Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Zusammenfassung

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Zusammenfassung

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Einleitung

Umwelt DNA (EDNA) in der aquatischen Umwelt bezieht sich auf genetisches Material in der Wassersäule gefunden. Jüngste Studien zeigten den Nutzen von Edna für Fische aus verschiedenen Gewässern zu erfassen, einschließlich Teiche ^1-3, Flüsse ^4-8, Ströme ⁹ und Meerwasser ^14.10. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich auf Nachweis eines einzelnen oder wenigen invasive ^1,4-6,8,14 und seltene oder bedrohte Arten ^3,9, während einige neuere Studien gleichzeitigen Nachweis mehrerer Spezies in lokalen Fischgemeinschaften ^{7,9 versuchte, 12,13,15} und Mesokosmen ^11,12.

Der zweite Ansatz ist "metabarcoding" genannt und Edna metabarcoding verwendet einen oder mehrere Sätze von PCR-Primer über taxonomisch diverse Proben eine Genregion auf coamplify. Dies wird durch die Bibliotheksvorbereitung mit Indexierungs- und Adapter-Addition und die indizierten Bibliotheken von einem Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert parallel sindPlattform. Kürzlich Miya et al. ¹² entwickelte Universal-PCR - Primer für metabarcoding EDNA von Fischen (genannt "MiFish"). Die MiFish Primer zielen auf eine hypervariablen Region des mitochondrialen 12S-rRNA-Gens (163-185 bp), die ausreichende Informationen enthält Fische zu taxonomischen Familie, Gattung und Art zu identifizieren, mit Ausnahme einiger eng verwandten Artgenossen. Mit der Verwendung dieser Primer in EDNA metabarcoding, Miya et al. ¹² erfasst mehr als 230 subtropische Meeresarten von Aquarien mit bekannten Artenzusammensetzung und Korallenriffe in der Nähe des Aquariums.

Während das Protokoll metabarcoding Optimierung natürlichem Meerwasser aufzunehmen mit einem Gehalt an EdNA Konzentration von Fischen unterschiedlicher haben wir bemerkt, dass die MiFish Primer gelegentlich die Zielregion für die nachfolgende Herstellung Bibliothek zu amplifizieren fehlgeschlagen. Eine der häufiger Grund für diese nicht erfolgreich PCR-Amplifikation ist der Mangel an ausreichender Mengen der template DNA in kleinen Mengen Wasser enthielt gefiltert (dh 1-2 L). Obwohl EDNA-Konzentration von einer bestimmten taxonomischen Gruppe vor der Verstärkung unerkennbar ist, Filtration von großen Wassermengen (> 1-2 L) wäre ein einfaches und wirksames Mittel sein, um mehr EDNA aus den Gewässern mit knappen Fischreichtum und Biomasse zu sammeln, wie zum Beispiel im offenen Meer und Tiefseeökosysteme.

Bezogen auf Platte Faserfiltern üblicherweise in einer Reihe von Fisch EDNA Forschung ¹⁶ verwendet, Filterpatronen haben den Vorteil , größere Wassermengen vor ¹⁷ Verstopfung zuvorkommend . Eigentlich eine aktuelle Studie zeigte großes Volumen (> 20 L) Filtration von Küstenmeerwasser Proben unter Verwendung von Filterkartuschen ^18. Darüber hinaus werden sie einzeln verpackt und steril, und mehrere Schritte des experimentellen Arbeitsablauf kann in das Filtergehäuse durchgeführt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination aus der Labor ¹⁹ reduziert wird . letztereMerkmal ist entscheidend für die EDNA metabarcoding, in denen die Gefahr einer Kontamination bleibt unter den größten experimentellen ^20,21 herausfordert. Trotz dieser technischen Vorteile von Filterpatronen, es war nicht in EdNA Studien von Fischen mit zwei Ausnahmen ^8,15 verwendet.

Hier bieten wir ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit der Filterpatrone und Extraktion von Edna aus seinem Filter, ohne das Gehäuse öffnen zu schneiden zu müssen. Wir bieten auch zwei alternative Wasserfiltersysteme in Abhängigkeit von den Wassermengen (≤4 L oder> 4 l). Um die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Protokoll vergleichen und ein zuvor verwendetes Protokoll ein Glasfaserfilter in unserer Forschungsgruppe mit ^12,14,22,23, führen wir EDNA metabarcoding Analyse von Meerwasser aus einem riesigen Aquarium (7500 m ³ ) mit bekannten Artenzusammensetzung und zeigen die Anzahl der nachgewiesenen Spezies aus den beiden Protokollen als repräsentative Ergebnisse abgeleitet. Dieses Protokoll hwie für metabarcoding EDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch für Edna aus anderen Organismen.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll befasst sich nicht mit Wasser Probenahme und metabarcoding Methoden. Wasser kann auf verschiedene Arten je nach Studienzwecke ¹⁶ und siehe Miya et al. ¹² Einzelheiten zu den metabarcoding Methoden MiFish Primer zu beproben. Beachten Sie, dass das abgetastete Wasser sollte sehr kalt und innerhalb weniger Stunden gefiltert gehalten, um den Abbau von Edna zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass dieses Protokoll die Verwendung eines Rotationsschüttler beinhaltet und einen Inkubator, und dieser muss groß genug sein, um den ehemaligen zubringen. Zusätzlich kann eine Zentrifuge, Das beherbergen jeweils 15 ml und 50 ml konische Röhrchen ist unerlässlich, um die restliche Flüssigkeit aus dem post-Filtrationsfilter zu entfernen und extrahierte DNA innerhalb der Kassette zu sammeln, respectively.

1. Die Verarbeitung einer Schraubkappe und einem 1 L-Plastiktasche

HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen> 4 L.

1. Bohren Sie ein Loch durch die Mitte einer Schraube cap (befestigt an einem wegwerfbaren 1 L Plastiktüte) mit gleichem Durchmesser (4,8 mm) als das Rohr aus einem männlichen Luer-Lock Anschluss vorsteht. Verwendung Beißzange, verkürzen die Röhre des männlichen Luer-Lock - Anschluss auf eine geeignete Länge (ca. 3 mm) Zusetzen einer kleinen Menge an Wasser innerhalb der Kappe nach der Filtration zu vermeiden.
2. Tragen Sie einen Klebstoff Klebstoff spezialisiert für Polyethylen (PE) und Polypropylen (PP) sowohl mit dem Boden und der Oberfläche des männlichen Luer-Lock-Anschluss und Schraubverschluss sind. Warten Sie ein paar Minuten für eine gute Verklebung (siehe Anweisungen des Herstellers).
3. Setzen Sie den männlichen Luer-Lock-Anschluss in das Loch der Schraubkappe. Warten, bis eine vollständige Verklebung der beiden Teile (in der Regel> 24 h). Sterilisieren Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock - Anschluss mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch.
4. Lochen Sie zwei Löcher an den beiden unteren Ecken des 1 L Plastikbeutel, um sie von einem mes zu hängenh Panel (Schritt 3). Sicherzustellen, dass der Durchmesser der Löcher größer ist als die der Zacken auf dem Netzeinsatz.

2. Montage des Filtrationssystems

1. Bringen Sie Hochvakuumschlauch an den Eingangsanschluss einer Saugpumpe und das andere Ende des Schlauchs an einem Verteiler. Achten Sie darauf , dass die drei roten T-Ventile des Verteilers in der "Aus - Position" sind (dh horizontal).
2. Das Tragen eines sauberen Reihe von Handschuhen, legen Sie eine weibliche Luer-Fitting und ein Vakuum-Anschluss an den oberen und unteren Ende des Vakuumgummischlauch für die Filtration, respectively.
3. Sorgfältig befestigen den Vakuumverbinder mit einem Silikonstopfen den weiblichen Luer-Fitting an einem Auslassanschluss der Filterpatrone und befestigen.

3. Filtration von Wasserproben (≤4 L), um die Filterpatrone mit

HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen> 4 L. Dieses Filtrationssystem erfordert eine selbststehende Platte foder hängen Sie den Plastikbeutel mit 1 l Wasser gefüllt. Ein Mesh-Panel, mehrere Zinken, und ein Ständer für das Panel, die alle von Online-Shops, würde für die Montage dieses Gerät nützlich sein. den Einlass Autoklav und Luer-Kappen für die Filterpatrone vor dem Gebrauch Steckdose.

1. Gießen Sie die 1 L abgetastet Wasser in den Plastikbeutel und schließen Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock-Anschluss.
2. eine Einlaßöffnung des zusammengebauten Filterpatrone mit dem männlichen Luer-Lock Anschluss des Kunststoffbeutels sorgfältig verbinden. Sie nicht zu fest anziehen, den Luer-Lock-Anschluss; sonst wird das Gerät auslaufen, sobald die Pumpen beginnt. Seien Sie sicher, dass alle Verbindungen sicher sind, bevor die Plastikbeutel von einem Mesh-Panel hängen.
3. hängen Sie vorsichtig den Plastikbeutel mit der Filterpatrone aus zwei Zinken auf dem Mesh-Panel und einsetzen des Verteilers einen Silikonstöpsel in einer Einlassöffnung.
4. Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone ist trocken, tHenne die roten T-Ventil in die Stellung drehen.
5. Wiederholen 3.1-3.4 Schritte, bis die gewünschte Menge Wasser gefiltert wird.
   HINWEIS: Für 1 l Wasser aus den subtropischen Korallenriffen genommen, es etwa drei Minuten für die Filtration erfolgt.
6. Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss.
7. Kappe an beiden Enden der Patrone mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps.
8. Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird.
9. Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion.

4. Filtration von Wasser (> 4 L) Proben die Filterpatrone mit

Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn der Wasserfiltrationsvolumen ist ≤4 L. Dieses Filtrationssystem 10 L Buch-Flasche mit einem Ventil und einem Einweg-10-ml-Pipettenspitze ausgestattet erfordert. Ein Innendurchmesser der Pipettenspitze 10 ml (15,0 mm) und eine Verjüngung der SpitzeEnde sollte zu einem Außendurchmesser des das Ventil (15,0 mm) passen und Einlassöffnung der Filterpatrone sind. Beide Verbindungen werden sicher während der Filtration in einer Reibungspassung gehalten wird. Sterilisieren Sie die Pipettenspitze mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch.

1. Bereiten Sie eine angemessene Menge an abgetasteten Wasser in dem Buch Flasche. Dicht legen Sie die 10 ml Pipettenspitze in das Ventil von 10 L Buch Flasche.
2. die Auslassöffnung der Filterpatrone in die Pipettenspitze Ende fest einsetzen und den Silikonstopfen in die Einlaßöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone trocken ist, dann drehen Sie den roten T-Ventil in die Stellung.
   HINWEIS: Für 10 l Meerwasser aus den subtropischen Außen Korallenriffe genommen, es ca. 30-40 min für die Filtration erfolgt.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss. Cap beidedie Kartusche Enden mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps. Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion.

5. Extraktion von Edna aus dem Filter

HINWEIS: In den Schritten 4 und 5, verwenden wir einen kommerziellen Kit, weitgehend nach einem Protokoll für "nukleierten Blut" von dem Kit zur Verfügung gestellt. Der Einfachheit halber beschreiben wir das Verfahren zur Verarbeitung einer einzelnen Patrone. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung 8 (oder die maximale Anzahl der Zentrifuge) oder weniger Filter auf einmal.

1. Wärmen Sie einen Inkubator auf 56 ° C.
2. Bereiten Sie eine 2,0-ml-Röhrchen durch den Klappdeckel aus dem Rohr zu schneiden. Entsorgen Sie die Kappe.
   HINWEIS: Dieser Schlauch wird als Sammelrohr für die restliche Flüssigkeit in dem Filter verwendet.
3. Entfernen Sie den Einlass (NICHT Auslass) Luer-Kappe aus der Filterpatrone und setzen Sie die Einlassöffnung inde Sammelröhrchen. dicht schließen eine Verbindung zwischen der Patrone und dem Sammelrohr eine selbstdichtende Folie verwendet wird.
4. Legen Sie die kombinierte Einheit in ein Zentrifugen Adapter für einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Patrone bei 5.000 × g für 1 min die restliche Flüssigkeit in dem Filter zu entfernen.
5. Entfernen Sie die Sammelröhrchens aus der Filterpatrone und dem Rohr zu verwerfen. Re-Kappe die Einlassöffnung der Patrone.
6. Bereiten einer Mischung aus 20 & mgr; l Proteinase-K-Lösung, 220 ul PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, nicht von dem Kit bereitgestellt) und 200 & mgr; l AL puffern.
   HINWEIS: Die Filterpatrone für bis zu vier Mal die Volumina des Gemisches (. Ca. 1,8 ml).
7. Entfernen Sie die Einlasskappe und fügen Sie die Mischung (440 ul) in die Filterkartusche mit einer Pipettenspitze. Legen Sie die Pipette vollständig in die Einlassöffnung, so dass die Pipettenspitze nur oberhalb der Membran in der Kassette sichtbar.
8. Re-Kappe die Einlassöffnung und setzen Sie den Filter AutoTridge auf einem Rotationsschüttler.
9. Setzen Sie den Rotationsschüttler im vorgeheizten Inkubator bei 56 ° C und schalten Sie den Schüttler bei einer Geschwindigkeit von 20 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten.
10. Während der Inkubation bereiten ein neues 2,0-ml-Röhrchen, beschriften Sie das Rohr in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift und legen Sie sie in einem 50 ml konischen Röhrchen.
    HINWEIS: Die ehemalige (2,0 ml) und letztere Rohre (50 ml) für die Erfassung der extrahierten DNA und zum Halten der 2,0-ml-Röhrchen verwendet wurden.
11. Nach der Inkubation die Einlasskappe entfernen und den Einlass (NICHT Auslass) -Anschluss der Patrone in die 2,0-ml-Röhrchen in der 50 ml konischen Röhrchen ein. Schließen die 50 ml konischen Röhrchen mit Schraubverschluss.
12. Zentrifugieren der 50-ml konischen Röhrchen bei 5.000 × g für 1 min die extrahierte DNA aus der Patrone zu sammeln. Entfernen Sie die Filterpatrone und das 2,0-ml-Röhrchen mit sterilisierten Zange und die Kappe der Röhre. Entsorgen Sie die Filterpatrone.

6. Reinigung von extrahierter DNA

HINWEIS: Wir eluieren EDNA mit 100 ul Puffer AE anstelle von 200 & mgr; l in der Bedienungsanleitung des kommerziellen Kits angegeben.

1. In 200 ul Ethanol (96-100%) zu der extrahierten DNA in der 2,0-ml - Röhrchen aus dem obigen Schritt (ca. 440 & mgr; l) und gründlich mischen durch Vortexen.
2. Pipettieren der Mischung in eine Spin-Säule in ein Sammelröhrchen 2 ml gebracht. Zentrifuge bei 5000 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
3. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500 & mgr; l Puffer AW1 und Zentrifuge für 1 min bei 5.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
4. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500-ul Puffer AW2 und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
5. Bereiten Sie einen neuen 1,5-ml-Röhrchen (nicht im Kit enthalten) und beschriften Sie das Rohr entsprechend einem wasserfesten Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Übertragen Sie die Spin-Säule to der 1,5-ml-Röhrchen.
6. Eluieren der DNA durch Zugabe von 100 & mgr; l Puffer AE zu der Mitte der Spinsäule Membran. Inkubieren für 1 min bei Raumtemperatur und dann bei 6.000 × g für 1 min zentrifugiert.
7. Entsorgen Sie die Spin-Säule und die Kappe der Röhre. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C.

Ergebnisse

Es ist technisch schwierig zu isolieren und nur Fische EdNA aus dem extrahierten bulk EdNA quantifizieren, da die MiFish Primern den Zielbereich von einigen nicht-Fisch Vertebraten, wie Vögel und Säugetiere, mit PCR - Produkten der gleichen Größe coamplify (ca. 170 bp ) ^12. Statt Fisch EDNA der Quantifizierung führen wir MiFish von Edna aus einem Aquarium Tank mit bekannten Artenzusammensetzung metabarcoding Analyse der zwei verschiedenen Methoden der Filtration ...

Diskussion

In vielen metabarcoding Studien unter Verwendung von Umweltproben wie Wasser und Boden, post-Filtrationsbehandlung der Filterpatrone ist in der Regel wie folgt ^24,25: 1) Aufschneiden oder rissiger das Gehäuse mit Handwerkzeugen (Rohrschneider oder Zange); 2) Entfernen des Filters aus der Patrone; und 3) Schneiden des Filter in kleine Stücke mit einer Rasierklinge für die DNA-Extraktion. Um derartige umständliche und zeitraubende Verfahren zu vermeiden, die zu einer Verunreinigung im Labor anfällig sind, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"