측면 만성 두개골 창 준비 활성화<em&gt; 생체</em&gt; 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

요약

말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.

초록

초점 대뇌 허혈 (즉, 허혈성 뇌졸중)은 신경 기능의 심각한 손실을 결과적으로 모터 및인지 장애의 호스트로 이어지는 주요 뇌 손상의 원인이 될 수 있습니다. 스트로크 ¹ 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다으로 높은 유병률은, 심각한 건강 부담을 포즈. 신경 기능의 회복은, 대부분의 경우, 단지 부분이다. 지금까지 치료 옵션은 매우 인해 혈전 용해 ^2,3의 좁은 시간 창에 특히 제한됩니다. 뇌졸중에서 회복을 가속화하는 방법을 결정하는 주요 의료 목표 남아있다; 그러나, 이는 복구 프로세스에 충분한 기계적 통계에 의해 방해되어왔다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 급성기를 넘어, 뇌졸중 연구는 점점 뇌허혈 다음 서브 급성 및 만성 단계에 초점을 맞추고 있습니다. 대부분의 행정 연구원이 적용 영구 또는 트란마우스 또는 쥐의 MCA의 지어서 transient 폐색. 환자에서 MCA 폐색의 허혈성 뇌졸중 ^(4)의 가장 흔한 원인들이다. 필라멘트 모델을 사용하여, MCA 폐색의 근위 외에 원위 MCA 폐색 수술 실험 스트로크 연구 ^5에서 가장 자주 사용되는 모델은 아마도. MCA 분기합니다 (lenticulo - 선조체 동맥의 분지에) 원위의 폐색은 일반적으로 선조체 여분 주로 신피질에 영향을 미친다. 혈관 폐색은 영구적 또는 일시적 일 수있다. 장기적인 결과에 대해 병소 용적과 매우 낮은 사망률의 재현성이 모델의 주요 이점이다. 여기, 우리는 시상 동에 만성 두개골 창 (CW) 준비 측면을 수행하고, 이후에 어떻게 개두술 방법을 사용하여 창 아래에 말단 행정을 유도 외과 적 방법을 보여줍니다. 이러한 접근법을 통해 허혈성 급성 및 만성 변화 순차 촬상 적용될 수있다, 공 초점 레이저 스캐닝 및 이광자 현미경 생체 내에 에피 - 조명.

서문

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide¹, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact^6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal⁷.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia^9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)¹¹.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner¹². Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows¹³. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia¹⁴. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance^15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

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프로토콜

윤리 선언문 : 동물 과목을 포함하는 실험은 적용 가능한 Landesamt FUER 아퍼 싶게 Soziales, 베를린, 독일 (G0298 / 13) 및 도착 도착 기준에 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 12 주령의 수컷 C57BL / 6J 마우스에 대한 연구, 10을 사용 하였다.

1. 측면 만성 두개골 창 준비

1. 케타민 (90 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (/ kg 10 mg)의 피하 주사로 마취를 수행합니다. 통증 자극에 적절한 진정 작용에 대한 시험.
2. 70 % 에탄올로 수술 도구와 수술 부위를 소독.
3. 설치류 면도기를 사용하여 눈에 목 두피 머리를 제거합니다.
4. 정위 프레임에 머리를 고정합니다.
5. 탈수를 방지하기 위해 두 눈에 dexpanthenol 눈 연고를 사용합니다.
6. 모든 머리카락을 제거하고 74.1 %의 에탄올의 3 층과 10 % 2 프로프라놀롤로 소독 할 수있는 외과 영역을 청소합니다.
7. 중간 선을 수행합니다메스를 사용하여 눈 목 절개.
8. 4 텐팅 (tenting) 봉합으로 피부 플랩에 걸쳐.
9. 시간적 근육이 시작되는 지점에 메스를 긁어하여 왼쪽 반구에 조심스럽게 골막을 제거합니다.
   주 :이 제제는 상기 커버 유리를 해결 치과 용 접착제에 대한 양호한 접착 성 영역을 생성하는 역할을한다.
10. microdrill를 사용하여 뼈 플랩의 가장자리에 두개골을 얇게하여 4mm의 직경 전두 - 두정엽의 개두술을 수행합니다. 열 손상을 방지하기 위해 시추하는 동안 생리 식염수를 적용합니다.
11. 캐 뉼러에 뼈 플랩을 올리고 microforceps를 사용하여 제거합니다.
12. 식염수로 조심스럽게 광범위하게 관개.
13. 이 적절한 농도를 갖는 유체 아니다까지 치과 용 접착제를 혼합 (즉, 접착제가 더 이상 스레드를 생성 안된다). 개두술 주위의 뼈에 놓습니다.
14. 제조 된 접착제에 6 mm 직경 커버 글라스를 놓고 번째로 해결치과 용 접착제의 전자 휴식. 이 방수 있는지 확인합니다. 접착제가 집게로 검사하여 하드 건조하고 될 때까지 기다립니다.
    주 : 추가 관개는 경화 과정을 가속화합니다.
15. 텐팅 (tenting)의 봉합사를 제거하고 피부 봉합에 상처를 닫습니다.
16. 마우스의 측면의 피부를 당겨. 바늘 피하에 삽입하고 부드럽게 유체 균형을 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml를 대체합니다.
17. 수술 후, 90 분 동안 가열 복구 케이지에 동물을 유지합니다. 동물 무인을 떠나기 전에 완전히 깨어 때까지 기다립니다. 동물이 완전히 다른 동물 케이지에게 반환하기 전에 복구 될 때까지 기다립니다.
18. 단계 1.16에 기술 된 바와 같이, 약 12 ​​시간 후에 피하 식염수 볼륨 교체 반복한다.
19. 항상 수술 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제) 후 구강으로 삽입 위관을 통해 직접 진통제를 적용한다.
20. 확인 매일 수술 후 동물의 상태, 항상은 페트리 접시 간단한 식사를 만들 및 수술 후 중요한 체중 감소를 방지하기 위해 바닥에 동물 음식을 으깬 제공합니다.
    주 : 생체 내에 현미경 두개 창이 제조 후 첫 날에 수행 될 수있다.
21. 이소 플루 란 마취를 적용하고 헤드 홀더에 동물을 고정합니다. 피부 봉합을 열고 면봉과 멸균 식염수 창을 청소합니다. 24 시간 후, 두개골 창이 영상을 가능하게 그 시점에 의해 뇌척수액으로 가득해야합니다. 설립 현미경 프로토콜 ^18을 사용하여 이미지를 수행합니다.

2. 말초 MCAO

참고 : MCAO 절차는 CW 준비 후 약 5 D를 수행해야합니다. 이는 뇌졸중 유도 면역 반응과 CW 제제에 의한 면역 반응의 간섭을 최소화한다.

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원위 MCAO 1. 개요도. A.이 연산 전에 선박에 대한 좋은 개요입니다. 첫 번째 바이폴라 접촉 후 B에 선박. 두 번째 바이폴라 접촉 후 C를 혈관. D. 완전히 지금은 폐쇄 된 선박에 대한 개요. 낮은 배율 E. 최종 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 수의학 직원 (과 협의에 마취 마스크와 적절한 마취 정권을 사용하여 마우스를 마취 예를 들어, 1.5 유도 - 2/3 N ₂ O 1/3 O ₂ 1.5 % 이소 플루 란을 통해 - 2 % 이소 플루 란과 1.0 유지 보수 기화기).
2. (면도하고 머리를 제거하고 적절한 에이전트로 피부와 주변 모피 소독예를 들면, 70 % 에틸 알코올), 그 후이를 건조.
3. 36.5 ℃에서 쥐의 체온을 유지 수술 중에 0.5 ° C, ±. 마우스의 직장 온도에 따라 가열 피드백 제어 가열 패드는 매우 좋습니다.
4. 측면 위치에 동물을 배치합니다. 마취 마스크의 코를 수정하고 1.0에 이소 플루 란 농도를 조정 - 1.5 %.
5. 두 눈에 젖은 연고 (dexpanthenol)를 적용합니다.
6. CW 준비를 위해 만든 피부 절개를 사용합니다.
7. 부드럽게 피부를 분리하고 아래 시간 근육을 식별합니다.
8. 고주파 발전기의 에너지 조절 (5-7 W)를 바이폴라 모드를 사용한다.
9. electrocoagulation 집게를 사용하여 조심스럽게 완전히 근육을 제거하지 않고, 근육 플랩을 만드는 두개골에서 시간적 근육을 제거합니다.
10. , 시간 영역의 주동이의 부분에 투명 두개골 아래 MCA를 확인 레트로 ORBITA에 지느러미리터의 동. MCA 분기점을 식별 할 수없는 경우, 용기가 가장 입쪽 식별하려고.
11. 지속적으로 열 손상을 방지하기 위해 관개 동안 microdrill와 MCA 분기 위에 얇은 두개골.
12. 캐 뉼러에 뼈를 들어 올려 microforceps으로 제거합니다.
13. W. 5 - (3)에 고주파 발전기의 에너지를 감소
14. 위에서 동맥에 접근 조심스럽게 용기를 해제하지 않고 양쪽에 바이폴라 집게으로 만지지.
15. 용기 분기점에 근위 및 원위 혈관 응고.
16. 30 초 동안 기다린 후 혈액의 흐름이 영구적으로 중단되도록 부드럽게 동맥을 터치합니다. 개통이 관찰되는 경우 electrocoagulation를 반복합니다.
17. 가능하면, 뼈의 결함을 커버하는 근육에 삽입 한 2 바늘 시간적 근육 수정.
18. 상처를 봉합하고, 가열 회수 상자에 동물을 배치합니다. 빨리 휘발성 ANEST 후 일반적으로, 동물 복구hesia.
19. 단계 1.16의 설명에 따라 볼륨 대체를 들어, 멸균 생리 식염수를 피하 0.5 ml에 적용됩니다.
20. 수술 후, 동물은 90 분 동안 가열 복구 케이지에 체류 할 수 있습니다. 동물 무인을 떠나기 전에 의식이 될 때까지 기다립니다. 그들이 완전히 회복되는 경우에만 다른 동물과 케이지로 돌아갑니다.
21. 12 시간 후, 단계 1.16에 설명 된대로 볼륨 대체를 반복합니다.
22. 마시는 물 (예를 들어, 파라세타몰 (10 ㎎ / ㎖), 또는 다른 비 스테로이드 성 항염증제)를 통해 수술 후 통증을 적용한다.
23. 수술 후 매일 동물의 건강 상태를 확인합니다. 식사를 단순화하고 수술 후 체중 감소를 최소화하기 위해 바닥에 페트리 접시에 으깬 동물 음식을 제공합니다.

3. 위장 치료

1. 위 포함한 CW가 노출 된 중간 대뇌 아칸소 응고하지 않는 준비을 제외한 설명 된 1 단계와 2 단계로 동일하게 모든 절차를 수행tery.

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결과

타임 라인 대표적인 결과는도 2 및도 3에 도시되어있다. 우수한 시상 동 (도 2 B, C, D) 숙련 된 의사에 의해 수행되는 매우 낮은 사망률과 질병률 레이트 결과 작은 두개 창 폭과 뇌 창 제제. 10 동물 모두 생존, 모든 만성 CW도 이십팔일 수술 후 고품질의 화상을 위해 사용될 수있다. 상처 감염 또는 다른 합병증 문제는 없었다.

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토론

스트로크 ¹ 전 세계적으로 장기 장애와 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 급성 치료, 가속 및 뇌졸중 후 회복을 향상시키기 위해 새로운 접근 방식과 메커니즘을 조사 외에도 주요 의료 목표 ⁷ 남아있다. 실험 행정 연구원은 자주 국소 뇌허혈의 설치류 모델을 사용한다. 사실, 일시적 또는 영구적 유도 MCAO 모델은 환자 ⁴ 국소 뇌허혈의 가장 흔한 유형 중 하나를 모방. MCA 폐?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	Kopf	Model 930
Anaethesia system for isoflurane	Draeger
Isoflurane	Abott
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Bipolar Forceps	Erbe	20195-501
Bipolar Forceps	Erbe                              20195-022
Microdrill	FST                              18000-17
Needle holder	FST	12010-14
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200