Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva<em&gt; In Vivo</em&gt; Condizioni seguito distale Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale nei topi

Riepilogo

l'occlusione chirurgica di un ramo distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello di uso frequente nella ricerca ictus sperimentale. Questo manoscritto descrive la tecnica base di MCAO permanente, combinata con l'inserimento di una finestra cranica laterale, che offre la possibilità di longitudinale microscopia intravitale nei topi.

Abstract

Ischemia cerebrale focale (cioè, ictus ischemico) può causare gravi lesioni cerebrali, portando ad una grave perdita della funzione neuronale e di conseguenza ad una serie di motore e disabilità cognitive. La sua alta prevalenza pone un grave onere di salute, come l'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo ^1. Recupero della funzione neuronale è, nella maggior parte dei casi, solo parziale. Finora, le opzioni di trattamento sono molto limitate, in particolare a causa della finestra temporale ristretta per la trombolisi ^2,3. Che determina i metodi per accelerare il recupero da ictus rimane un obiettivo medico prime; tuttavia, questo è stato ostacolato dalla insufficienti intuizioni meccanicistici nel processo di recupero. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Al di là della fase acuta, la ricerca corsa è sempre più focalizzata sulla fase sub-acuta e cronica dopo ischemia cerebrale. applicare la maggior parte dei ricercatori ictus permanente o tranl'occlusione sient del MCA nei topi o ratti. Nei pazienti, occlusioni di MCA sono tra le più frequenti cause di ictus ischemico ^4. Oltre l'occlusione prossimale del MCA utilizzando il modello filamento, l'occlusione chirurgica del distale MCA è probabilmente il modello più utilizzato nella ricerca ictus sperimentale ^5. L'occlusione di un distale (la ramificazione delle arterie lenticulo-striate) ramo MCA risparmia tipicamente striato e colpisce soprattutto la neocorteccia. Vessel l'occlusione può essere permanente o transitorio. Alta ripetibilità volume lesione e mortalità molto bassi rispetto al risultato a lungo termine sono i principali vantaggi di questo modello. Qui, dimostriamo come eseguire una cronica finestra del cranio (CW) la preparazione lateralmente al seno sagittale, e poi come chirurgicamente indurre un ictus distale sotto la finestra utilizzando un approccio craniotomia. Questo approccio può essere applicato per l'imaging sequenziale di alterazioni acute e croniche seguente ischemia viaepi-illuminante, confocale a scansione laser, e due fotoni microscopia intravitale.

Introduzione

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide¹, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact^6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal⁷.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia^9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)¹¹.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner¹². Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows¹³. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia¹⁴. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance^15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

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Protocollo

ETICA DICHIARAZIONE: Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania (G0298 / 13) ei criteri arrivano, a seconda dei casi. Per questo studio, 10 a 12 settimane di età maschi C57Bl / 6J sono stati utilizzati.

1. laterale cronica cranica finestra Preparazione

1. Eseguire anestesia con una iniezione sottocutanea di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Test per la sedazione adeguata con uno stimolo dolore.
2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici e campo chirurgico con il 70% di etanolo.
3. Rimuovere il cuoio capelluto dal collo agli occhi con un rasoio roditore.
4. Fissare la testa in un frame stereotassico.
5. Utilizzare Dexpantenolo pomata occhio su entrambi gli occhi per evitare la disidratazione.
6. Pulire l'area chirurgica per rimuovere tutti i peli e sterilizzare con 3 strati di 74,1% di etanolo e 10% 2-propanololo.
7. Eseguire un linea medianaincisione dal collo agli occhi utilizzando un bisturi.
8. Coprono l'lembo cutaneo con 4 punti di sutura in tenda.
9. Rimuovere il periostio attentamente l'emisfero sinistro raschiando via con un bisturi al punto in cui inizia il muscolo temporale.
   NOTA: Questa preparazione serve anche per creare una buona zona adesione per la colla dentale, che fissa il vetro di copertura.
10. Eseguire una craniotomia fronto-parietale con un diametro di 4 mm da diradamento cranio sul bordo del lembo osseo utilizzando un microtrapano. Applicare la soluzione salina durante la perforazione per evitare lesioni di calore.
11. Elevare il lembo osseo con cannule e rimuoverlo con microforceps.
12. Irrigare accuratamente e ampiamente con soluzione fisiologica.
13. Mescolare la colla dentale fino ha la consistenza adeguata e non è fluido (cioè, la colla deve produrre fili più). Posizionarlo sul tessuto osseo intorno alla craniotomia.
14. Posizionare un vetro di copertura con un diametro di 6 mm sulla colla preparata e fissarlo con the resto della colla dentale. Assicurarsi che sia a tenuta stagna. Attendere che la colla viene essiccato e duro provandola con una pinza.
    NOTA: L'irrigazione ulteriore accelera il processo di polimerizzazione.
15. Rimuovere i punti di sutura in tenda e chiudere la ferita con punti di sutura della pelle.
16. Tirare la pelle del fianco del mouse. Inserire una via sottocutanea ago e sostituire delicatamente 0,5 ml di sterile per via sottocutanea salina per l'equilibrio dei fluidi.
17. Dopo l'intervento chirurgico, tenere gli animali in gabbia recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono completamente sveglio prima di lasciare incustoditi. Attendere fino a quando gli animali sono completamente recuperati prima di tornare in una gabbia con altri animali.
18. Ripetere la sostituzione del volume di soluzione salina per via sottocutanea dopo circa 12 ore, come descritto al punto 1.16.
19. Sempre applicare analgesia mediante sonda gastrica o direttamente nella cavità orale dopo l'intervento (ad esempio, paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
20. Controlla il condizioni degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico, e sempre forniscono schiacciate cibo animale sul pavimento in una piastra di Petri per fare mangiare semplice e per evitare la perdita di peso dopo l'intervento critico.
    NOTA: microscopia intravitale può essere effettuata sul primo giorno dopo la preparazione finestra del cranio.
21. Applicare isoflurano anestesia e fissare l'animale in un supporto testa. Aprire la sutura della pelle e pulire la finestra con bastoncini di cotone e soluzione salina sterile. Dopo 24 ore, la finestra del cranio deve essere riempito con liquido cerebrospinale da quel punto di tempo, che permette l'imaging. Eseguire l'imaging utilizzando protocolli di microscopia stabiliti ^18.

2. distale MCAO

NOTA: La procedura MCAO deve essere eseguita su 5 d dopo la preparazione CW. Ciò minimizza l'interferenza dalla reazione immunitaria causata dalla preparazione CW con la reazione immunitaria ictus indotta.

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Figura 1. Panoramica distale MCAO. R. Questa è una bella panoramica sui vasi prima della op. B. I vasi dopo il primo contatto bipolare. C. I vasi dopo secondo contatto bipolare. D. La panoramica sui vasi, che sono completamente chiuse oggi. E. panoramica finale con ingrandimento minore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Anestetizzare il topo, utilizzando una maschera di anestesia e un regime anestetico adeguato, in consultazione con il personale veterinario (ad esempio, induzione con 1,5-2% isoflurano e manutenzione con 1,0-1,5% isoflurano in 2/3 N ₂ O e 1/3 O ₂ via un vaporizzatore).
2. Shave e rimuovere i capelli e disinfettare la pelle e pelliccia circostante con un agente appropriato (ad esempio, il 70% di alcol etilico), e asciugare dopo.
3. Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante l'intervento chirurgico. Una piastra elettrica risposte controllato, riscaldato secondo la temperatura rettale del mouse, è altamente raccomandato.
4. Posto l'animale in posizione laterale. Fissare il naso nella maschera anestesia e regolare la concentrazione isoflurano a 1,0 - 1,5%.
5. Applicare una pomata bagnato (Dexpantenolo) per entrambi gli occhi.
6. Utilizzare l'incisione cutanea fatta per la preparazione CW.
7. Delicatamente separare la pelle e identificare il muscolo temporale sottostante.
8. Regolare l'energia del generatore ad alta frequenza (5 - 7 W) e usare la modalità bipolare.
9. Utilizzare le pinze elettrocoagulazione e rimuovere con attenzione il muscolo temporale dal cranio, la creazione di un lembo di muscolo, senza rimuovere completamente il muscolo.
10. Identificare la MCA sotto il cranio trasparente nella parte rostrale della zona temporale, dorsale per la retro-orbital seno. Se la biforcazione MCA non può essere identificato, cercare di identificare la nave più rostrale.
11. Sottile il teschio sopra il ramo MCA con un microtrapano mentre continua irrigazione per evitare danni dovuti al calore.
12. Sollevare l'osso con cannule e rimuoverlo con microforceps.
13. Diminuire l'energia del generatore ad alta frequenza 3 - 5 W.
14. Avvicinatevi l'arteria dall'alto e toccare delicatamente con le pinze bipolari su entrambi i lati senza sollevare la nave.
15. Coagulare dell'arteria prossimale e distale alla biforcazione nave.
16. Attendere 30 sec, quindi toccare delicatamente l'arteria per garantire che il flusso di sangue è permanentemente interrotta. Ripetere l'elettrocoagulazione, se si osserva una ricanalizzazione.
17. Fissare il muscolo temporale di 1 o 2 punti all'inserzione muscolare per coprire il difetto osseo, se possibile.
18. Suturare la ferita e posizionare l'animale nella casella di recupero riscaldato. In generale, il recupero animali subito dopo Anest volatilihesia.
19. Per la sostituzione del volume, applicano 0,5 ml di soluzione sterile salina per via sottocutanea, come descritto al punto 1.16.
20. Dopo l'intervento chirurgico, consentono agli animali di rimanere nella gabbia di recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono coscienti prima di lasciare incustoditi. restituirli solo a una gabbia con altri animali quando sono completamente recuperati.
21. Ripetere la sostituzione del volume, come spiegato al punto 1.16, dopo 12 ore.
22. Applicare l'analgesia postoperatoria con acqua potabile (ad esempio, il paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
23. Controllare la condizione medica degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico. Fornire cibo animale schiacciato in una piastra di Petri sul pavimento per semplificare mangiare e per ridurre al minimo la perdita di peso post-operatorio.

3. Trattamento Sham

1. Eseguire tutte le procedure in modo identico ai punti 1 e 2, sopra descritti, tra cui la preparazione CW, tranne non coagulare il ar cerebrale media espostobatteria.

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Risultati

La linea temporale e risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure 2 e 3. La preparazione finestra del cranio, con una piccola finestra laterale cranica al seno longitudinale superiore (Figura 2 B, C, D) comporta un basso tasso di mortalità e morbilità quando eseguita da un chirurgo esperto. Tutti i 10 animali sopravvissuti, e tutto CW cronico potrebbe essere utilizzato per l'imaging di alta qualità, anche 28 giorni dopo l&...

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Discussione

L'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo ^1. Al di là di trattamento acuto, indagare nuovi approcci e meccanismi per accelerare e migliorare il recupero dopo l'ictus rimane un obiettivo medica primaria ^7. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Infatti, modelli inducono transitoria o permanente MCAO imitano uno dei tipi più comuni di ischemia cerebrale focale in pazienti ^4. Oltr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	CL 6000 LED
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	Kopf	Model 930
Anaethesia system for isoflurane	Draeger
Isoflurane	Abott
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Bipolar Forceps	Erbe	20195-501
Bipolar Forceps	Erbe                              20195-022
Microdrill	FST                              18000-17
Needle holder	FST	12010-14
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
Veterinary Recovery Chamber	Peco Services	V1200