Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe<em&gt; Drosophila</em&gt; ovocytes

Résumé

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Résumé

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Introduction

The study of meiosis is sometimes described as the "genetics of genetics". This is because the fundamental properties of chromosome inheritance and independent assortment are carried out through the segregation of chromosomes during gamete production. An important demonstration of the chromosome theory of inheritance came in 1916 from the work of Calvin Bridges in Drosophila melanogaster¹. This and other classical genetics studies in Drosophila contributed greatly to our understanding of genetics. Cytological examination of meiotic chromosomes in Drosophila oocytes, however, has been challenging. This is primarily because immunofluorescence of late-stage Drosophila oocytes, when the spindle assembles and chromosomes are oriented for segregation, is hampered by the presence of membranes that render the oocyte impenetrable to antibodies.

Despite this challenge, Drosophila oocytes remain an attractive model for the study of chromosome behavior and spindle assembly. This is because of the powerful genetic tools available in Drosophila, but also because the oocytes arrest at metaphase I, when the chromosomes are oriented and the spindle is fully formed. This facilitates the collection and examination of large numbers of oocytes at this important stage of cell division. In addition, a simple model organism that is amenable to genetic manipulation for the study of oocyte chromosome segregation can provide an important contribution to our understanding of human reproductive health. Errors in chromosome number are the leading genetic cause of miscarriage and birth defects in humans². A majority of these errors can be traced to the oocyte and are correlated with increasing maternal age. The average age of mothers in the U.S. has been increasing, making this a major public health concern.

We describe here methods for the cytological examination of Drosophila oocytes, including a demonstration of how to remove the oocyte membranes. These methods are modifications of protocols first described by Theurkauf and Hawley³, Zou et al.⁴, and Dernburg et al.⁵. We also include methods for the enrichment of different stages of oocytes, based on a protocol first described by Gilliland et al.⁶. Finally, we add instructions for the drug treatment of Drosophila oocytes. Together, these methods allow the cytological investigation of oocyte chromosome segregation and spindle assembly in Drosophila.

Protocole

Note: Les procédures sont effectuées à la température ambiante, sauf indication contraire. incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures de mouche d'élevage et des croix, sauf indication contraire.

1. Préparatifs

1. Préparer les mouches.
   1. Prométaphase enrichi les collections ovocyte.
      1. Effacer les mouches adultes de jeunes, actions ou croisées cultures saines. bouteilles d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
         NOTE: En général, deux bouteilles saines suffisent, bien que plus peut être nécessaire pour certaines cultures croisées.
      2. Après deux jours, recueillir ~ 100 à 300 femmes (qui sont âgés de 0 à 2 jours à ce stade) des bouteilles. Les femelles ne doivent pas être vierges. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles et 10 à 15 hommes chacun dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
   2. Metaphase enrichi ovocytes Collections.
      1. Collecter ~ 100 à 300 femelles en stock ou cross cultures. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles chacune (sans mâles ajoutés) dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les trois à cinq jours à 25 ° C.
2. Préparer Solutions.
   Nota: Les solutions peuvent être conservés indéfiniment à la température ambiante, sauf indication contraire.
   1. Préparer le tampon de modification de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de saccharose, l'acétate de sodium 275 mM, 200 mM d'acétate de potassium, du glucose 50 mM, du chlorure de magnésium à 6 mM et 5 mM de chlorure de calcium. Utiliser 10 N 11: 8 hydroxyde de sodium et d'hydroxyde de potassium pour amener le pH à 7,4. Stériliser par filtration; n'autoclave pas. Conserver à -20 ° C. Décongeler au besoin pour préparer ~ 200 ml de par ovocyte de préparation 1x Robb.
   2. Solutions de fixation.
      1. Option n ° 1: Préparer le formaldéhyde / heptane fixation. Préparer la fixation du tampon: solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS), ainsi que 150 mM de saccharose. Pour l'utiliser, faire frais avec 687,5 pi Fixation Buffer et 312,5 pi 16% de formaldéhydepar oocyte prép.
         ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation des solutions de formaldéhyde dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles.
      2. Option n ° 2: Préparer le formaldéhyde / cacodylate fixation. Mélanger la préparation Fix: saccharose 250 mM, 100 mM d'acétate de potassium (pH 7,5), d'acétate de sodium 25 mM (pH 7,0) et 25 mM d'EGTA (pH 8,0). Pour l'utiliser, faire fraîche avec 400 ul Fix Mix, 100 cacodylate ul de potassium (1 M, pH 7,2), et 500 ul de 16% formaldéhyde par ovocyte prep.
         ATTENTION: cacodylate de potassium contient de l'arsenic.
   3. Préparer du PBS / Triton X-100: 1 x PBS + 1% ou 0,05% de Triton X-100. Conserver à 4 ° C.
   4. Préparer du PBS-Tween 20 sérum-albumine bovine (BSA) (TBP): 1 x PBS, BSA à 0,5% (p / v) et 0,1% de Tween-20. Peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
   5. Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) Solutions.
      1. Préparer le chlorure de sodium-20X citrate de sodium (SSC): 3 M de chlorure de sodium et 0,3 M de citrate de sodium.
      2. Préparer 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% de Tween-20. Faire frais, ~ 20 ml par ovocyte prep.
      3. Préparer des solutions de formamide: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, ainsi que le formamide. Faire frais, 1 ml 20% de formamide, 0,5 ml 40% de formamide, et 2 ml 50% de formamide par ovocyte prep.
         ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation de solutions de formamide dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles.
      4. Préparer une solution d'hybridation: 2 x SSC, formamide à 50% et 10% de sulfate de dextran (poids / volume). Conserver à 4 ° C.
   6. Sondes FISH.
      1. Ordre des oligonucléotides (voir le tableau 1 pour les séquences) avec une purification par HPLC et désiré 5 'modification fluorescente (par exemple, Cy3 ou Cy5). Remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE) à 50 ng / ul.
         REMARQUE: Protéger oligos d'exposition à la lumière en tout temps.

2. Collection de Late stade Drosophila Ovocytes

1. Comme oocytes Drosophila avec des membranes intactes collera au plastique et le verre, pré-enduire l'intérieur d'un tube de 5 ml et une pipette Pasteur par ovocyte préparation avec TBP.
2. Anesthésier toutes ~ 100 à 300 mouches à la levure avec du dioxyde de carbone et d'ajouter à un mélangeur contenant ~ 100 ml de tampon 1X Robb. Pulse trois fois (~ 1 sec chacun). Gardez oocytes à Robb pour <20 min pour éviter l'activation.
   NOTE: Alternativement, les ovocytes peuvent être disséqués à la main à partir de femelles. L'avantage de cette méthode est qu'elle nécessite moins de femelles. Cependant, des précautions doivent être prises pour limiter l' exposition au dioxyde de carbone à seulement quelques minutes pour éviter les artefacts associés à l' hypoxie ^7.
3. Filtrer à travers de grandes mailles (~ 1 500 um) dans 250 ml bécher pour enlever de grandes parties du corps. Si de nombreux abdomens intacts restent sur un matériau maillé, re-grind à l'aide du tampon de Robb supplémentaires, et le filtre à nouveau. Laisser reposer ~ 2 min, puis Aspirer la couche supérieure, en supprimant autant de grandes parties du corps que possible.
4. Filtre par petites mailles (~ 300 um) dans un bécher de 250 ml. Rincer les ovocytes restants sur premier bêcher en utilisant une pipette Pasteur supplémentaire Robb et enduit. Laisser déposer ~ 3 min; oocytes se déposent. Aspirer tous mais ~ 10 ml.
5. Pour autant des 10 ml que possible pour enduit tube de 5 ml. Laisser reposer, éliminer le liquide, et répéter avec le reste. Rincer les ovocytes restants sur bêcher en utilisant plus pipette Pasteur Robb et enduit. Laissez installer dans 5 ml tube pour ~ 3-5 min.

3. Les traitements médicamenteux (Facultatif)

1. Enduire un deuxième tube de 5 ml avec TBP pour chaque préparation de l'ovocyte. Ajouter un solvant approprié (de contrôle) ou d'un médicament à 1 ml de chacun Robb pour chaque préparation de l' ovocyte (tableau 2).
2. oocytes divisé en deuxième enduit tube de 5 ml. Laisser déposer, retirer le liquide, et ajouter 1 ml Robb plus solvant dans un tube et 1 ml Robb plus de médicament dans second tube. Nutation pour suffisamment de temps pour le traitement médicamenteux (tableau 2). Let régler.

4. Fixation

1. Aspirer tout liquide et ajouter immédiatement 1 ml Fix.
2. Option n ° 1: Formaldéhyde / fixation heptane (Fixation Buffer plus 5% de formaldéhyde).
   1. Fixer pendant 2,5 minutes sur un nutator. Ajouter 1 ml heptane et vortex 1 min. Laisser déposer ~ 1 min.
   2. Retirer tout le liquide, puis ajouter 1 ml PBS 1x. Vortex 30 sec. Laisser déposer ~ 1 min.
   3. Retirer tout le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
      NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
3. Option n ° 2: Formaldéhyde / cacodylate fixation (Fix Mix plus 8% formaldéhyde et cacodylate 100 mM).
   1. Correction de 6 min sur un nutator. Laisser reposer 2 min. Retirer le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
      NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.

5. Retrait Membranes ( "Rolling")

1. Utiliser enduit pipette Pasteur, ajouter ~ 500 à 1000 ovocytes à la partie givré (sablé) d'une lame de verre. Retirez toutes les parties du corps et matériaux en utilisant des pinces étrangères. Ne laissez pas sécher les ovocytes; ajouter 1x PBS si nécessaire.
2. Placez une lamelle sur le dessus des ovocytes et doucement ovocytes «rouler» jusqu'à ce que toutes les membranes sont enlevées (faisant glisser le bord de la lamelle à travers les ovocytes qui fonctionne le mieux.) Contrôler périodiquement les progrès sous le microscope, en ajoutant plus 1x PBS si nécessaire. Faites attention car trop de pression va détruire les ovocytes.
   NOTE: Pour immunofluorescence seulement, passez à l'étape 6. Pour FISH (avec ou sans immunofluorescence), passez à l'étape 7.

6. Anticorps Coloration de Drosophila Ovocytes

1. Extraction et blocage
   1. Rinçage oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml de PBS / 1% de Triton X-100. nutation ovocytes présents dans cette solution pendant au moins 1,5 heure et pas plus de 2 heures.Cette étape permet la pénétration des anticorps.
   2. Laissez oocytes régler ~ 2 min. Éliminer le liquide avec le plus grand nombre possible de membranes, puis ajouter du PBS / 0,05% de Triton X-100.
      REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés.
   3. Laissez oocytes régler ~ 2 min, puis retirez tout mais ~ 1 ml de liquide. oocytes de transfert aux gradués 1,5 ml tube et enlever le liquide restant. Ajouter 1 ml TBP pour bloquer et nutation pendant 1 h.
2. anticorps Staining
   1. Pré-absorption d'anticorps secondaire contre l'embryon.
      REMARQUE: Cette étape élimine la coloration de fond à partir des interactions anticorps non-spécifiques avec des protéines de drosophile.
      1. Recueillir et fixer des embryons de drosophile (~ 25 pi) par procédure typique ^8. Conserver dans le méthanol à -20 ° C.
      2. Éliminer le méthanol à partir d'embryons, ajouter 800 ul de methanol plus 200 ul de 1 x PBS et nutation pendant 15 min. Retirer 500 pi de surnageant et le remplacer par 500 ul PBS 1x. Ensuite nutation pendant 15 min. Répéter deux fois (pour un total de ~ 1 h de lavages), puis terminer en TBP.
         REMARQUE: Embryons peut être utilisé immédiatement ou conservés sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
      3. Retirer du liquide, remplir de TBP à 200 ul par ovocyte prep, et ajouter des anticorps secondaires marqués par fluorescence à des dilutions appropriées (en gardant à l'esprit que le volume final sera de 300 pi;. Voir étape 7.4) nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
         NOTE: Les anticorps pré-absorbés seront utilisés à l'étape 6.2.4.
         NOTE: Conserver les échantillons dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.
   2. Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et d'ajouter des anticorps primaires à des dilutions appropriées. Nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
   3. Laver oocytes quatre fois pendant 15 min chacun avec 1 ml TBP.
   4. Retirerliquide à partir d'ovocytes, ajouter 200 pi de surnageant à partir d'embryons (pré-absorption des anticorps secondaires). Remplissez ensuite avec TBP à 300 pi. Nutation à la température ambiante pendant 3 à 4 heures (de préférence) ou à 4 ° C durant la nuit.
   5. Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 1 ml TBP, enlever le liquide. Puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
   6. Laver oocytes deux fois 15 min chacun avec 1 ml TBP.
      REMARQUE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans la TBP à 4 ° C jusqu'au moment de l'imagerie.

7. FISH (Continuer à partir de l'étape 5 ci-dessus)

1. Rincer oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml 2x SSCT. Laissez oocytes régler ~ 2 min. Retirez tous, mais ~ 0,5 ml de liquide avec autant de membranes que possible.
   REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés.
2. Transfert des ovocytes à 0,5 ml tube et enlever le liquide restant. Successivement ajouter et supprimer 500 pi20%, 40% et 50% des solutions de formamide nutation pendant 10 minutes dans chaque solution.
   NOTE: Les ovocytes se déposent plus lentement avec des pourcentages plus élevés de formamide.
3. Éliminer le liquide, puis ajouter une solution de 500 pi de formamide à 50%, et de nutation à 37 ° C pendant 1 à 5 heures.
   NOTE: Longer incubations se traduisent par une meilleure pénétration de la sonde.
4. Enlever le liquide, en laissant pas plus de ~ 100 ovocytes pi, et d' ajouter 36 ul de solution d'hybridation plus 2 pi de sonde (50 ng / ul) et 2 ul d'eau et 2 ul d'une sonde 2 ^ème (tableau 1).
5. Incuber à 91 ° C pendant 3 min (poissons) ou 80 ° C pendant 20 min (FISH en plus immunofluorescence), suivie d'une incubation dans un bain d'eau à 37 ° pendant une nuit.
   REMARQUE: Ces étapes peuvent être réalisées dans un thermocycleur.
6. Ne pas enlever le liquide. Ajouter 500 ul de solution à 50% de formamide et nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
7. Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 50%, uned nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
8. Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 20%, et nutation à la température ambiante pendant 10 min.
9. Effectuer trois lavages rapides dans 500 ul 2x SSCT (laisser se décanter enlever puis ajouter le liquide, inverser plusieurs fois, répéter.) Laisser déposer, retirer le liquide, puis ajouter 500 ul TBP et nutation pendant 4 heures.

8. Anticorps Coloration après FISH

1. Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et ajouter 10 ul d'anticorps anti-α-tubuline conjugué à FITC. En variante, d'autres anticorps peuvent être utilisés, suivant le protocole ci-dessus. Nutation à la température ambiante pendant une nuit.
2. Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 500 ul TBP, enlever le liquide, puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
3. Laver deux fois oocytes pendant 15 minutes chacun avec 500 ul TBP.
   NOTE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans TBP à 4 ° C jusqu'au moment deimagerie. Gardez oocytes dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.

Répéter Nom	Chromosome	Oligo Sequence *
359	X	GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC	2	AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodéca	3	CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686	2 + 3	AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT	4 (+ Y)	AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 séquence d'Eric Joyce, communication personnelle, d' autres séquences de Sullivan et al. 8

Tableau 1: sondes FISH pour Drosophila répétitions centromériques.

Drogue	Solvant	Concentration en Stock	La concentration finale	Durée du traitement	Effet
colchicine	éthanol	125 mM	150 um	10 min ou 30 min	déstabiliser non-kinétochore (10 min) 9 ou toutes (30 min) microtubules
paclitaxel	DMSO	10 mM,	10 pm	10 minutes	stabiliser microrotubules
Binucleine 2	DMSO	25 mM,	25 pm	20 min	inhiber la kinase Aurora B 10

Tableau 2: Le traitement médicamenteux.

Résultats

Les méthodes que nous avons décrites ici se traduira par la collecte des ovocytes chez la drosophile stade avancé représentant trois étapes de la méiose (Figure 1). Oocytes dans la prophase se distinguent par la présence de l'enveloppe nucléaire, qui est visible par l'absence de signal de la tubuline dans la région entourant le caryosome (figure 1A). Prométaphase est la période après enveloppe ventilation nucléaire ...

Discussion

Staging Drosophila Ovocytes

Bien qu'un caryosome allongé est souvent vu dans les ovocytes prométaphase, en utilisant caryosome forme pour distinguer prométaphase à partir d'ovocytes en métaphase peut être problématique. Pendant prométaphase, l'caryosome commence comme une forme ronde, allonge, puis se rétracte à une forme ronde comme l'ovocyte se rapproche de l'arrestation de métaphase. Cela signifie que de nombreux ovocytes prométaph...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml conical tubes	Various
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC	Sigma	F2168	clone DM1A
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
dextran sulfate	Various
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
formamide	Sigma	47670-250ML-F
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
graduated 1.5 ml tubes	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
Hoechst 33342	Various
magnesium chloride	Various
methanol	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium chloride	Various
sodium citrate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various