横慢性頭蓋窓の準備を有効<em&gt;インビボ</em&gt;マウスの遠位中大脳動脈閉塞後に観測

要約

遠位中大脳動脈の分岐（MCAO）の外科的閉塞は実験的ストローク研究で頻繁に使用されるモデルです。この原稿は、マウスの縦生体顕微鏡検査のための機会を提供しています横頭蓋窓の挿入と組み合わせて永久にMCAoの基本的な手法について説明します。

要約

局所脳虚血（ すなわち、虚血性脳卒中）は、神経機能の深刻な損失に、その結果、運動および認知障害のホストにつながる、主要な脳損傷を引き起こす可能性があります。ストロークが¹世界中の長期障害と死の主な原因の一つであるとして、その高い有病率は、深刻な健康負担をもたらします。神経機能の回復は、ほとんどの場合、唯一の部分です。これまでに、治療オプションが原因で血栓溶解^2,3ための狭い時間ウィンドウに、特に、非常に制限されます。脳卒中からの回復を加速するための方法を決定することは、プライム医療目標です。しかしながら、これは、回復プロセス中に不十分な機構的洞察により妨げられてきました。実験ストローク研究者が頻繁に局所脳虚血の齧歯類モデルを採用しています。急性期を越えて、脳卒中の研究は、脳虚血次亜急性および慢性期にますます集中しています。ほとんどのストロークの研究者は、永続的またはトラン適用しますマウスまたはラットにおけるMCAのトランジェント閉塞。患者では、MCAの閉塞は、虚血性脳卒中⁴の最も頻繁な原因の一つです。フィラメントモデルを用いて、MCAの近位閉塞のほか、遠位MCAの外科的閉塞は実験的ストローク研究⁵の中で最も頻繁に使用されるモデルは、おそらくです。 MCAブランチ（lenticulo-線条動脈の分岐まで）遠位の閉塞は、通常、線条体を惜しみ、主に新皮質に影響を与えます。血管閉塞は、永久的または一時的であることができます。長期転帰に対する病変体積と非常に低い死亡率の高い再現性は、このモデルの主な利点です。ここでは、矢状静脈洞に慢性頭蓋窓（CW）準備横を実行するために、その後どのように開頭術アプローチを使用して、ウィンドウの下に遠位脳卒中を引き起こす外科的方法を示しています。このアプローチは、ビアの虚血後の急性および慢性の変化の連続画像形成のために適用することができます落射照明、共焦点レーザー走査、及び二光子生体顕微鏡。

概要

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide¹, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact^6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal⁷.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia^9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)¹¹.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner¹². Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows¹³. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia¹⁴. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance^15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

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プロトコル

倫理の声明：動物を対象とした実験は、該当する場合、Landesamt fuerお大事にウントSoziales、ベルリン、ドイツ（G0298 / 13）とARRIVE基準によって定められたガイドラインおよび規則に従って行いました。 12週齢の雄のC57BL / 6Jマウスに本研究では、10-に使用しました。

1.横慢性頭蓋窓の準備

1. 皮下ケタミンの注射（90 mgの/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）で麻酔を行います。痛みの刺激との適切な鎮静のためのテスト。
2. 70％エタノールで手術器具および手術野を滅菌します。
3. げっ歯類のシェーバーを使用して、目に首から頭皮の毛を削除します。
4. 定位フレームにヘッドを固定してください。
5. 脱水症状を避けるために、両眼にデクスパンテノール眼軟膏を使用してください。
6. すべての毛を除去し、74.1パーセントのエタノールと10％2-プロプラノロールの3層で、それを滅菌する手術領域を清掃してください。
7. 正中線を実行しますメスを用いて目に首から切開。
8. 4テンティング縫合糸で皮膚フラップにまたがります。
9. 頭筋が始まる点にメスでそ​​れを掻き落とし左半球に慎重に骨膜を削除します。
   注：この製剤はまた、カバーガラスを固定する歯科接着剤、のための良好な接着領域を作成するのに役立ちます。
10. マイクロドリルを用いて骨フラップの縁に頭蓋骨を薄くすることにより、直径4mmの前頭頭頂開頭術を実行します。熱損傷を回避するために掘削しながら、生理食塩水を適用します。
11. カニューレと骨弁を高め、マイクロピンセットを使ってそれを削除します。
12. 食塩水で慎重かつ広範囲に灌漑。
13. それは適切な一貫性を持っており、流体でなくなるまで、歯科用接着剤を混ぜる（ すなわち、接着剤はもはやスレッドを生成するべきではありません）。開頭術の周りの骨の上に置きます。
14. 準備された接着剤の6ミリメートル径のカバーガラスを置き、目でそれを修正歯科接着剤の電子レスト。それは防水であることを確認してください。接着剤は、ピンセットでそれをテストすることによって乾燥させ、ハードされるまで待ちます。
    注：追加の灌漑は、硬化プロセスを加速します。
15. テンティング縫合糸を外し、皮膚縫合糸で傷口を閉じます。
16. マウスの脇腹の皮膚を引き上げます。針を皮下に挿入し、ゆっくりと体液バランスのために滅菌生理食塩水を皮下の0.5ミリリットルを代入します。
17. 手術後、90分間加熱した回復ケージに動物を飼います。動物は無人それらを離れる前に、完全に目を覚ましているまで待ってください。動物は完全に他の動物とのケージに戻す前に回収されるまで待ちます。
18. ステップ1.16で説明したように、約12時間後に皮下生理食塩水の体積置換を繰り返します。
19. 常に手術（ 例えば、パラセタモール（10 mg / mlで）、または他の非ステロイド性抗炎症薬）の後に口腔内に強制飼養を介して、または直接に鎮痛を適用します。
20. チェック常に動物の状態、手術後、毎日、とは単純な食べ作ることと、手術後の重要な重量損失を回避するために、ペトリ皿の中で床の上につぶした動物性食品を提供します。
    注：生体顕微鏡は、頭蓋窓の準備の後の最初の日に行うことができます。
21. イソフルラン麻酔を適用し、ヘッドホルダに動物を固定します。皮膚の縫合糸を開き、綿棒と、滅菌生理食塩水でウィンドウをきれいにします。 24時間後、頭蓋窓は、イメージングを可能にする、その時点によって脳脊髄液で満たされるべきです。確立された顕微鏡プロトコル^18を使用して撮影を行います。

2.遠位にMCAo

注：のMCAO手順はCW調製後約5 Dを実行する必要があります。これは、脳卒中により誘導される免疫反応のCW製剤によって引き起こされる免疫反応からの干渉を最小限に抑えることができます。

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遠位にMCAoの1.概要図。 A.これは、オペアンプの前に船のいいの概要です。第1のバイポーラ接触後B.船。第2のバイポーラ接触後のC.は船。 D.完全に締め切られている船舶、についての概要。低倍率でのE.ファイナル概要。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1. 2/3 N ₂ Oと1/3 O _2を 介して 1.5％イソフルラン- 1.0と2％イソフルランおよびメンテナンス-獣医のスタッフ（ 例えば、1.5での誘導と協議の上、麻酔マスクと適切な麻酔薬体制を使用してマウスをAnaesthetize気化器）。
2. （剃ると毛を除去し、適切な薬剤と皮膚や周囲の毛を消毒例えば、70％のエチルアルコール）、その後、それを乾燥させます。
3. 36.5℃でのマウスの体温を維持するためには、手術中に0.5℃、±しました。マウスの直腸温度に応じて加熱されたフィードバック制御加熱パッドは、強くお勧めします。
4. 横位置で動物を置きます。麻酔マスクで鼻を修正し、1.0にイソフルラン濃度を調整 - 1.5％。
5. 両眼に濡れた軟膏（デクスパンテノール）を適用します。
6. CWの準備のために作られた皮膚切開を使用してください。
7. 優しく肌を分離し、その下側頭筋を識別します。
8. 高周波発生器のエネルギー調整（5から7 W）をバイポーラモードを使用します。
9. 電気凝固鉗子を使用して、慎重に完全に筋肉を除去することなく、筋肉のフラップを作成し、頭蓋骨から頭筋を取り除きます。
10. レトロ眼窩に背、時間領域の吻側部分に透明頭蓋骨の下にMCAを特定リットル洞。 MCA分岐部が識別できない場合、容器最も吻側を特定しようとします。
11. 継続的に熱損傷を避けるために灌漑しながら、マイクロドリルでMCA枝上記薄い頭蓋骨。
12. カニューレと骨を持ち上げて、マイクロピンセットでそれを削除します。
13. 5 W. - 3に高周波発電機のエネルギーを減少させます
14. 上から動脈に近づき、そっと容器を持ち上げることなく、両側のバイポーラ鉗子でそれに触れます。
15. 血管分岐部に近位および遠位動脈を凝固。
16. 30秒間待ってから、血流が恒久的に中断されることを保証するために、静かに動脈をタッチします。再疎通が観察されている場合は電気凝固を繰り返します。
17. 可能な場合、骨欠損をカバーするために、筋肉の挿入で1または2のステッチと頭筋を修正しました。
18. 傷口を縫合し、加熱された回収ボックスに動物を配置します。すぐに揮発性ANEST後に一般的には、動物の回復hesia。
19. ステップ1.16で説明したように、ボリュームの置換については、滅菌生理食塩水の皮下に0.5mlのを適用します。
20. 手術後、動物は90分間加熱回復ケージに滞在することができます。動物は無人それらを離れる前に意識しているまで待ってください。それらが完全に回復している場合にのみ、他の動物とのケージに戻します。
21. 12時間後に、ステップ1.16で説明したように、ボリュームの置換を繰り返します。
22. 飲料水（ 例えば、パラセタモール（10 mg / mlで）、または他の非ステロイド性抗炎症薬） を介して、術後鎮痛を適用します。
23. 手術後、毎日の動物の病状を確認してください。食を簡素化し、術後の体重減少を最小限に抑えるために床の上にペトリ皿にマッシュポテト動物性食品を提供します。

3.シャム治療

1. 上記の-含むCW準備-除く露出した中大脳ARを凝固しない説明したステップ1及び2に同一のすべての手順を実行しますテリ。

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結果

タイムライン及び代表的な結果を図2および図3に示されています。上矢状静脈洞（ 図2 B、C、D）経験豊富な外科医によって行われる非常に低い死亡率および罹患率率の結果に小さな頭蓋窓の横で頭蓋窓の準備、。 10匹の動物の全てが生存し、そしてすべての慢性CWも28日目、手術後、高品質の画像化に使用することができます。創?...

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ディスカッション

ストロークが¹世界中の長期障害と死の主な原因の一つです。急性期治療を超えて、脳卒中後の回復を促進し、強化するための新しいアプローチやメカニズムを調査すると、プライム医療目標⁷のまま。実験ストローク研究者が頻繁に局所脳虚血の齧歯類モデルを採用しています。実際には、一時的または恒久的にMCAoを誘導するモデルは、患者⁴における局所脳虚血の最...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	Kopf	Model 930
Anaethesia system for isoflurane	Draeger
Isoflurane	Abott
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Bipolar Forceps	Erbe	20195-501
Bipolar Forceps	Erbe                              20195-022
Microdrill	FST                              18000-17
Needle holder	FST	12010-14
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200