El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente

Resumen

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Resumen

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introducción

ADN Ambiental (Edna) en los ambientes acuáticos se refiere a material genético que se encuentra en la columna de agua. Estudios recientes han demostrado la utilidad de Edna para la detección de peces de diferentes ambientes acuáticos, incluyendo estanques, ríos ^{1-3 4-8,} corrientes ^{9, 10-14} y agua de mar. La mayoría de estos estudios se centraron en la detección de una sola o unas pocas invasiva ^1,4-6,8,14 y especies raras o amenazadas ^3,9, mientras que algunos estudios recientes intentaron detección simultánea de múltiples especies en las comunidades locales de pescado ^{7,9, 12,13,15} y mesocosmos ^11,12.

Este último enfoque se denomina "metabarcoding" y Edna metabarcoding utiliza uno o varios conjuntos de cebadores de PCR para coamplify una región génica a través de taxonómicamente diversas muestras. Esto es seguido por la preparación de la biblioteca con la indexación y la adición adaptador, y las bibliotecas de indexado se analizan mediante una secuenciación paralela de alto rendimientoplataforma. Recientemente Miya et al. ¹² desarrollaron cebadores universales de PCR para metabarcoding Edna de peces (llamados "MiFish"). Los cebadores MiFish se dirigen a una región hipervariable del gen mitocondrial 12S rRNA (163-185 pb), que contiene información suficiente para identificar peces a la familia taxonómica, género y especie a excepción de algunos congéneres estrechamente relacionadas. Con el uso de estos cebadores en Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² detectaron más de 230 especies marinas subtropicales de tanques del acuario con conocidos composición de las especies y arrecifes de coral cerca del acuario.

Al tiempo que optimiza el protocolo metabarcoding para dar cabida a agua de mar natural con diferentes niveles de concentración de peces Edna, nos hemos dado cuenta de que los cebadores MiFish vez en cuando no amplificar la región diana para la posterior elaboración de la biblioteca. Una de las razones más probables para esta amplificación por PCR pierda falta de cantidades adecuadas de la teADN mplate contenida en pequeños volúmenes de agua filtrada (es decir, 1-2 L). Aunque la concentración de Edna de un grupo taxonómico específico es desconocido antes de la amplificación, filtración de grandes volúmenes de agua (> 1-2 L) sería un medio sencillo y eficaz para recoger más Edna de los ambientes acuáticos con escasa abundancia de peces y la biomasa, tales como de alta mar y de aguas profundas ecosistemas.

En relación con filtros de fibra de disco utilizado convencionalmente en una serie de investigaciones Edna pescado ^16, cartuchos de filtro tienen la ventaja de acomodar volúmenes de agua más grandes antes de obstrucción ^17. De hecho, un estudio reciente mostró gran volumen (> 20 l) de filtración de muestras de agua marina costeras que utilizan cartuchos de filtro ^18. Además, se empaquetan individualmente y estéril, y varios pasos del flujo de trabajo experimental se pueden realizar en la carcasa del filtro, reduciendo así la probabilidad de contaminación del laboratorio ^19. El últimocaracterística es crítica por Edna metabarcoding, en el que el riesgo de contaminación se mantiene entre los más grandes experimental desafía ^20,21. A pesar de estas ventajas técnicas de cartuchos de filtro, no se ha utilizado en estudios Edna de peces con dos excepciones ^8,15.

Aquí se proporciona un protocolo para la filtración de muestras de agua con el cartucho de filtro y extracción de Edna de su filtro sin tener que cortar y abrir la carcasa. También disponemos de dos sistemas de filtración de agua alternativos dependiendo de los volúmenes de agua (≤4 L o> 4 L). Para comparar el rendimiento del protocolo de nuevo desarrollo y un protocolo utilizado previamente utilizando un filtro de fibra de vidrio en nuestro grupo de investigación ^12,14,22,23, realizamos Edna metabarcoding análisis de agua de mar de un gran tanque de acuario (7,500 m ³ ) con la composición de las especies conocidas, y mostrar el número de especies detectadas derivados de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo se han desarrollado para metabarcoding Edna de peces, sino que también es aplicable a Edna de otros organismos.

Protocolo

NOTA: Este protocolo no aborda los métodos de toma de muestras de agua y metabarcoding. El agua puede tomarse muestras de diferentes maneras dependiendo de los propósitos del estudio ¹⁶ y vea Miya et al. ¹² para detalles de los métodos que utilizan cebadores metabarcoding MiFish. Tenga en cuenta que el agua en la muestra se debe mantener muy frío y se filtró dentro de unas pocas horas para evitar la degradación de Edna. Tenga en cuenta también que este protocolo implica el uso de un agitador rotatorio y una incubadora, y este último debe ser lo suficientemente grande para dar cabida a la primera. Además, una centrífuga que puede acomodar a ambos 15 ml y 50 ml tubos cónicos es indispensable para eliminar el líquido restante del filtro post-filtración y para recoger ADN extraído dentro del cartucho, respectivamente.

1. El procesamiento de un tapón de rosca y una bolsa de plástico de 1 L

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L.

1. Perforar un agujero a través del centro de un tornillo cap (unido a una bolsa de plástico 1 L desechable) con el mismo diámetro (4,8 mm) que el tubo que se proyecta desde un conector luer-lock macho. El uso de alicates diagonales, acortar el tubo del conector luer-lock macho a una longitud apropiada (ca. 3 mm) para evitar la obstrucción de una pequeña cantidad de agua dentro de la tapa después de la filtración.
2. Aplicar un pegamento adhesivo especializado para el polietileno (PE) y polipropileno (PP) tanto al fondo y la superficie del conector de cierre luer macho y tapón de rosca, respectivamente. Espere unos minutos para una buena unión adhesiva (consulte las instrucciones del fabricante).
3. Insertar el conector Luer macho en el orificio de la tapa roscada. Espere hasta que la unión adhesiva completa de las dos partes (generalmente> 24 h). Esterilizar el tapón de rosca con el conector luer-lock macho con 10% de lejía comercial (ca. 0.6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.
4. Haga dos agujeros en las dos esquinas inferiores de la bolsa de plástico de 1 litro con el fin de colgarlo de un mesPanel h (paso 3). Asegúrese de que el diámetro de los agujeros es mayor que el de las patas del panel de malla.

2. Montaje del sistema de filtración

1. Fije el tubo de alto vacío para el conector de entrada de una bomba de aspiración y conecte el otro extremo del tubo a un colector. Asegúrese de que los tres de color rojo camisetas válvulas del colector están en la posición "off" (es decir, horizontal).
2. El uso de un conjunto de guantes limpios, inserte un adaptador luer hembra y un conector de vacío en los extremos superior e inferior de la tubería de goma de vacío para la filtración, respectivamente.
3. adjuntar cuidadosamente el accesorio Luer hembra a un puerto de salida del cartucho de filtro y conecte el conector de vacío para un tapón de silicona.

3. La filtración de las muestras de agua (L) ≤4 utilizando el cartucho de filtro

NOTA: Omita este paso si el volumen de filtración es> 4 L. Este sistema de filtración requiere un panel autoportante de fo colgar la bolsa de plástico llena de 1 L de agua. Un panel de malla, múltiples puntas, y un soporte para el panel, todos disponibles en tiendas en línea, serían útiles para el montaje de esta unidad. Autoclave la entrada y salida tapones luer para el cartucho de filtro antes de su uso.

1. Verter el agua muestreada 1 L en la bolsa de plástico y cerrar el tapón roscado con el conector Luer macho.
2. conectar con cuidado un orificio de entrada del cartucho de filtro montado con el conector luer-lock macho de la bolsa de plástico. No apriete demasiado el conector de cierre luer; de lo contrario la unidad se escape una vez que el bombeo se inicia. Asegúrese de que todas las conexiones son seguras antes de colgar la bolsa de plástico de un panel de malla.
3. Con cuidado, colgar la bolsa de plástico con el cartucho del filtro de dos dientes en el panel de malla e insertar un tapón de silicona en un orificio de entrada del colector.
4. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, tuando su vez la camiseta roja de la válvula a la posición de apagado.
5. Repita 3.1-3.4 pasos hasta que se filtra la cantidad deseada de agua.
   NOTA: Para 1 litro de agua tomada de los arrecifes coralinos subtropicales, se tarda alrededor de tres minutos para la filtración.
6. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío.
7. Tape ambos extremos del cartucho con las tapas de entrada y salida luer.
8. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra.
9. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

4. La filtración de agua (> 4 l) Las muestras utilizando el cartucho de filtro

Nota: omitir este paso si el volumen de filtración de agua es ≤4 L. Este sistema de filtración requiere una botella libro de 10 l equipado con una válvula y una punta de pipeta desechable de 10 ml. Un diámetro interior de la punta de la pipeta 10 ml (15,0 mm) y una conicidad de la puntafinal debe ajustarse a un diámetro exterior de la la válvula (15,0 mm) y el puerto de entrada del cartucho de filtro, respectivamente. Ambas conexiones son retenidos de forma segura durante la filtración en un ajuste de fricción. Esterilizar la punta de la pipeta con un 10% de lejía comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sodio) antes de su uso.

1. Preparar una cantidad apropiada de agua muestreada en la botella libro. inserte firmemente la punta de la pipeta 10 ml en la válvula de la botella de 10 l libro.
2. Estrechamente insertar el puerto de salida del cartucho de filtro en el extremo de la punta de pipeta e insertar el tapón de silicona en el puerto de entrada del colector. Encienda el aspirador. Abrir las válvulas T rojos para la filtración. Ejecutar el colector hasta que el cartucho de filtro esté seco, luego gire la válvula en T rojo a la posición de apagado.
   NOTA: Para obtener 10 L de agua de mar tomada de los arrecifes de coral exteriores subtropicales, se tarda unos 30-40 minutos para la filtración.
3. Retirar con cuidado el cartucho de filtro de la bolsa de plástico y la conexión de vacío. Cap tantoextremos del cartucho con la entrada y salida tapones luer. Etiquetar el tapón del cartucho y Luer de entrada apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba de secado rápido y etiquetado no se corra. Guarde el cartucho de filtro a -20 ° C antes de la extracción de ADN.

5. Extracción de Edna del filtro

Nota: En los pasos 4 y 5, se utiliza un kit comercial, en gran parte siguiendo un protocolo de "sangre nucleado" proporcionado por el kit. Por simplicidad, se describe el procedimiento para el procesamiento de un cartucho individual. En la práctica, se recomienda procesamiento 8 (o el número máximo de la centrífuga) o menos filtros a la vez.

1. Precalentar una incubadora a 56 ° C.
2. Preparar un tubo de 2,0 ml por el corte de la tapa articulada del tubo. Deseche la tapa.
   NOTA: Este tubo se utiliza como un tubo de recogida para el líquido que queda en el filtro.
3. Retire la entrada (NO salida) tapón luer del cartucho de filtro e insertar el puerto de entrada into el tubo de recogida. sellar herméticamente una conexión entre el tubo del cartucho y colección usando una película de auto-sellado.
4. Inserte la unidad combinada en un adaptador de centrífuga para un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el cartucho a 5.000 xg durante 1 min para eliminar el líquido residual en el filtro.
5. Retire el tubo de extracción del cartucho de filtro y desechar el tubo. Re-cap el puerto de entrada del cartucho.
6. Preparar una mezcla de 20 l solución de proteinasa-K, 220 l de PBS (solución salina tamponada con fosfato; no proporcionado por el kit) y 200 l de tampón AL.
   NOTA: El cartucho de filtro tiene capacidad para hasta cuatro veces el volumen de la mezcla (. Ca 1,8 ml).
7. Retire la tapa de entrada y añadir la mezcla (440 l) en el cartucho de filtro usando una punta de pipeta. Insertar la pipeta completamente en el puerto de entrada de modo que la punta de la pipeta es visible en el interior del cartucho de justo por encima de la membrana.
8. Vuelva a tapar el orificio de entrada y colocar el filtro de cocheTridge en un agitador rotatorio.
9. Coloque el agitador rotatorio en la incubadora precalentado a 56 ° C y encienda el agitador a una velocidad de 20 rpm durante 20 min.
10. Durante la incubación, preparar un nuevo tubo de 2,0 ml, etiquetar el tubo de manera apropiada utilizando una pluma de solvente a prueba y colocarlo en un tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: el primero (2,0 ml) y últimos tubos (50 ml) se utilizan para la recogida del ADN extraído y para sujetar el tubo de 2,0 ml, respectivamente.
11. Después de la incubación, retirar la tapa de entrada e inserte la entrada (NO salida) del puerto del cartucho en el tubo de 2.0 ml dentro del tubo cónico de 50 ml. Cerrar el tubo cónico de 50 ml con un tapón de rosca.
12. Centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 5.000 xg durante 1 min para recoger el ADN extraído del cartucho. Retire el cartucho de filtro y el tubo de 2,0 ml usando pinzas esterilizadas y tapar el tubo. Desechar el cartucho del filtro.

6. Purificación del ADN extraído

NOTA: Edna eluir con 100 l de tampón AE en lugar de 200 l especificados en el manual del kit comercial.

1. Añadir 200 l de etanol (96-100%) para el ADN extraído en el tubo de 2,0 ml de la etapa anterior (ca. 440 l), y se mezcla a fondo por agitación.
2. Pipetear la mezcla en una columna de giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Se centrifuga a 5.000 g durante 1 min. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
3. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW1, y centrifugar durante 1 min a 5.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
4. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml, añadir 500 l de tampón AW2 y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g. Desechar el flujo continuo y el tubo de recogida.
5. Prepare un nuevo tubo de 1,5 ml (no incluidos en el kit) y la etiqueta del tubo de manera apropiada utilizando una pluma a prueba de agua para el secado rápido y etiquetado no se corra. Transferir la columna de centrifugación to el tubo de 1,5 ml.
6. Eluir el ADN mediante la adición de 100 l de tampón AE al centro de la membrana de la columna de centrifugación. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente, y luego centrifugar a 6000 xg durante 1 min.
7. Desechar la columna de centrifugación y tapar el tubo. Almacenar el ADN purificado a -20 ° C.

Resultados

Técnicamente es difícil de aislar y cuantificar solamente Edna peces de la Edna mayor extraído, ya que los cebadores MiFish coamplify la región diana de algunos vertebrados que no son peces, como las aves y los mamíferos, con productos de PCR del mismo tamaño (aprox. 170 pb ) ^12. En lugar de cuantificar los peces a Edna, realizamos MiFish metabarcoding análisis de Edna desde un tanque de acuario con la composición de especies conocidas utilizando los dos méto...

Discusión

En muchos estudios metabarcoding utilizando muestras ambientales tales como el agua y el suelo, el tratamiento post-filtración del cartucho de filtro es generalmente como sigue ^24,25: 1) de corte abierto o formación de grietas de la carcasa con herramientas de mano (cortador de tubos o pinzas); 2) la retirada del filtro del cartucho; y 3) cortar el filtro en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar para la extracción de ADN. Para evitar este tipo de varios métodos de extracción de ADN engorroso y con...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"