JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

distal orta serebral arter dalı (MCAO) Cerrahi tıkanması, deneysel inme araştırmalarında sıkça kullanılan bir modeldir. Bu el yazması farelerde boyuna intravital mikroskopi için bir fırsat sunuyor yanal kafatası pencere takılması, birlikte kalıcı MCAO temel tekniğini açıklar.

Özet

Fokal serebral iskemi (yani, iskemik inme) nöronal fonksiyon ciddi bir kaybı ve dolayısıyla motor ve zihinsel engelli bir dizi yol açan başlıca beyin yaralanmaya neden olabilir. Inme 1 dünya çapında uzun süreli sakatlık ve ölüm başlıca nedenleri arasında olduğu gibi yüksek prevalans, ciddi bir sağlık yükünü oluşturmaktadır. nöronal fonksiyonu geri kazanımı, çoğu durumda, sadece kısmi vardır. Şimdiye kadar, tedavi seçenekleri oldukça nedeniyle trombolitik 2,3 dar zaman penceresi, özellikle de sınırlıdır. inme kurtarma hızlandırmak için yöntemlerin belirlenmesi birinci sınıf bir tıbbi hedef olmaya devam; Ancak, bu toparlanma sürecine yetersiz mekanistik anlayışlar tarafından engellenmiştir. Deneysel inme araştırmacılar sıklıkla fokal serebral iskemi kemirgen modelleri kullanır. Akut fazda ötesinde, inme araştırma giderek serebral iskemi aşağıdaki-sub akut ve kronik fazda odaklanmıştır. Çoğu inme araştırmacılar uygulamak kalıcı veya tranfarelerde ya da sıçanlarda MCA'nın SIENT oklüzyonu. Hastalarda, MCA tıkanıklıklar iskemik inme 4 en sık nedenleri arasındadır. Filament modelini kullanarak MCA proksimal oklüzyon yanı sıra, uzak MCA cerrahi tıkanması, deneysel inme araştırma 5. en sık kullanılan model muhtemelen. MCA dalı (lenticulo-striat arterlerin dallanma kadar) distalinde Tıkanıklığı tipik striatum yedek ve öncelikle neokorteks etkiler. Gemi tıkanıklığı kalıcı veya geçici olabilir. uzun dönem sonuçları açısından lezyon hacmi ve çok düşük mortalite oranları yüksek tekrarlanabilirlik bu modelin başlıca avantajları vardır. Burada, sagital sinüs kronik kafa penceresi (CW) hazırlık yanal gerçekleştirmek için, ve daha sonra nasıl bir kraniotomi yaklaşımı kullanarak pencerenin altında bir uzak inme neden cerrahi olarak nasıl gösterilmektedir. Bu yaklaşım ile iskemi sonrası akut ve kronik değişikliklerin sıralı görüntüleme için uygulanabilirKonfokal lazer tarama ve iki foton intravital mikroskopi epi-aydınlatıcı.

Giriş

Stroke is among the principal causes of long-term disability and death worldwide1, coming second after coronary heart disease. In addition, stroke is the primary cause of long-term disability, underscoring its tremendous socioeconomic impact6-8. Beyond acute treatment, investigating new approaches and mechanisms to accelerate and enhance recovery after stroke remains a prime medical goal7.

In the last few decades, data from experimental stroke research has contributed substantially to understanding the complex pathophysiological cascades triggered by ischemia9,10. Excitotoxicity, apoptosis, peri-infarct depolarization, and inflammation have been identified as the most relevant mediators of cell death following focal cerebral ischemia. Moreover, using animal models of cerebral ischemia, important concepts, diagnostic modalities, and therapeutic approaches have been developed and validated (e.g., "penumbra" and thrombolysis)11.

The availability of experimental stroke models, combined with non-invasive imaging modalities (e.g., magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography, or laser speckle contrast analysis), enables the researcher to investigate hyperacute and chronic pathophysiological changes induced by the ischemic insult in a longitudinal manner12. Along with studying the spatiotemporal profile of the evolving lesion, changes resembling neuronal plasticity can be investigated and correlated to functional outcomes and histological findings. Within the last few years, further methodological advances have been made using the combination of cerebral ischemia models and in vivo microscopy via cranial windows13. These new techniques allow investigators to analyze the neurovascular unit at the cellular and molecular level, with great analytic power in the acute, subacute, and chronic phases following focal cerebral ischemia14. Moreover, in vivo microscopy imaging of microcirculatory dynamics has revealed novel aspects of cerebral microvasculature function and angioarchitecture, with significant pathophysiological relevance15-17.

In this protocol, we present how to perform a chronic CW preparation lateral to the sagittal sinus and how to surgically induce a distal stroke underneath the window. This mouse model can be applied to sequential imaging of acute, subacute, and chronic changes following focal cerebral ischemia via epi-illuminating, confocal laser scanning, and two-photon intravital microscopy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

ETİK TABLOSU: Hayvan denekleri deneyler geçerliyse, Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya (G0298 / 13) ve GELİYORUM kriterlerine göre belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. 12-haftalık erkek C57BL / 6J farelerine, bu çalışmada, 10 kullanılmıştır.

1. Yanal Kronik Kranial Pencere Hazırlık

  1. ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile anestezi gerçekleştirin. Bir ağrı uyaran yeterli sedasyon test edin.
  2. % 70 etanol ile cerrahi aletler ve cerrahi alan sterilize edin.
  3. Bir kemirgen tıraş makinesi kullanarak gözlere boyundan kafa derisi saç kaldırmak.
  4. stereotaktik çerçeve içinde başını düzelt.
  5. dehidratasyonu önlemek için her iki göze deskpantenol göz merhemi kullanın.
  6. tüm tüyleri ve% 74.1 etanol 3 kat ve% 10 2-propanolol ile sterilize etmek için cerrahi bölgeyi temizleyin.
  7. Bir orta hat gerçekleştirinBir neşter kullanılarak gözlere boyun kesi.
  8. 4 çadırlaşması dikişlerle flep span.
  9. Temporal kas başlar noktaya bir neşter ile kapalı kazıyarak sol hemisfer dikkatlice periosta çıkarın.
    NOT: Bu hazırlık da cam kapak giderir diş yapıştırıcı, iyi bir yapışma alanı oluşturmak için hizmet vermektedir.
  10. Bir mikrotur kullanarak kemik kapağının ağız kafatası inceltilerek 4 mm çapında bir fronto-parietal kranyotomi gerçekleştirin. Isı yaralanmasını önlemek için delerken tuzlu su çözeltisi uygulayın.
  11. kanüller ile kemik flep yükseltmek ve microforceps kullanarak çıkarın.
  12. tuzlu su çözeltisi ile dikkatlice ve yoğun yıkayınız.
  13. O kıvama sahip ve akışkan olmayana kadar diş tutkal karıştırın (yani, tutkal artık Konuları üretmek olmamalıdır). Kraniotomi etrafındaki kemik üzerine yerleştirin.
  14. Hazırlanan tutkal 6 mm çaplı bir cam kapak yerleştirin ve inci ile sabitleyinDiş tutkal e geri kalanı. o su geçirmez olduğundan emin olun. tutkal forseps ile test ederek sert kurutulur ve kadar bekleyin.
    NOT: Ek sulama kür sürecini hızlandırır.
  15. tenting sütür çıkarın ve cilt dikişlerle yarayı kapatmak.
  16. fare kanadını deri yukarı çekin. Bir iğne subkutan yerleştirin ve yavaşça sıvı dengesi için steril tuzlu subkutan 0.5 ml yerine.
  17. Ameliyat sonrasında, 90 dakika süre ile ısıtıldı geri kafeste hayvanları tutmak. hayvanlar gözetimsiz bırakarak önce tamamen uyanık kadar bekleyin. hayvanlar tamamen diğer hayvanlarla bir kafes onları dönmeden önce iyileşene kadar bekleyin.
  18. Adım 1.16 tarif edildiği gibi, yaklaşık 12 saat sonra deri altından tuz hacmi ikame tekrarlayın.
  19. Her ameliyat (örneğin, parasetamol (10 mg / ml) ya da diğer steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar) sonra ağız boşluğu içine sonda ile veya doğrudan analjezi uygulanır.
  20. kontrol Her gün ameliyat sonrası hayvanların durumu ve her zaman bir Petri-çanak, basit yemek yapmak ve ameliyat sonrası kritik kilo kaybını önlemek için katta hayvan yiyecek püre sağlarlar.
    NOT: intravital mikroskopi kafatası pencere hazırlandıktan sonra ilk günü yapılabilir.
  21. izofluran anestezi uygulayın ve bir kafa tutucu hayvan düzeltin. cilt sütür açın ve pamuk tomurcukları ve steril tuzlu su ile pencereyi temizleyin. 24 saat sonra, kafa penceresi görüntüleme sağlayan bir zaman noktası ile, beyin omurilik sıvısı ile doldurulmalıdır. Kurulan mikroskopi protokollerini 18 ile görüntüleme gerçekleştirin.

2. Distal MCAO

NOT: MCAO prosedürü CW hazırlandıktan sonra yaklaşık 5 d yapılmalıdır. Bu vuruş kaynaklı bağışıklık reaksiyonu ile CW hazırlanması nedeniyle bağışıklık reaksiyonu girişimi en aza indirir.

"Src =" / files / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
Distal MCAO 1. Genel Bakış Şekil. A. Bu op önce gemiler hakkında güzel bir bakış niteliğindedir. İlk iki kutuplu temas sonrasında B. gemiler. İkinci bipolar temas sonrasında C. gemiler. D. tamamen şimdi kapalı gemiler, ilgili genel bakış. Alt büyütme ile E. Final bakış. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Veteriner kadrosu (danışarak bir anestezi maskesi ve uygun bir anestezik rejimi kullanılarak fareler, uyuşturan, örneğin 1.5 ile indüksiyon - 2/3 N 2 O ve 1/3 O 2'de% 1.5 izofluran üzerinden -% 2 izofluran ve 1.0 ile bakım bir buharlaştırıcı).
  2. (Tıraş ve saç kaldırmak ve uygun bir madde ile deri ve çevredeki kürk dezenfekteörneğin,% 70 etil alkol), ve daha sonra da kurutulur.
  3. 36.5 ° C 'de farelerin vücut ısısını korumak ameliyat sırasında ± 0.5 ° C. fare rektal sıcaklığına göre ısıtılmış bir geribildirim kontrollü ısıtma yastığı, şiddetle tavsiye edilir.
  4. lateral pozisyonda hayvan yerleştirin. Anestezi maskesi burun düzeltmek ve 1.0 izofluran konsantrasyonu ayarlamak -% 1.5.
  5. Her iki Gözleri ıslak merhem (deskpantenol) uygulayın.
  6. CW hazırlanması için yapılan cilt kesisi kullanın.
  7. Cildi nazikçe ayırmak ve altında zamansal kas tespit.
  8. yüksek frekanslı jeneratör enerjisini ayarlayın (5-7 W) ve bipolar modunu kullanın.
  9. elektrokoagülasyon forseps kullanın ve dikkatli tamamen kas çıkarmadan, bir kas flep oluşturma, kafatası zamansal kas çıkarın.
  10. Temporal bölgenin rostral kısmında şeffaf kafatası altında MCA tespit retro orbita dorsall sinüs. MCA çatallanma tespit edilemezse, gemi en rostral belirlemeye çalışın.
  11. sürekli ısı hasarı önlemek için sulama yaparken bir mikrotur ile MCA şube üzerinde ince kafatası.
  12. kanüller ile kemik kaldırın ve mikroforcepslerle çıkarın.
  13. 5 W. - 3 yüksek frekanslı jeneratör enerjisini azaltmak
  14. yukarıdan arter yaklaşın ve yavaşça gemi kaldırmadan her iki tarafta çift kutuplu forseps ile dokunun.
  15. damar çatallanma proksimal ve distal arter koagüle.
  16. 30 saniye bekleyin ve sonra kan akımı kalıcı kesintiye emin olmak için hafifçe arter dokunun. Bir rekanalizasyon görülmektedir eğer elektro tekrarlayın.
  17. Mümkünse, kemik defekti kapamak için kas ekleme 1 ya da 2 dikiş ile zamansal kas sabitleyin.
  18. Yarayı dikin ve ısıtmalı kurtarma kutunun içine hayvan yerleştirin. hızlı uçucu ANEST sonra Genel olarak, hayvanlar kurtarmalerine.
  19. Adım 1.16 tarif edildiği gibi hacimli ikamesi için, steril tuzlu su deri altından 0.5 mL uygulanır.
  20. Ameliyattan sonra hayvanlar 90 dakika süre ile ısıtıldı geri kafes içinde kalmak için izin verir. hayvanlar gözetimsiz bırakarak önce bilinçli kadar bekleyin. Onlar tamamen iyileşti zaman sadece diğer hayvanlarla bir kafese onları geri.
  21. 12 saat sonra, adım 1.16 açıklandığı gibi, ses ikame tekrarlayın.
  22. Içme suyu (örneğin, parasetamol (10 mg / ml) ya da diğer steroidal olmayan anti-enflamatuar ilaçlar) ile ve ameliyat sonrası analjezi uygulanır.
  23. Ameliyat sonrası her gün hayvanların sağlık durumunu kontrol edin. yeme kolaylaştırmak ve ameliyat sonrası kilo kaybı en aza indirmek için katta bir petri kabındaki püresi hayvan yiyecek sağlamak.

3. Sham Tedavisi

  1. Yukarıda da dahil olmak üzere CW maruz orta serebral ar koagüle yok hazırlık-hariç açıklanan adım 1 ve 2'ye aynı bütün prosedürleri uygulayınakü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Zaman çizelgesi ve temsili sonuçları Şekil 2 ve 3'te gösterilmiştir. Superior sagittal sinüs (Şekil 2 B, C, D), deneyimli bir cerrah tarafından gerçekleştirilen çok düşük mortalite ve morbidite oranı sonuçları için küçük bir kafatası pencere yanal ile kafa pencere hazırlama. 10 hayvanların hepsi hayatta ve tüm kronik CW bile 28 gün ameliyattan sonra, yüksek kaliteli görüntüleme için kullanılabilir. ya...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İnme 1 dünya çapında uzun süreli sakatlık ve ölüm başlıca nedenleri arasındadır. Akut tedavi, hızlandırmak ve inme sonrası iyileşmeyi artırmak için yeni yaklaşımlar ve mekanizmaları araştıran ötesinde bir asal tıbbi gol 7 kalır. Deneysel inme araştırmacılar sıklıkla fokal serebral iskemi kemirgen modelleri kullanır. Aslında, geçici veya kalıcı MCAO uyaran modelleri hastalarda 4 fokal serebral iskemi en yaygın türlerinden biri taklit. MCA proksimal ok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

VP is a participant in the Charité Clinical Scientist Program, funded by the Charité - Universitätsmedizin Berlin and the Berlin Institute of Health. TB is an SNSF PostDoc Mobility fellow. The authors receive grant support from EinsteinStiftung/A-2012-153 to PV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Binocular surgical microscopeZeissStemi 2000 C
Light source for microscopeZeissCL 6000 LED
Heating pad with rectal probeFST21061-10
Stereotactic frameKopfModel 930
Anaethesia system for isofluraneDraeger
IsofluraneAbott
Dumont forceps #5FST11251-10
Dumont forceps #7FST11271-30
Bipolar ForcepsErbe20195-501
Bipolar Forceps Erbe                              20195-022
MicrodrillFST                              18000-17         
Needle holderFST12010-14
5-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
7-0 silk sutureFeuerstein,Suprama
8-0 silk sutureFeuerstein, Suprama
Veterinary Recovery ChamberPeco ServicesV1200

Referanslar

  1. Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
  2. Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
  3. Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
  4. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  5. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
  6. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  7. Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
  8. Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
  9. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  10. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
  11. Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
  12. Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
  13. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
  14. Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  15. Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
  16. Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
  17. Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
  18. Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
  19. Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
  20. Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
  21. Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  22. Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
  23. Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
  24. Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
  25. Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
  26. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
  27. Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
  28. Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
  29. Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
  30. Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
  31. Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 118serebral iskemifeldistal MCAOkafatas pencereintravital mikroskopiiki foton mikroskopi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır