Lateral Crônica Cranial Janela Preparação Ativa<em&gt; In Vivo</em&gt; Observação Após Distal Middle Cerebral Oclusão da Artéria em Ratos

Resumo

oclusão cirúrgica de um ramo distal da artéria cerebral média (MCAo) é um modelo usado com freqüência em pesquisa acidente vascular cerebral experimental. Este manuscrito descreve a técnica básica de MCAo permanente, combinada com a inserção de uma janela craniana lateral, que oferece a oportunidade para microscopia intravital longitudinal em ratinhos.

Resumo

Isquemia cerebral focal (ou seja, acidente vascular cerebral isquémico) pode causar lesão cerebral principal, que conduz a uma perda grave da função neuronal e, consequentemente, a um hospedeiro de motor e deficiências cognitivas. Sua alta prevalência coloca um problema de saúde grave, como acidente vascular cerebral é uma das principais causas de incapacidade a longo prazo e de morte em todo o mundo ^1. A recuperação da função neuronal é, na maioria dos casos, apenas parcial. Até agora, as opções de tratamento são muito limitadas, em particular devido à janela de tempo estreita para trombólise ^2,3. Que determina os métodos para acelerar a recuperação de acidente vascular cerebral continua a ser um objectivo médico prime; No entanto, isto tem sido dificultado pela insuficiência de conhecimentos mecanísticos para o processo de recuperação. pesquisadores tempos experimentais frequentemente empregam modelos de roedores de isquémia cerebral focal. Para além da fase aguda, a investigação acidente vascular cerebral é cada vez mais centrada na fase sub-aguda e crónica após isquemia cerebral. A maioria dos pesquisadores AVC aplicar permanente ou tranSIENT oclusão da MCA em ratinhos ou ratos. Em pacientes, oclusões do MCA estão entre as causas mais frequentes de acidente vascular cerebral isquêmico ^4. Além de oclusão proximal da MCA utilizando o modelo de filamento, oclusão cirúrgica do MCA distal é provavelmente o modelo mais utilizado na pesquisa acidente vascular cerebral experimental ^5. Oclusão de um distal (à ramificação das artérias lenticulo-estriadas) MCA ramo normalmente poupa o estriado e afeta principalmente o neocórtex. oclusão do vaso pode ser permanente ou transitória. Alta reprodutibilidade do volume de lesão e as taxas de mortalidade muito baixas em relação ao resultado a longo prazo são as principais vantagens deste modelo. Aqui, demonstramos como realizar uma janela craniana (CW) preparação crônica lateral ao seio sagital e, posteriormente, como na cirurgia de induzir um acidente vascular cerebral distal debaixo da janela usando uma abordagem craniotomia. Esta abordagem pode ser aplicada para imagiologia sequencial de alterações agudas e crónicas após isquemia atravésepi-iluminação, confocal de varredura a laser, e de dois fótons de microscopia intravital.

Introdução

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide¹, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact^6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal⁷.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia^9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)¹¹.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner¹². Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows¹³. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia¹⁴. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance^15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

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Protocolo

ÉTICA DECLARAÇÃO: Experimentos envolvendo indivíduos animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlim, Alemanha (G0298 / 13) e os critérios de chegar, conforme aplicável. Para este estudo, 10 a 12 do sexo masculino semanas de idade C57BL / 6J foram usadas.

1. Lateral Crônica Cranial Preparação Janela

1. Realizar a anestesia com uma injecção subcutânea de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Teste para sedação adequada com um estímulo doloroso.
2. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos e campo cirúrgico com 70% de etanol.
3. Remova o cabelo do couro cabeludo desde o pescoço até os olhos usando uma máquina de barbear roedor.
4. Fixar a cabeça em um quadro estereotáxico.
5. Use dexpantenol pomada olho em ambos os olhos para evitar a desidratação.
6. Limpar a área cirúrgica para remover todos os pêlos e esterilizá-lo com 3 camadas de 74,1% de etanol e 10% de 2-propanolol.
7. Executar uma linha médiaincisão do pescoço para os olhos usando um bisturi.
8. Abrangem o retalho de pele com 4 suturas tenting.
9. Remover cuidadosamente o periósteo no hemisfério esquerdo raspando-o com um bisturi para o ponto onde começa o músculo temporal.
   NOTA: Esta preparação também serve para criar uma boa área de adesão para a cola dental, que fixa a tampa de vidro.
10. Realizar uma craniotomia fronto-parietal com um diâmetro de 4 mm diluindo o crânio na borda do retalho ósseo usando um microdrill. Aplicar soro fisiológico durante a perfuração para evitar lesões de calor.
11. Elevar o retalho ósseo com cânulas e removê-lo usando micropinças.
12. Lavar cuidadosamente e extensivamente com solução salina.
13. Misture a cola dentária até que tenha a consistência apropriada e não é fluido (isto é, a cola não deve produzir fios mais). Coloque-o sobre o osso ao redor da craniotomia.
14. Coloque uma tampa de vidro com um 6 mm de diâmetro na cola preparada e corrigi-lo com the resto da cola dentária. Certifique-se de que é estanque. Aguarde até que a cola é seco e duro, testando-a com uma pinça.
    NOTA: Uma irrigação adicional acelera o processo de cura.
15. Retirar as suturas tenting e fechar a ferida com suturas de pele.
16. Puxe a pele do flanco do mouse. Inserir uma agulha subcutânea e gentilmente substituir 0,5 ml de solução salina estéril por via subcutânea para o equilíbrio de fluidos.
17. Após a cirurgia, manter os animais na gaiola recuperação aquecida durante 90 min. Espere até que os animais são completamente acordado antes de deixá-los sozinhos. Espere até que os animais são completamente recuperado antes de devolvê-los a uma gaiola com outros animais.
18. Repetir a substituição do volume de solução salina por via subcutânea, após cerca de 12 horas, tal como descrito no passo 1.16.
19. Sempre aplicar analgesia através de sonda gástrica ou directamente para dentro da cavidade oral após a cirurgia (por exemplo, paracetamol (10 mg / ml) ou outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides).
20. Verifica a condição dos animais todos os dias após a cirurgia, e sempre fornecem purê de alimentos de origem animal no chão, em uma placa de petri para tornar a alimentação simples e para evitar a perda de peso crítico após a cirurgia.
    NOTA: microscopia intravital pode ser realizada no primeiro dia após a preparação janela craniana.
21. Aplicar anestesia isoflurano e corrigir o animal em um suporte de cabeça. Abra a sutura da pele e limpar a janela com cotonetes e solução salina estéril. Após 24 h, a janela craniana deve ser preenchido com fluido cerebrospinal por esse ponto de tempo, que permite a criação de imagens. Realizar imagem usando protocolos de microscopia estabelecidos ^18.

2. Distal MCAo

NOTA: O procedimento MCAo deve ser realizada cerca de 5 d após a preparação CW. Isto minimiza a interferência a partir da reacção imune causada pela preparação CW com a reacção imune induzida por acidente vascular cerebral.

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Figura 1. Visão Geral do Distal MCAo. A. Esta é uma boa visão geral sobre os vasos antes do op. B. Os vasos após o primeiro contato bipolar. C. Os vasos após segundo contato bipolar. D. A visão geral sobre os vasos, que são completamente fechados agora. E. visão geral final com menor ampliação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Anestesiar os ratos usando uma máscara de anestesia e um regime anestésico adequado, em consulta com o pessoal veterinário (por exemplo, indução com 1,5-2% isoflurano e manutenção com 1,0-1,5% de isoflurano em 2/3 N ₂ O e 1/3 _O2 via um vaporizador).
2. Raspar e remover o cabelo e desinfectar a pele e pele circundante com um agente apropriado (por exemplo, álcool etílico a 70%), e secá-lo depois.
3. Manter a temperatura do corpo dos ratos a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante a cirurgia. Uma realimentação controlada almofada de aquecimento, aquecido de acordo com a temperatura rectal do rato, é altamente recomendável.
4. Coloque o animal na posição lateral. Corrigir o nariz na máscara de anestesia e ajustar a concentração de isoflurano para 1,0-1,5%.
5. Aplicar pomada molhado (dexpantenol) para ambos os olhos.
6. Use a incisão na pele feita para a preparação CW.
7. Suavemente separar a pele e o músculo temporal identificar por baixo.
8. Ajustar a energia do gerador de alta frequência (5-7 W) e utilizar o modo bipolar.
9. Use a pinça eletrocoagulação e remova cuidadosamente o músculo temporal do crânio, criando um retalho do músculo, sem remover totalmente o músculo.
10. Identificar o MCA abaixo do crânio transparente na parte rostral da área temporal, dorsal à retro-orbital sinusal. Se a bifurcação MCA não pode ser identificado, tentar identificar o recipiente mais rostral.
11. Diluir o crânio acima do ramo MCA com uma microdrill enquanto continuamente irrigação para evitar danos causados ​​pelo calor.
12. Levante o osso com cânulas e removê-lo com micropinças.
13. Diminuir a energia do gerador de alta frequência para 3-5 W.
14. Aproxime-se da artéria de cima e suavemente tocá-lo com as pinças bipolares de ambos os lados, sem levantar a embarcação.
15. Coagular a artéria proximal e distal à bifurcação navio.
16. Espere por 30 segundos e, em seguida, toque a artéria com cuidado para garantir que o fluxo de sangue é permanentemente interrompida. Repita o eletrocoagulação se um recanalização é observado.
17. Corrigir o músculo temporal com 1 ou 2 pontos na parte de inserção do músculo para cobrir o defeito ósseo, se possível.
18. Suturar a ferida e colocar o animal na caixa de recuperação do aquecida. Em geral, os animais recuperação rapidamente após anest volátilhesia.
19. Para a substituição de volume, aplicam-se por via subcutânea 0,5 ml de solução salina estéril, tal como descrito no passo 1.16.
20. Após a cirurgia, que os animais possam ficar na gaiola de recuperação aquecida por 90 min. Espere até que os animais são conscientes antes de deixá-los sozinhos. Apenas devolvê-los para uma gaiola com outros animais quando eles são totalmente recuperado.
21. Repetir a substituição de volume, tal como explicado no passo 1.16, depois 12 h.
22. Aplicar analgesia pós-operatória através da água de beber (por exemplo, paracetamol (10 mg / ml) ou outros fármacos anti-inflamatórios não esteróides).
23. Verifique a condição médica dos animais todos os dias após a cirurgia. Fornecer alimentos de origem animal purê em uma placa de petri no chão para simplificar a comer e para minimizar a perda de peso pós-operatória.

3. Sham Tratamento

1. Efectuar todos os procedimentos de forma idêntica às etapas 1 e 2, descritos acima, incluindo CW preparação, exceto não coagular o ar cerebral média expostatery.

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Resultados

A linha do tempo e os resultados representativos são mostrados nas Figuras 2 e 3. A preparação janela do crânio, com uma pequena janela lateral do crânio para o seio sagital superior (Figura 2 B, C, D) resulta em uma taxa de mortalidade e morbidade muito baixa quando realizada por um cirurgião experiente. Todos os 10 animais sobreviveram, e todos CW crónica pode ser usado para geração de imagens de alta qualidade, mesmo 28 dias ...

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Discussão

AVC é uma das principais causas de incapacidade a longo prazo e de morte em todo o mundo ^1. Além do tratamento agudo, investigando novas abordagens e mecanismos para acelerar e melhorar a recuperação após acidente vascular cerebral continua a ser um objectivo primordial médica ^7. pesquisadores tempos experimentais frequentemente empregam modelos de roedores de isquémia cerebral focal. De facto, os modelos indutores transiente ou permanente MCAo imitar um dos tipos mais comuns de isquemia cer...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	Kopf	Model 930
Anaethesia system for isoflurane	Draeger
Isoflurane	Abott
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Bipolar Forceps	Erbe	20195-501
Bipolar Forceps	Erbe                              20195-022
Microdrill	FST                              18000-17
Needle holder	FST	12010-14
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200