استخدام خرطوشة مرشح للترشيح المياه العينات واستخلاص الحمض النووي البيئي

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

يشير الحمض النووي البيئي (إدنا) في البيئات المائية على المواد الجينية الموجودة في عمود الماء. أثبتت الدراسات الحديثة فائدة ادنا للكشف عن الأسماك من البيئات المائية المختلفة، بما في ذلك البرك ^{1-3، 4-8} الأنهار والجداول ^9، ومياه البحر ^10-14. ركزت معظم هذه الدراسات على الكشف عن الأنواع واحدة أو عدد قليل الغازية ^{1،4-6،8،14} ونادرة أو مهددة ^3،9، في حين حاولت بعض الدراسات التي أجريت مؤخرا كشف في وقت واحد من أنواع متعددة في المجتمعات الأسماك المحلية ^{7،9، 12،13،15} وmesocosms ^11،12.

ويسمى هذا النهج الأخير "metabarcoding" ويستخدم إدنا metabarcoding واحدة أو عدة مجموعات من الاشعال PCR لcoamplify منطقة الجين عبر عينات متنوعة تصنيفيا. ويلي ذلك إعداد مكتبة مع الفهرسة وإضافة محول، ويتم تحليل المكتبات فهرستها من قبل الإنتاجية العالية التسلسل الموازيمنصة. مؤخرا ميا وآخرون. ¹² وضعت الاشعال PCR عالمية لmetabarcoding إدنا من الأسماك (وتسمى "MiFish"). الاشعال MiFish تستهدف في منطقة التغير الزائد من الميتوكوندريا 12S الريباسي جين (163-185 بي بي)، الذي يحتوي على معلومات كافية لتحديد الأسماك لعائلة التصنيف، جنس والأنواع باستثناء بعض المتجانسات ترتبط ارتباطا وثيقا. مع استخدام تلك الاشعال في إدنا metabarcoding، ميا وآخرون. ¹² الكشف عن أكثر من 230 نوعا البحرية شبه الاستوائية من الدبابات حوض السمك مع المعروفة تكوين الأنواع والشعاب المرجانية بالقرب من الحوض.

مع تحقيق بروتوكول metabarcoding لاستيعاب مياه البحر الطبيعية مع مستويات تركيز إدنا من أسماك مختلفة، لاحظنا أن الاشعال MiFish فشلت في بعض الأحيان إلى تضخيم المنطقة المستهدفة لإعداد مكتبة لاحق. واحد من الأسباب الأكثر احتمالا لهذا التضخيم PCR ناجحة هو عدم وجود كميات كافية من الشركة المصرية للاتصالاتmplate الحمض النووي الواردة في كميات صغيرة من الماء المصفى (أي 1-2 L). وعلى الرغم من تركيز إدنا من مجموعة تصنيفية معينة هو مجهول قبل التضخيم، والترشيح من كميات المياه الكبيرة (> 1-2 لتر) من شأنه أن يكون وسيلة بسيطة وفعالة لجمع أكثر إدنا من البيئات المائية مع وفرة الأسماك النادرة والكتلة الحيوية، مثل المحيطات المفتوحة وأعماق البحار النظم الإيكولوجية.

بالنسبة للمرشحات الألياف القرص المستخدمة تقليديا في عدد من البحوث إدنا الأسماك ^16، خراطيش تصفية لديها ميزة على استيعاب كميات المياه الكبيرة قبل انسداد ^17. في الواقع، أظهرت دراسة حديثة حجم كبير (> 20 L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية باستخدام خراطيش تصفية ^18. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تعبئتها بشكل فردي ومعقمة، ويمكن إجراء عدة خطوات سير العمل التجريبي في السكن التصفية، وبالتالي تقليل احتمال تعرضها للتلوث من المختبر ^19. الأخيرالميزة الهامة لإدنا metabarcoding، والذي من مخاطر التلوث ما زال ضمن أكبر التجريبية تتحدى ^20،21. على الرغم من هذه المزايا التقنية خراطيش مرشح، لم يتم استخدامه في الدراسات إدنا من الأسماك مع اثنين من الاستثناءات ^8،15.

نحن هنا نقدم بروتوكول لترشيح من عينات المياه مع فلتر خرطوشة واستخراج إدنا من مرشح من دون الحاجة إلى قطع فتح الإسكان. ونحن نقدم أيضا اثنين من أنظمة تنقية المياه البديلة اعتمادا على كميات المياه (≤4 L أو> 4 L). لمقارنة أداء بروتوكول المطورة حديثا وبروتوكول يستخدم سابقا باستخدام فلتر الألياف الزجاجية في مجموعتنا البحثية ^{12،14،22،23،} ونحن أداء إدنا metabarcoding تحليل مياه البحر من خزان ماء ضخم (7500 م ³ ) مع تركيبة الأنواع المعروفة، وعرض عدد من أنواع الكشف المستمدة من البروتوكولين كنتائج التمثيلية. هذا البروتوكول حكما تم وضعها لmetabarcoding إدنا من الأسماك، ولكن ينطبق أيضا على ادنا من الكائنات الحية الأخرى.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول لا يتعامل مع طرق أخذ العينات المياه وmetabarcoding. قد أخذ عينات المياه بطرق مختلفة اعتمادا على أغراض الدراسة ¹⁶ وانظر ميا وآخرون. ⁽¹²⁾ لتفاصيل الطرق metabarcoding باستخدام بادئات MiFish. لاحظ أن الماء عينات يجب أن تبقى باردة جدا وتصفيتها في غضون ساعات قليلة لتجنب تدهور إدنا. لاحظ أيضا أن هذا البروتوكول ينطوي على استخدام شاكر الدوارة وحاضنة، وهذه الأخيرة يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب السابق. وبالإضافة إلى ذلك، جهاز للطرد المركزي التي يمكن أن تستوعب كل من 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية أمر لا غنى عنه لإزالة السائل المتبقي من مرشح ما بعد الترشيح وجمع الحمض النووي المستخرج داخل خرطوشة، على التوالي.

1. معالجة كاب برغي وL كيس من البلاستيك 1

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L.

1. حفر حفرة من خلال مركز المسمار جا ف ب (تعلق على التخلص منها 1 لتر كيس من البلاستيك) مع نفس القطر (4.8 مم) كما أنبوب إسقاط من الذكور موصل LUER قفل. باستخدام كماشة قطري، وتقصير أنبوب من الذكور موصل LUER قفل إلى الطول المناسب (كاليفورنيا 3 ملم) لتجنب انسداد كمية صغيرة من الماء داخل الغطاء بعد الترشيح.
2. تطبيق الغراء اللاصق المتخصصة للبولي ايثيلين (PE) والبولي بروبلين (PP) إلى كل من القاع والسطح من الذكور موصل LUER القفل والمسمار كأب، على التوالي. انتظر بضع دقائق لارتباط لاصقة جيدة (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
3. إدراج موصل ذكر LUER قفل في حفرة من سقف المسمار. انتظر حتى ارتباط لاصقة كاملة من جزأين (عادة> 24 ساعة). تعقيم سقف المسمار مع الذكور موصل LUER قفل مع التبييض 10٪ التجاري (كاليفورنيا. 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.
4. لكمة اثنين من الثقوب على اثنين من الزوايا السفلية للكيس من البلاستيك 1 L من أجل تعلقها من MESلوحة ح (الخطوة 3). تأكد من أن قطر الثقوب أكبر من ذلك من شوكات على شبكة لوحة.

2. جمعية نظام الترشيح

1. إرفاق عالية أنابيب فراغ إلى موصل إدخال مضخة الشافطة ونعلق على الطرف الآخر من الأنبوب إلى مشعب. مما لا شك فيه أن تي الصمامات الثلاثة الحمراء من مشعب هي في "وضع إيقاف التشغيل" (أي، أفقي).
2. يرتدي نظيفة مجموعة من القفازات، وإدراج LUER الإناث المناسب وموصل فراغ في نهايات العلوية والسفلية من أنابيب المطاط فراغ لترشيح، على التوالي.
3. بعناية إرفاق بالتركيبة الإناث المناسب لمنفذ مخرج خرطوشة الفلتر وإرفاق موصل فراغ سدادة السيليكون.

3. الترشيح من عينات المياه (≤4 L) باستخدام فلتر خرطوشة

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم الترشيح هو> 4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب قائمة بذاتها لوحة وأو معلقة في كيس من البلاستيك مليئة 1 لتر من الماء. ومن شأن شبكة لوحة، شوكات متعددة، وموقف لوحة، كل ما هو متاح من المخازن على الانترنت، أن تكون مفيدة لتجميع هذه الوحدة. الأوتوكلاف مدخل ومخرج قبعات LUER لخرطوشة الفلتر قبل الاستخدام.

1. صب الماء عينات 1 لتر في كيس من البلاستيك وأغلق الغطاء المسمار مع الذكور موصل LUER قفل.
2. بعناية توصيل مدخل الميناء من خرطوشة فلتر تجميعها مع الذكور موصل LUER قفل من كيس من البلاستيك. لا تبالغ في تشديد موصل LUER القفل. خلاف ذلك سوف تسرب الوحدة بمجرد أن يبدأ الضخ. تأكد من أن كافة الاتصالات آمنة قبل شنقا في كيس من البلاستيك من شبكة لوحة.
3. بعناية شنق كيس من البلاستيك مع خرطوشة تصفية اثنين من شوكات على شبكة لوحة وإدراج سدادة سيليكون بمنفذ مدخل مشعب.
4. بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ردجاجة تتحول الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
5. كرر 3،1-3،4 الخطوات حتى يتم تصفية المبلغ المطلوب من المياه.
   ملاحظة: للحصول على 1 لتر من المياه المأخوذة من الشعاب المرجانية المدارية، ويستغرق حوالي ثلاث دقائق عن الترشيح.
6. بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ.
7. تتويج طرفي خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER.
8. تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات.
9. تخزين خرطوشة مرشح في -20 مئوية قبل استخراج الحمض النووي.

4. ترشيح المياه (> 4 L) عينات باستخدام فلتر خرطوشة

ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان حجم تنقية المياه هو ≤4 L. هذا النظام الترشيح يتطلب زجاجة كتاب 10 لتر مجهزة صمام والمتاح طرف ماصة 10 مل. قطرها الداخلي 10 مل ماصة (15.0 مم) وتفتق من طرفنهاية وينبغي أن تندرج إلى القطر الخارجي للصمام (15.0 مم) ومدخل الميناء من خرطوشة مرشح، على التوالي. يتم الاحتفاظ كلا اتصالات بشكل آمن أثناء الترشيح في نوبة الاحتكاك. تعقيم طرف ماصة مع التبييض التجارية 10٪ (حوالي 0.6٪ هيبوكلوريت الصوديوم) قبل الاستخدام.

1. إعداد كمية مناسبة من الماء العينة في زجاجة الكتاب. إدراج بإحكام 10 مل ماصة في صمام زجاجة كتاب 10 لتر.
2. إدراج بإحكام ميناء منفذ للخرطوشة مرشح في نهاية طرف ماصة وإدراج سدادة السيليكون في مدخل الميناء من مشعب. بدوره على الشافطة. فتح تي صمامات الحمراء للترشيح. تشغيل متعددة حتى خرطوشة الفلتر جافة، ثم اتجه الحمراء تي صمام إلى موقف قبالة.
   ملاحظة: للحصول على 10 لتر من مياه البحر التي أخذت من الشعاب المرجانية الخارجي شبه الاستوائية، ويستغرق حوالي 30-40 دقيقة للترشيح.
3. بعناية إزالة خرطوشة مرشح من كيس من البلاستيك وموصل فراغ. كاب على حد سواءينتهي من خرطوشة مع مدخل ومخرج قبعات LUER. تسمية غطاء خرطوشة وLUER مدخل مناسب باستخدام قلم المذيبات دليل لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. تخزين خرطوشة مرشح في -20 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي.

5. استخراج إدنا من تصفية

ملاحظة: في الخطوات 4 و 5، ونحن نستخدم مجموعة تجارية، إلى حد كبير بعد بروتوكول ل "الدم الأنوية" التي تقدمها المجموعة. عن البساطة، ووصف الإجراء لمعالجة خرطوشة الفردية. في الممارسة العملية، ونحن نوصي تجهيز 8 (أو الحد الأقصى لعدد أجهزة الطرد المركزي) أو أقل المرشحات في وقت واحد.

1. سخن حاضنة إلى 56 درجة مئوية.
2. إعداد أنبوب 2.0 مل عن طريق خفض الحد الأقصى يتوقف من الأنبوب. تجاهل الغطاء.
   ملاحظة: يستخدم هذا الأنبوب كما أنبوب لجمع السائل المتبقي في التصفية.
3. إزالة مدخل (لا مخرج) غطاء LUER من خرطوشة الفلتر وإدراج ط مدخل الميناءn لأنبوب جمع. بإحكام اغلاق اتصال بين أنبوب خرطوشة وجمع باستخدام فيلم الختم الذاتي.
4. إدراج وحدة دمجها في محول الطرد المركزي لأنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي خرطوشة في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة السائل المتبقي في التصفية.
5. إزالة أنبوب جمع من خرطوشة الفلتر والتخلص من الأنبوب. إعادة سقف مدخل الميناء من الخرطوشة.
6. تحضير خليط من 20 ميكرولتر حل بروتين-K، 220 ميكرولتر PBS (الفوسفات مخزنة المالحة، لم تقدم من قبل عدة) و 200 العازلة ميكرولتر AL.
   ملاحظة: خرطوشة مرشح تستوعب ما يصل إلى أربعة أضعاف حجم الخليط (. كاليفورنيا 1.8 مل).
7. إزالة الغطاء مدخل وإضافة الخليط (440 ميكرولتر) في خرطوشة تصفية باستخدام طرف ماصة. إدراج ماصة تماما في مدخل الميناء بحيث غيض ماصة مرئيا داخل خرطوشة فقط فوق الغشاء.
8. إعادة سقف مدخل الميناء ووضع السيارة فلترtridge على شاكر دوارة.
9. ضع شاكر دوارة في الحاضنة محمى على حرارة 56 مئوية، وتشغيل شاكر بسرعة 20 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
10. أثناء الحضانة، وإعداد أنبوب 2.0 مل جديد، تسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم المذيبات واقية ووضعه في أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: السابقة (2.0 مل)، وأنابيب الأخيرة (50 مل) وتستخدم لجمع الحمض النووي المستخرج ولعقد أنبوب 2.0 مل، على التوالي.
11. بعد الحضانة، وإزالة الغطاء مدخل وإدراج مدخل (لا مخرج) ميناء خرطوشة في أنبوب 2.0 مل في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إغلاق أنبوب مخروطي 50 مل مع غطاء المسمار.
12. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 50 مل في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الحمض النووي المستخرج من الخرطوشة. إزالة خرطوشة الفلتر وأنبوب 2.0 مل باستخدام ملقط معقم وغطاء الأنبوب. تجاهل خرطوشة الفلتر.

6. تنقية المستخلصة الحمض النووي

ملاحظة: نحن أزل إدنا مع 100 العازلة ميكرولتر AE بدلا من 200 ميكرولتر المحددة في دليل من عدة التجارية.

1. إضافة 200 ميكرولتر الإيثانول (96-100٪) إلى الحمض النووي المستخرج في أنبوب 2.0 مل من الخطوة أعلاه (حوالي 440 ميكرولتر)، وتخلط جيدا من قبل vortexing.
2. الماصة الخليط في عمود الدوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
3. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة 500 ميكرولتر عازلة AW1، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 5000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
4. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، إضافة AW2 العازلة 500 ميكرولتر، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20000 ز س. تجاهل التدفق من خلال أنبوب جمع.
5. إعداد أنبوب 1.5 مل جديد (لم تقدم من قبل عدة) وتسمية أنبوب بشكل مناسب باستخدام قلم ماء لسرعة التجفيف وغير تلطيخ وضع العلامات. نقل ر عمود الدورانس أنبوب 1.5 مل.
6. أزل الحمض النووي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر عازلة AE إلى مركز للغشاء عمود الدوران. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 1 دقيقة.
7. تجاهل عمود الدوران وغطاء الأنبوب. تخزين الحمض النووي تنقيته في -20 درجة مئوية.

النتائج

فمن الصعب من الناحية الفنية لعزل وتحديد إدنا الأسماك فقط من إدنا الأكبر المستخرج، لأن الاشعال MiFish coamplify المنطقة المستهدفة من بعض الفقاريات غير السمكية، مثل الطيور والثدييات، مع منتجات PCR من نفس الحجم (كاليفورنيا 170 شركة بريتيش بتروليوم ) ^12.

Discussion

في العديد من الدراسات metabarcoding باستخدام العينات البيئية مثل المياه والتربة، والعلاج في مرحلة ما بعد الترشيح من خرطوشة الفلتر بشكل عام على النحو التالي ^24،25: 1) قطع مفتوحة أو تكسير السكن مع الأدوات اليدوية (قطع الأنابيب أو كماشة)؛ 2) إزالة عامل التصفية من خرطوشة. و3) ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"