hemmen Aurora B - Kinase 10

Tabelle 2: Die medikamentöse Behandlung.

Ergebnisse

Die Methoden , die wir hier beschrieben haben , in der Sammlung von Spätstadium der Drosophila - Oozyten , die drei Stadien der Meiose (Abbildung 1) wird zur Folge haben . Oozyten in Prophase werden durch das Vorhandensein der Kernhülle aus, die durch das Fehlen von Tubulin - Signal in der Region um die karyosome (1A) sichtbar ist. Prometaphase ist die Zeit, nach der Kernhülle Zusammenbruch während der die Spindel montiert. Während Prometap...

Diskussion

Staging Drosophila Oozyten

Obwohl ein längliches karyosome oft in der Prometaphase Oocyten gesehen wird, karyosome Form unter Verwendung von Metaphase Prometaphase Oozyten unterscheiden kann problematisch sein. Während Prometaphase beginnt die karyosome als eine runde Form, längt, und zieht dann in eine runde Form wie die Eizelle die Verhaftung Metaphase nähert. Dies bedeutet, dass viele der Prometaphase Oozyten keine längliche karyosome haben. Darüber hinaus,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various