Filtrasyon Su Örnekleri ve Çevre DNA Ekstraksiyon için bir Filtre Kartuşu Kullanımı

Özet

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Özet

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Giriş

su ortamlarında çevresel DNA (Edna'yı) su sütunu bulunan genetik malzemeyi ifade eder. Son çalışmalar, göletler ^1-3, nehirler ^4-8 dahil olmak üzere çeşitli su ortamlarında, gelen balıkları tespit etmek için Edna yararını göstermiştir ⁹ akarsu ve deniz suyu ^10-14. Bazı yeni çalışmalar yerel balık toplulukları ^7,9 birden fazla türün aynı anda algılama girişiminde ise bu çalışmaların ^{çoğu, 3,9} tür tek veya birkaç invaziv ^1,4-6,8,14 ve nadir ya da tehdit tespiti üzerinde duruldu ^12,13,15 ve mesocosms ^11,12.

İkinci yaklaşım, "metabarcoding" olarak adlandırılır ve Edna metabarcoding taksonomik çeşitli örnekleri arasında, bir gen bölgesini coamplify PCR primerleri, bir ya da birden fazla setleri kullanır. Bu dizin ve adaptör ek kütüphane hazırlanması tarafından takip edilir ve dizin kütüphaneler, yüksek verimli, paralel dizilemesi ile analiz edilmektedirplatformu. Son zamanlarda Miya ve ark., ¹² ( "MiFish" olarak anılacaktır) balıklardan Edna metabarcoding için evrensel PCR primerleri geliştirdi. MiFish primerler taksonomik familya, cins ve bazı yakından ilgili Petkim'de hariç türlere balıklar belirlemek için yeterli bilgi içeren mitokondrial 12S rRNA geninin (163-185 bp), bir hiper-değişken bölgesini hedef. Edna metabarcoding bu primerlerin kullanımı ile Miya ve ark., ¹² akvaryum yakın bilinen türlerin kompozisyonu ve mercan resifleri ile akvaryum tankları 230'dan fazla subtropikal deniz türleri tespit edildi.

metabarcoding protokolünü optimize balıklardan edna konsantrasyon düzeyleri değişen doğal deniz suyu karşılamak için, biz MiFish primerleri bazen sonradan kütüphane hazırlanması için hedef bölgeyi yükseltmek için başarısız olduğunu fark etmiş. Bu başarısız PCR amplifikasyonu daha muhtemel nedenlerinden biri TE yeterli miktarda olmamasıfiltre edilmiş su ve küçük miktarlarda ihtiva mplate DNA (örneğin 1-2 L). Belirli bir taksonomik grup edna konsantrasyonu büyük su hacimleri (> 1-2 L), filtrasyon amplifikasyonu önce bilinemez olmasına rağmen olur kıt balık bolluğu ve biyokütle gibi sucul ortamlarda daha Edna toplamak için basit ve etkili bir araç olabilir açık okyanus ve derin deniz ekosistemleri.

Disk fiber filtrelere Bağıl geleneksel balık edna araştırma ¹⁶ bir dizi kullanılır, filtre kartuşları ¹⁷ tıkanma önce büyük su hacimleri barındıran avantajına sahiptir. Aslında, yeni bir çalışma büyük hacimli (> 20 L) filtre kartuşları ¹⁸ kullanılarak kıyı deniz suyu numunelerinin filtrasyon gösterdi. Buna ek olarak, ayrı ayrı paketlenmiş ve steril ve deneysel iş akışının birkaç adım böylece laboratuvar ¹⁹ bulaşma olasılığını azaltarak, filtre konut yapılabilir vardır. İkincisiözelliği büyük deneysel ^20,21 zorluklar arasında hangi bulaşma riski kalır edna metabarcoding için kritik öneme sahiptir. Filtre kartuşları bu teknik avantajlara rağmen, iki istisna ^8,15 ile balıkların Edna çalışmalarında kullanılan olmamıştır.

Burada konut kesip açmak zorunda kalmadan kendi filtreden Edna filtre kartuşu ve çıkarma ile su örneklerinin filtrasyonu için bir protokol sağlar. Biz de su hacimleri (≤4 L veya> 4 L) bağlı olarak iki alternatif su filtrasyon sistemleri sağlamaktadır. Yeni geliştirilen protokol performansı ve Araştırma grubumuzda ^12,14,22,23 bir cam elyaf filtre kullanılarak önceden kullanılan protokol karşılaştırmak için, biz Edna büyük bir akvaryum tankı deniz suyunun analizini metabarcoding gerçekleştirmek (7500 m ³ ) bilinen türlerin bileşimi ile ve temsilcisi sonuçları olarak iki protokol türetilen tespit türlerin sayısını gösterir. Bu protokol, Holarak balıklardan Edna metabarcoding için geliştirilmiş, ancak diğer organizmalardan Edna de uygulanabilir olmuştur.

Protokol

NOT: Bu protokol, su örnekleme ve metabarcoding yöntemleri ile uğraşmaz. Su çalışma amaçlı ¹⁶ bağlı olarak farklı şekillerde örneklenmiş ve görmek Miya ve ark., ¹² MiFish primerler kullanılarak metabarcoding yöntemlerinin ayrıntılı bilgi için olabilir. örneklenen su çok soğuk tutulur ve Edna bozulmasını önlemek için birkaç saat içinde süzülür gerektiğini unutmayın. Ayrıca, bu protokol, bir döner karıştırıcı ve bir kuluçka kullanılmasını içerir dikkat ve ikinci önceki alacak kadar büyük olması gerekmektedir. Buna ek olarak, bir santrifüj konik borular sonrası filtrasyon filtreden kalan sıvıyı çıkarmak için, sırasıyla, kartuş içinde edilen DNA toplamak için vazgeçilmezdir hem 15 ml ve 50 ml barındırabilir.

1. Vida Kapağı ve 1 L Plastik Çanta İşleme

NOT: filtrasyon hacmi> 4 L ise bu adımı atlayın

1. bir vida, C dairesinin merkezinde bir delik delinbir erkek luer-lock konnektörü çıkan boru ile aynı çapta (4.8 mm) ap (tek kullanımlık 1 litrelik plastik torbaya bağlı). Çapraz pense kullanarak filtrasyon sonrası başlık içinde suyun küçük bir miktarının tıkanmasını önlemek için uygun bir uzunluk (yaklaşık. 3 mm) erkek luer kilit bağlayıcısı tüpünü kısaltır.
2. sırasıyla, erkek luer-lock konnektörü alt ve yüzey hem polietilen (PE) ve polipropilen (PP) için özel bir yapıştırıcı tutkal sürün ve kapağını kapatın. İyi yapıştırma için birkaç dakika (üreticinin talimatlarına bakın) bekleyin.
3. vidalı kapak deliğine erkek luer kilit bağlantısını takın. iki bölümden (genellikle> 24 saat) tam yapıştırma kadar bekleyin. Kullanmadan önce% 10 ticari ağartıcı (ca.% 0.6 sodyum hipoklorit) ile erkek luer-lock konnektör ile vidalı kapak sterilize edin.
4. Bir mes onu asmak için 1 litrelik plastik torba iki alt köşelerindeki iki deliklerh paneli (adım 3). delik çapı örgü panelinden sivri uçların daha büyük olduğundan emin olun.

Filtrasyon Sistemi 2. Montaj

1. Bir aspiratör pompasının giriş konnektörüne yüksek vakum tüp takın ve bir manifolda Hortumun diğer ucunu. Manifoldunun üç kırmızı t-vanaları "kapalı konuma" (yani, yatay) içinde olduğundan emin olun.
2. eldiven temiz bir dizi giyen, sırasıyla, uydurma bir kadın luer yerleştirin ve filtrasyon için vakum lastik boru üst ve alt uçlarında bir vakum konektörü.
3. Dikkatle filtre kartuşunun bir çıkış noktasına uygun dişi luer ekleyin ve bir silikon durdurucu vakum konektörü takın.

Filtre Kartuşu kullanarak Su Örnekleri (≤4 L) 3. Filtrasyon

NOT: filtrasyon hacmi> 4 L Bu filtrasyon sistemi ise bu adımı atlayın kendi başına ayakta durabilen paneli f gerektirirya da 1 L su ile dolu plastik torba asılı. Bir örgü paneli, çoklu çatallar ve panel için bir stand, çevrimiçi mağazalardan temin, bu üniteyi montaj için yararlı olacaktır. giriş Otoklav ve kullanılmadan önce filtre kartuşu için luer kapaklar çıkış.

1. plastik torba içine 1 L örneklenmiş su dökün ve erkek luer-lock konnektör ile vidalı kapağını kapatın.
2. Dikkatle plastik torba erkek luer-lock konnektör ile birleştirilmiş filtre kartuşunun bir giriş portuna bağlamak. Luer-lock konnektör fazla sıkmayın; pompalama başladığında, aksi takdirde ünite sızdırıyor. Tüm bağlantıları örgü panelinden plastik torba asılı önce güvenli olduğundan emin olun.
3. Dikkatle örgü panelinden iki çatal uç filtre kartuşu ile bir plastik torba takılmak ve manifold arasında bir giriş portuna bir silikon tıpa yerleştirin.
4. aspiratör açın. filtrasyon için kırmızı t-vanalarını açın. Filtre kartuşu kuruyana kadar t manifoldu çalıştırıntavuk kapalı konuma kırmızı t-vanayı çevirin.
5. su istenilen miktarda süzülür kadar 3,1-3,4 adımları tekrarlayın.
   NOT: subtropikal mercan resifleri alınan 1 L su için, filtrasyon için yaklaşık üç dakika sürer.
6. Dikkatle plastik torba ve vakum konnektörü filtre kartuşunu çıkarın.
7. giriş ve çıkış luer kapaklarla kartuşun her iki ucunu kap.
8. uygun hızlı kuruma ve non-bulaşması etiketlemesi için bir çözücü geçirmez kalem kullanarak kartuş ve giriş luer kapağını etiketleyin.
9. DNA ekstraksiyon önce -20 ° C'de filtre kartuşunu saklayın.

Su 4. Filtreleme (> 4 L) Filtre Kartuşu kullanarak Örnekleri

Not: su filtrasyon hacmi L. Bu filtrasyon sistemi bir vana ve tek kullanımlık 10 ml pipet ile donatılmış bir 10 L kitap şişe gerektirir ≤4 ise bu adımı atlayın. 10 ml pipet ucu (15.0 mm) bir iç çapa ve ucu bir konikucu, sırasıyla, filtre kartuşunun bir valf (15.0 mm) dış çapı ile giriş ağzına uygun olmalıdır. Her iki bağlantı bir sürtünme filtrasyon esnasında güvenli korunur. Kullanmadan önce% 10 ticari ağartıcı (yaklaşık% 0.6 sodyum hipoklorit) ile pipet sterilize edin.

1. Kitap şişede alınan su numunelerinin uygun bir miktar hazırlayın. Sıkıca 10 L kitap şişe vananın içine 10 ml pipet yerleştirin.
2. Sıkıca pipet ucuna filtre kartuşunun çıkış noktası yerleştirin ve manifold giriş portuna silikon tıpa yerleştirin. aspiratör açın. filtrasyon için kırmızı t-vanalarını açın. Filtre kartuşu kuruyana kadar manifoldu çalıştırın, daha sonra kapalı konuma kırmızı t-vanayı çevirin.
   NOT: subtropikal dış mercan resifleri alınan deniz suyu 10 L için, filtrasyon için yaklaşık 30-40 dakika sürer.
3. Dikkatle plastik torba ve vakum konnektörü filtre kartuşunu çıkarın. Cap hemgiriş ve çıkış luer kapaklarla kartuşun sona erer. uygun hızlı kuruma ve non-bulaşması etiketlemesi için bir çözücü geçirmez kalem kullanarak kartuş ve giriş luer kapağını etiketleyin. DNA ekstraksiyonu önce -20 ° C'de filtre kartuşunu saklayın.

Filtre Edna 5. Ekstraksiyon

NOT: adım 4 ve 5, biz büyük ölçüde kit tarafından sağlanan "çekirdekli kan" için protokol sonrasında ticari kiti kullanın. Basitlik için, biz tek bir kartuş işlenmesi için prosedürü açıklar. Uygulamada, bir defada işlemi 8 (veya santrifüj sayısını) veya daha az filtre tavsiye ederiz.

1. 56 ° C'ye kadar bir inkübatör önceden ısıtın.
2. tüpten menteşeli kapağı keserek 2.0 ml tüp hazırlayın. Kapağı atın.
   NOT: Bu tüp filtresi kalan sıvı için bir toplama tüpü olarak kullanılır.
3. Filtre kartuşunun giriş (NOT çıkışı) diş kapağını çıkarın ve giriş deliği i eklemektoplama tüpü nto. Sıkıca bir kendi kendine kapanan filmi kullanılarak kartuş toplama tüpünün arasında bir bağlantı mühür.
4. 15 ml konik tüp santrifüj adaptörüne kombine birimi yerleştirin. Filtrede geri kalan sıvının çıkması için 1 dakika için 5000 x g'de kartuşu santrifüjleyin.
5. filtre kartuşu toplama tüpü çıkarın ve tüp atın. Yeniden kapak kartuş giriş portu.
6. (; Olmayan kiti tarafından sağlanan fosfat tamponlu tuzlu su) ve 200 ul AL tampon 20 ul proteinaz-K çözeltisi karışımı, 220 ul PBS hazırlayın.
   NOT: Filtre kartuşu karışımı dört kat hacimleri kapasitelidir (. Ca 1.8 ml).
7. giriş kapağını çıkarın ve bir pipet kullanarak filtre kartuşunun içine karışımı (440 ul) ekleyin. pipet sadece membranın üzerine kartuşunun içindeki görünür böylece giriş portuna tamamen pipet yerleştirin.
8. -Cap Yeniden giriş portu ve filtre araba koyunbir döner çalkalayıcıda kartuşunu.
9. 56 ° C'de önceden ısıtılmış bir inkübatör döner sallayıcı yerleştirin ve 20 dakika boyunca 20 rpm bir hızda bir karıştırıcı üzerinde açın.
10. İnkübasyon sırasında, yeni bir 2.0 ml'lik tüp hazırlanması uygun bir çözücü dayanıklı kalemle tüp etiket ve 50 ml konik bir tüp içinde yerleştirin.
    Not: Eski (2.0 mi) ve ikinci tüp (50 mi) ile ekstre DNA'nın toplanması için, sırasıyla, 2.0 mi tüpünü tutmak için kullanılır.
11. inkübasyondan sonra, giriş kapağını çıkarın ve 50 ml konik tüp içinde 2.0 ml tüp içine (çıkış DEĞİL) kartuşun limanı girişini takın. bir vidalı başlık ile 50 ml konik tüp kapatın.
12. 1 dakika kartuştan ekstre DNA'nın toplanması için 5000 x g'de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. Filtre kartuşu ve sterilize forseps kullanarak 2.0 ml tüp çıkarın ve tüp kap. Filtre kartuşunu atın.

Ayıklanan DNA 6. saflaştırılması

NOT: 100 ul tampon AE yerine ticari kitin kılavuzda belirtilen 200 ul Edna Zehir.

1. Yukarıdaki aşama (yaklaşık 440 ul) 2.0 ml'lik bir tüp içinde edilen DNA 200 ul etanol (% 96-100) ilave edildi ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır.
2. Pipet 2 ml'lik bir toplama tüpü içine yerleştirilen bir sıkma sütuna karışımı ile gerçekleştirilmektedir. 1 dakika için 5000 x g'de santrifüjleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
3. Yeni 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde spin kolon yerleştirin 5000 x g, 1 dakika süre ile 500 ul tampon Aw1 ve santrifüj ekleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
4. g, yeni bir 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde spin kolon alındı ​​X 20,000 3 dakika boyunca 500 ul tampon Aw2 ve santrifüj ekleyin. Flow-through ve toplama tüpü atın.
5. (Değil kit tarafından sağlanan) yeni bir 1.5 ml tüp hazırlayın ve uygun hızlı kuruma ve etiketleme olmayan bulaşması için su geçirmez bir kalem kullanarak tüp etiket. spin kolon t aktar1.5 ml tüp o.
6. spin kolon membran merkezine 100 ul tampon AE ekleyerek DNA Zehir. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjlenir.
7. spin kolon atın ve tüp kap. -20 ° C'de arıtılmış, DNA saklayın.

Sonuçlar

Bu MiFish primerleri gibi kuşlar ve memeliler gibi bazı balık olmayan omurgalılar, hedef bölge coamplify çünkü aynı boyutta PCR ürünleri ile, izole etmek ve çıkarılan toplu Edna sadece balık Edna ölçmek teknik olarak zordur (ca. 170 bp ) ^12. Bunun yerine balık Edna nicel, biz filtrasyon ve DNA ekstraksiyon iki farklı yöntem kullanılarak bilinen türlerin kompozisyonu ile bir akvaryum tankından Edna analizini metabarcoding MiFish gerçekleştirmek...

Tartışmalar

Su ve toprak gibi çevresel numuneler kullanılarak birçok metabarcoding çalışmalarında aşağıdaki gibi filtre kartuşunun sonrası filtrasyon tedavi genellikle ^24,25: 1) açık kesilmesi veya el aletleri (boru kesici veya pense) ile konut çatlama; 2) kartuştan filtrenin kaldırılması; ve 3) DNA ekstraksiyonu için bir jilet ile küçük parçalar halinde filtre kesilmesi. yaygın olarak kullanılan, ucuz ticari kiti kullanılarak filtre kartuşunun mahfaza içinde böyle hantal ve zaman alıcı la...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"