JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

انسداد الجراحية فرع البعيدة الأوسط الدماغية الشريان (MCAo) هو نموذج استخداما في البحوث السكتة الدماغية التجريبية. توضح هذه المخطوطة التقنية الأساسية للMCAo دائمة، جنبا إلى جنب مع ادراج نافذة في الجمجمة الجانبي، الذي يتيح الفرصة للintravital المجهري الطولي في الفئران.

Abstract

نقص التروية الدماغية البؤري (أي السكتة الدماغية) قد يسبب إصابات الدماغ الرئيسية، مما أدى إلى خسارة فادحة في وظيفة الخلايا العصبية وبالتالي لمجموعة من السيارات والإعاقات الإدراكية. لها الانتشار الواسع يشكل عبئا صحيا خطيرا، والسكتة الدماغية هي من بين الأسباب الرئيسية للإعاقة على المدى الطويل والموت في جميع أنحاء العالم 1. استعادة وظيفة الخلايا العصبية هو، في معظم الحالات، جزئية فقط. وحتى الآن، وخيارات العلاج محدودة للغاية، ولا سيما بسبب نافذة الوقت ضيق للالجلطات 2،3. تحديد طرق لتسريع التعافي من السكتة الدماغية يبقى هدفا الطبي رئيس. ومع ذلك، فإن هذا قد يعوق رؤى الآلية غير كافية في عملية الانتعاش. الباحثون السكتة الدماغية التجريبية في كثير من الأحيان تستخدم نماذج القوارض من نقص التروية الدماغية البؤري. بعد المرحلة الحادة، وتركز البحث السكتة الدماغية على نحو متزايد في المرحلة الفرعية الحادة والمزمنة التالية نقص التروية الدماغية. تطبق معظم الباحثين السكتة الدماغية دائمة أو ترانانسداد sient من مولودية الجزائر في الفئران أو الجرذان. في المرضى، وانسداد للمولودية الجزائر هي من بين الأسباب الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية 4. إلى جانب انسداد القريب من MCA باستخدام نموذج خيوط، انسداد الجراحي للمولودية الجزائر البعيدة وربما كان النموذج الأكثر استخداما في البحوث التجريبية السكتة الدماغية 5. انسداد من القاصي (لتفرع الشرايين عدسي مخططة) فرع مولودية الجزائر عادة قطع الغيار المخطط ويؤثر في المقام الأول القشرة المخية الحديثة. سفينة انسداد يمكن أن تكون دائمة أو عابرة. استنساخ عالية من حجم الآفة ومعدلات وفيات منخفضة جدا فيما يتعلق بنتائج على المدى الطويل هي المزايا الرئيسية لهذا النموذج. هنا، علينا أن نظهر كيفية إجراء المزمن نافذة في الجمجمة (CW) إعداد الوحشي إلى الجيب السهمي، وبعد ذلك كيفية جراحيا أحداث السكتة الدماغية البعيدة تحت نافذة باستخدام نهج حج القحف. هذا النهج يمكن تطبيقها للتصوير المتتابع للتغيرات الحادة والمزمنة التالية نقص التروية عبربرنامج التحصين الموسع من إلقاء الضوء، متحد البؤر المسح بالليزر، واثنين من الفوتون intravital المجهري.

Introduction

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal7.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)11.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner12. Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows13. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia14. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

الأخلاق بيان: التجارب التي تجرى على الحيوانات أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها Landesamt الامناء Gesundheit اوند Soziales، برلين، ألمانيا (G0298 / 13) ومعايير صلوا اليها، حسب مقتضى الحال. لهذه الدراسة، 10- لشاب يبلغ من 12 أسابيع C57BL / 6J الفئران كانت تستخدم.

1. إعداد النافذة الجانبية المزمنة الجمجمة

  1. أداء التخدير مع الحقن تحت الجلد من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). اختبار لتخدير كاف مع منبه الألم.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية والجراحي الميداني مع 70٪ من الإيثانول.
  3. إزالة الشعر من فروة الرأس والرقبة للعيون باستخدام ماكينة حلاقة القوارض.
  4. إصلاح الرأس في إطار المجسم.
  5. استخدام ديكسبانتينول مرهم العين في كلتا العينين لتجنب الجفاف.
  6. تنظيف المنطقة الجراحية لإزالة كل الشعر وتعقيمها مع 3 طبقات من 74.1٪ من الإيثانول و 10٪ 2-بروبرانولول.
  7. أداء خط الوسطشق من الرقبة إلى عيون باستخدام مشرط.
  8. تمتد رفرف الجلد مع 4 خيوط خيام.
  9. إزالة السمحاق بعناية في نصف الكرة المخية الأيسر عن طريق كشط تشغيله مع مشرط إلى النقطة التي تبدأ العضلات الزمنية.
    ملاحظة: هذا إعداد يخدم أيضا لإنشاء منطقة التصاق جيدة للالغراء الأسنان، الذي يحدد غطاء زجاجي.
  10. أداء حج القحف الجبهي الجداري التي يبلغ قطرها 4 مم ترقق الجمجمة على حافة رفرف العظام باستخدام microdrill. تطبيق محلول ملحي أثناء الحفر لتجنب الإصابة الحرارة.
  11. رفع رفرف العظام مع قنية وإزالته باستخدام microforceps.
  12. ري بعناية وعلى نطاق واسع مع محلول ملحي.
  13. خلط الغراء الأسنان حتى أنه لديه الاتساق السليم وليس السائل (أي الغراء لا ينبغي أن تنتج عن المواضيع بعد الآن). وضعه على العظم حول حج القحف.
  14. وضع غطاء زجاجي بقطر 6 ملم على الغراء استعداد واصلاحها مع الالبريد بقية الغراء الأسنان. مما لا شك فيه أنه ماء. انتظر حتى يجف الغراء وصعبة وذلك باختباره مع ملقط.
    ملاحظة: والري إضافية يسرع عملية الشفاء.
  15. إزالة الغرز خيام وإغلاق الجرح مع الغرز الجلد.
  16. سحب ما يصل إلى الجلد من الجهة من الفأرة. اضافة الى وجود إبرة تحت الجلد واستبدال بلطف 0.5 مل من تحت الجلد ملحي معقم لتوازن السوائل.
  17. بعد الجراحة، والحفاظ على الحيوانات في قفص الانتعاش ساخنة لمدة 90 دقيقة. انتظر حتى الحيوانات مستيقظا تماما قبل تركهم دون مراقبة. انتظر حتى يتم استرداد الحيوانات تماما قبل إعادتهم إلى قفص مع غيرها من الحيوانات.
  18. كرر تحت الجلد استبدال حجم المالحة بعد حوالي 12 ساعة، كما هو موضح في الخطوة 1.16.
  19. تطبيق دائما تسكين خلال أنبوب تغذية أو مباشرة في تجويف الفم بعد الجراحة (مثل الباراسيتامول (10 ملغ / مل) أو غيرها من العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات).
  20. افحص ال حالة من الحيوانات بعد كل يوم الجراحة، ودائما توفر المهروسة الأغذية الحيوانية على الأرض في طبق بتري لجعل الأكل بسيطة ولتجنب فقدان الوزن حرجة بعد الجراحة.
    ملاحظة: intravital المجهري يمكن أن يؤديها في اليوم الأول بعد إعداد نافذة في الجمجمة.
  21. تطبيق الأيزوفلورين التخدير وعلاج هذه الحيوانات في صاحب الرأس. فتح خياطة الجلد وتنظيف النافذة مع براعم القطن وملحي معقم. بعد 24 ساعة، يجب أن تملأ نافذة الجمجمة مع السائل النخاعي من هذه النقطة الزمنية، والتي تمكن التصوير. أداء التصوير باستخدام بروتوكولات المجهر إنشاء 18.

2. القاصي MCAo

ملاحظة: الإجراء MCAo يجب أن يتم تنفيذ حوالي 5 د بعد إعداد CW. هذا يقلل من تدخل من رد فعل جهاز المناعة الناجمة عن إعداد CW مع رد فعل جهاز المناعة الناجم عن السكتة الدماغية.

"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة على القاصي MCAo. ج: هذه لمحة لطيفة عن السفن قبل المرجع. ب- السفن بعد أول اتصال ثنائي القطب. جيم السفن بعد اتصال ثنائي القطب الثاني. دال نظرة عامة عن السفن التي تغلق تماما الآن. E. نظرة عامة النهائية مع انخفاض التكبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تخدير الفئران باستخدام قناع التخدير ونظام مخدر المناسب، بالتشاور مع الموظفين البيطريين (على سبيل المثال، الاستقراء مع 1،5-2٪ الأيزوفلورين والصيانة مع 1،0-1،5٪ الأيزوفلورين في 2/3 N 2 O و 1/3 O 2 عن طريق المرذاذ).
  2. حلاقة و ازالة الشعر وتطهير الجلد والفرو المحيطة بها مع وكيل المناسب (على سبيل المثال، 70٪ الكحول الإيثيلي)، وجففها بعد ذلك.
  3. الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الفئران في 36.5 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية أثناء الجراحة. هناك ردود فعل تسيطر عليها سادة التدفئة، يسخن وفقا لدرجة حرارة الجسم من الفأرة، ينصح بشدة.
  4. وضع الحيوان في الوضع الأفقي. إصلاح الأنف في قناع التخدير وضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 1،0-1،5٪.
  5. تطبيق مرهم الرطب (ديكسبانتينول) لكلتا العينين.
  6. استخدام شق الجلد التي جرت لتقديم CW.
  7. فصل بلطف الجلد وتحديد العضلات الزمنية تحتها.
  8. ضبط الطاقة من المولد عالية التردد (5-7 W) واستخدام وضع ثنائي القطب.
  9. استخدام ملقط الكهربي وإزالة بعناية العضلات الزمنية من الجمجمة، وخلق رفرف العضلات، دون إزالة تماما العضلات.
  10. التعرف على MCA تحت الجمجمة شفافة في جزء منقاري من المنطقة الزمنية، الظهرية إلى الرجعية أوربيتال الجيوب الأنفية. إذا لا يمكن تحديد التشعب مولودية الجزائر، في محاولة لتحديد الوعاء الأكثر منقاري.
  11. رقيقة الجمجمة فوق فرع مولودية الجزائر مع microdrill بينما لري بشكل مستمر لتجنب الضرر الحرارة.
  12. رفع العظام مع قنية وإزالته مع microforceps.
  13. تقليل الطاقة من المولد عالية التردد إلى 3-5 دبليو
  14. الاقتراب من الشريان من فوق وتلمس برفق مع ملقط القطبين على كلا الجانبين من دون رفع السفينة.
  15. تخثر الشريان بشكل قريب وبشكل أقصى للالتشعب السفينة.
  16. انتظر لمدة 30 ثانية، ثم المس الشريان بلطف لضمان تدفق الدم وتوقف بشكل دائم. كرر كهربي إذا لوحظ على إعادة الاستقناء.
  17. إصلاح العضلات الزمنية مع 1 أو 2 غرز في الإدراج العضلات لتغطية عيب العظم، إذا أمكن ذلك.
  18. خياطة الجرح ووضع الحيوان في مربع الانتعاش ساخنة. بشكل عام، والانتعاش الحيوانات بسرعة بعد anest متقلبةhesia.
  19. لاستبدال وحدة التخزين، وتطبيق 0.5 مل من تحت الجلد ملحي معقم، كما هو موضح في الخطوة 1.16.
  20. بعد الجراحة، والسماح للحيوانات للبقاء في قفص الانتعاش ساخنة لمدة 90 دقيقة. انتظر حتى الحيوانات واعية قبل تركهم دون مراقبة. العودة فقط منهم إلى قفص مع غيرها من الحيوانات عندما يتم استردادها بالكامل.
  21. تكرار استبدال وحدة التخزين، كما هو موضح في الخطوة 1.16، بعد 12 ساعة.
  22. تطبيق تسكين بعد العملية الجراحية عن طريق مياه الشرب (على سبيل المثال، الباراسيتامول (10 ملغ / مل) أو غيرها من العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات).
  23. فحص الحالة الصحية للحيوانات كل يوم بعد الجراحة. توفير المواد الغذائية الحيوانية المهروسة في طبق بتري على الأرض لتبسيط الأكل والتقليل من فقدان الوزن بعد العملية الجراحية.

3. الشام العلاج

  1. تنفيذ كافة الإجراءات مماثل على الخطوات 1 و 2، المذكورة أعلاه، بما في ذلك الأسلحة الكيميائية إعداد ما عدا لا يتخثر ع الدماغي الأوسط تتعرضTERY.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الجدول الزمني ونتائج ممثلة في الشكلين 2 و 3. إعداد نافذة في الجمجمة، مع صغير جانبي نافذة في الجمجمة إلى الجيب السهمي العلوي (الشكل 2 B، C، D) النتائج في معدل الوفيات والمراضة منخفضة جدا عندما يقوم بها جراح من ذوي الخبرة. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

السكتة الدماغية هي من بين الأسباب الرئيسية للإعاقة على المدى الطويل والموت في جميع أنحاء العالم 1. ما وراء العلاج الحادة، والتحقيق في نهج وآليات جديدة لتسريع وتعزيز الانتعاش بعد السكتة الدماغية يبقى هدفا الطبي رئيس 7. الباحثون السكتة الدماغية التجريبية ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VP is a participant in the Charité Clinical Scientist Program, funded by the Charité - Universitätsmedizin Berlin and the Berlin Institute of Health. TB is an SNSF PostDoc Mobility fellow. The authors receive grant support from EinsteinStiftung/A-2012-153 to PV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Binocular surgical microscopeZeissStemi 2000 C
Light source for microscopeZeissCL 6000 LED
Heating pad with rectal probeFST21061-10
Stereotactic frameKopfModel 930
Anaethesia system for isofluraneDraeger
IsofluraneAbott
Dumont forceps #5FST11251-10
Dumont forceps #7FST11271-30
Bipolar ForcepsErbe20195-501
Bipolar Forceps Erbe                              20195-022
MicrodrillFST                              18000-17         
Needle holderFST12010-14
5-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
7-0 silk sutureFeuerstein,Suprama
8-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
Veterinary Recovery ChamberPeco ServicesV1200

References

  1. Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
  2. Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
  3. Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
  4. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  5. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  7. Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
  8. Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
  9. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  10. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
  11. Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
  12. Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
  13. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
  14. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
  16. Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
  17. Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
  19. Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
  20. Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
  21. Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  22. Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
  23. Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
  24. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
  25. Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  26. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  27. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
  28. Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  29. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  30. Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
  31. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118 MCAO intravital

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved