JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Хирургическая окклюзия дистальной ветви средней мозговой артерии (МСАО), часто используется модель в экспериментальных исследованиях инсульта. Эта рукопись описывает основную технику постоянного MCAO, в сочетании с введением боковой черепной окно, которое дает возможность для продольной прижизненной микроскопии у мышей.

Аннотация

Очаговая мозговая ишемия (то есть, ишемический инсульт) , может привести к значительному травмы головного мозга, что приводит к серьезной потере функции нейронов и , следовательно , к хосту двигательных и когнитивных нарушений. Его высокая распространенность представляет серьезную опасность для здоровья, поскольку инсульт является одной из основных причин длительной нетрудоспособности и смерти во всем мире 1. Восстановление функции нейронов, в большинстве случаев, лишь частично. До сих пор, варианты лечения весьма ограничены, в частности , из - за узкого временного окна для тромболизиса 2,3. Определение методов для ускорения восстановления после инсульта остается главным медицинской целью; Тем не менее, это было затруднено из-за недостаточного механистической проникновением в процесс восстановления. Экспериментальные исследователи инсульта часто используют грызуна модели фокальной ишемии головного мозга. Помимо острой фазы, исследования инсульта все больше ориентируется на подострой и хронической фазы при ишемии головного мозга. Большинство исследователей инсульта применяют постоянный или транокклюзия масштабного коэффициента ЗВК у мышей или крыс. У пациентов, окклюзий MCA являются одними из наиболее частых причин ишемического инсульта 4. Кроме проксимального окклюзии MCA с использованием модели нити, хирургическая окклюзия дистальной MCA, вероятно, наиболее часто используемая модель в исследовании экспериментальной инсульта 5. Окклюзия дистальной (к ветвлением lenticulo-стриарных артерий) MCA ветви, как правило, запасные части стриатуме и в первую очередь влияет на неокортекс. Судно прикуса может быть постоянным или временным. Высокая воспроизводимость объема поражения и очень низким уровнем смертности по отношению к долгосрочному результату являются основными преимуществами этой модели. Здесь мы покажем, как выполнить хронический черепных окно (CW) подготовка латерального сагиттальной пазухи, а потом, как хирургическим путем вызвать дистальную инсульта под окном, используя краниотомии подход. Этот подход может быть применен для последовательной визуализации острых и хронических изменений, возникающих после ишемии черезэпи-освещения, конфокальной лазерной сканирующей и двухфотонную прижизненной микроскопии.

Введение

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal7.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)11.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner12. Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows13. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia14. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Эксперименты по предметам животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Landesamt FUER Gesundheit унд Soziales, Берлин, Германия (G0298 / 13) и ARRIVE критериев, в зависимости от обстоятельств. Для этого исследования, от 10 до 12-недельных самцов мышей C57BL / 6J были использованы.

1. Боковой Хронический Черепно Окно Подготовка

  1. Выполнение анестезии с подкожной инъекцией кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Тест для адекватного седации с болью раздражитель.
  2. Стерилизовать хирургических инструментов и операционного поля с 70% -ным этанолом.
  3. Удалите волосы головы от шеи до глаз, используя грызуна бритву.
  4. Зафиксируйте голову в стереотаксической раме.
  5. Используйте декспантенол глазную мазь на оба глаза, чтобы избежать обезвоживания.
  6. Очистите хирургическую область, чтобы удалить все волосы и стерилизовать его с 3-мя слоями 74,1% этанола и 10% 2-пропранолол.
  7. Выполнение средней линиинадрез от шеи до глаз скальпелем.
  8. Span лоскут кожи с 4 места для палаток швами.
  9. Удалите надкостницы тщательно на левом полушарии, очищая его с скальпелем до точки, где начинается височной мышцы.
    Примечание: Этот препарат также служит для создания хорошей адгезии к площади зубной клей, который фиксирует крышку стекла.
  10. Выполните лобно-теменной трепанацию черепа с диаметром 4 мм, за счет уменьшения толщины черепа на краю костного лоскута с использованием microdrill. Применение солевого раствора в процессе бурения, чтобы избежать травм тепла.
  11. Приподнимите костный лоскут с канюлей и удалить его с помощью microforceps.
  12. тщательно и интенсивно Промывать с физиологическим раствором.
  13. Смешайте зубной клей , пока он не имеет надлежащей последовательности и не является жидкостью (то есть, клей не должен производить темы больше). Поместите его на кости вокруг краниотомии.
  14. Поместите крышку стекла диаметром 6 мм на подготовленном клеем и закрепите его с помощью йе остальная часть зубной клей. Убедитесь, что она водонепроницаема. Подождите, пока клей не сушат и трудно проверив ее при помощи щипцов.
    Примечание: дополнительное орошение ускоряет процесс отверждения.
  15. Снять швы и места для палаток закрыть рану швами кожи.
  16. Подтяните кожу фланг мыши. Вставьте иглу подкожно и осторожно заменить 0,5 мл стерильного физиологического раствора подкожно для баланса жидкости.
  17. После операции, держать животных в клетке восстановления нагревают в течение 90 мин. Подождите, пока животные не полностью пробуждены, прежде чем покинуть их без присмотра. Подождите, пока животные не будут полностью восстановлены перед их возвращением в клетку с другими животными.
  18. Повторите подкожную подстановку объем физиологического раствора после того, как приблизительно 12 ч, как описано в пункте 1.16.
  19. Всегда применять обезболивание через желудочный зонд или непосредственно в полости рта после операции (например, парацетамол (10 мг / мл) или другие нестероидные противовоспалительные препараты).
  20. Проверить состояние животных каждый день после операции, и всегда обеспечивают пюре животную пищу на полу в чашку Петри, чтобы сделать пищу простым и избежать критической потери веса после операции.
    Примечание: Прижизненные микроскопия может быть выполнена в первый день после черепной подготовки окна.
  21. Применение изофлуран анестезии и зафиксировать животное в держателе головки. Откройте шовный материал кожи и очистить окно с ватными палочками и стерильным физиологическим раствором. Через 24 часа черепной окно должно быть заполнено спинномозговой жидкостью к тому времени точки, что позволяет визуализацию. Выполните визуализацию с использованием существующих протоколов микроскопии 18.

2. Дистальный MCAO

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура MCAO должна проводиться около 5 дней, после получения CW. Это сводит к минимуму помехи от иммунной реакции, вызванной препаратом CW с иммунной реакции, вызванной инсультом.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Обзор дистального МСАО. A. Это хороший обзор о судах до оп. B. Сосуды после первого биполярного контакта. С. Сосуды после второго биполярного контакта. D. Обзор о судах, которые полностью закрыты в настоящее время. E. Окончательный обзор с меньшим увеличением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Анестезировать мышей с использованием маски анестезии и соответствующего обезболивающий режима в консультации с ветеринарным персоналом (например, индукция с 1,5 - 2% изофлуран и технического обслуживания с 1,0 - 1,5% изофлуран в 2/3 N 2 O и 1/3 O 2 через испарителем).
  2. Бритье и удалить волосы и дезинфицировать кожу и окружающие мех с соответствующим агентом (например, 70% этиловый спирт), и высушить его после этого.
  3. Поддерживать температуру тела мышей при 36,5 ° C ± 0,5 ° C во время операции. Обратной связи контролируется грелку, нагревают в соответствии с ректальной температуры мыши, настоятельно рекомендуется.
  4. Место животное в боковом положении. Закрепите нос в маске анестезии и регулировать изофлуран концентрации до 1,0 - 1,5%.
  5. Применяют влажную мазь (декспантенол) для обоих глаз.
  6. Используйте разрез кожи, сделанный для подготовки CW.
  7. Аккуратно отделить кожу и определить височной мышцы под ним.
  8. Отрегулируйте энергию высокочастотного генератора (5 - 7 Вт) и использовать биполярный режим.
  9. С помощью электрокоагуляции щипцами и осторожно удалите височную мышцу от черепа, создавая мышечный лоскут, не полностью удаления мышц.
  10. Определить MCA ниже прозрачного черепа в ростральной части височной области, спинные к ретро-Орбитал пазухи. Если раздвоение MCA не могут быть идентифицированы, пытаются идентифицировать судно наиболее ростральной.
  11. Тонкий череп выше ветви MCA с microdrill при непрерывном оросительной во избежание повреждения тепла.
  12. Поднимите кость с канюлей и удалить его с microforceps.
  13. Уменьшение энергии высокочастотного генератора до 3 - 5 Вт
  14. Подойдите к артерии сверху и нежно прикоснуться к ней с биполярных щипцов с обеих сторон без подъема судна.
  15. Коагулируйте артерию проксимально и дистально к развилке сосуда.
  16. Подождите 30 секунд, а затем нажмите артерию осторожно, чтобы гарантировать, что поток крови постоянно прерывается. Повторите электрокоагуляцию, если наблюдается реканализации.
  17. Закрепить височной мышцы с 1 или 2 стежков при вставке мышцы, чтобы покрыть дефект кости, если это возможно.
  18. Шовный рану и поместить животное в коробку восстановления с подогревом. В целом, восстановление животных быстро после летучего ANESThesia.
  19. Для замещения объема, наносят 0,5 мл стерильного физиологического раствора, подкожно, как описано в пункте 1.16.
  20. После операции, позволяет животным оставаться в клетке восстановления нагревают в течение 90 мин. Подождите, пока животные не сознают, прежде чем покинуть их без присмотра. Только вернуть их в клетку с другими животными, когда они полностью выздоровели.
  21. Повторите замену громкости, как описано в пункте 1.16, после 12 ч.
  22. Применяют послеоперационное обезболивание через питьевую воду (например, парацетамол (10 мг / мл) или другие нестероидные противовоспалительные препараты).
  23. Проверьте состояние здоровья животных каждый день после операции. Обеспечить растертый животной пищи в чашку Петри на полу, чтобы упростить питание и свести к минимуму потери веса в послеоперационном периоде.

3. Лечение Sham

  1. Выполните все процедуры идентично шаги 1 и 2, описанных выше, в том числе CW препарат, за исключением того, не слипаются обнаженную средней мозговой арTery.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Сроки и репрезентативные результаты показаны на рисунках 2 и 3. Черепных препарат окно, с небольшим черепной окна сбоку от верхнего сагиттального синуса приводит к очень низкой смертности и заболеваемости скорости , когда выполняется опытным хирург?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Инсульт является одной из основных причин длительной нетрудоспособности и смерти во всем мире 1. Помимо острого лечения, исследования новых подходов и механизмов для ускорения и повышения восстановления после инсульта остается главным медицинская цель 7. Экспериментальны...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

VP is a participant in the Charité Clinical Scientist Program, funded by the Charité - Universitätsmedizin Berlin and the Berlin Institute of Health. TB is an SNSF PostDoc Mobility fellow. The authors receive grant support from EinsteinStiftung/A-2012-153 to PV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Binocular surgical microscopeZeissStemi 2000 C
Light source for microscopeZeissCL 6000 LED
Heating pad with rectal probeFST21061-10
Stereotactic frameKopfModel 930
Anaethesia system for isofluraneDraeger
IsofluraneAbott
Dumont forceps #5FST11251-10
Dumont forceps #7FST11271-30
Bipolar ForcepsErbe20195-501
Bipolar Forceps Erbe                              20195-022
MicrodrillFST                              18000-17         
Needle holderFST12010-14
5-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
7-0 silk sutureFeuerstein,Suprama
8-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
Veterinary Recovery ChamberPeco ServicesV1200

Ссылки

  1. Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
  2. Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
  3. Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
  4. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  5. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  7. Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
  8. Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
  9. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  10. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
  11. Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
  12. Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
  13. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
  14. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
  16. Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
  17. Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
  19. Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
  20. Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
  21. Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  22. Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
  23. Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
  24. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
  25. Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  26. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  27. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
  28. Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  29. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  30. Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
  31. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience118MCAO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены