שימוש במחסנית סינון עבור הסינון של מי דוגמאות הפקת DNA הסביבה

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

DNA הסביבה (עדנה) בסביבות מימיות מתייחס לחומר גנטי המצוי בעמודת המים. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגימו את התועלת של עדנה לאיתור דגים מסביבות מימיים שונים, כולל בריכות ^1-3, נהרות ^4-8, נחלים ^9, ומי ים ^10-14. רוב המחקרים האלה התמקדו גילוי של יחיד או כמה פולשני ^1,4-6,8,14 ונדירים או מאוימים מינים ^3,9, בעוד מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו זיהוי סימולטני של מינים רבים בקהילות הדגים המקומי ^{7,9, 12,13,15} ו mesocosms ^11,12.

הגישה האחרונה נקראת "metabarcoding" ועדנה metabarcoding משתמש וקבוצה אחת או מספר של פריימרים PCR כדי coamplify אזור הגן על פני דגימות מגוונות טקסונומית. זה ואחריו כנת ספרייה עם אינדוקס בנוסף מתאם, ואת הספריות באינדקס מנותחות על ידי רצף מקביל תפוקה גבוההפּלַטפוֹרמָה. לאחרונה מייה et al. ¹² פיתח פריימרים PCR אוניברסלי עבור metabarcoding עדנה מן הדגים (המכונה "MiFish"). פריימרים MiFish ולמקד לאזור hypervariable של הגן המיטוכונדריה 12S rRNA (163-185 נ"ב), אשר מכיל מידע מספיק כדי לזהות דגים למשפחה, הסוג ומינים טקסונומיות למעט במבניהם כמה קשורים זה לזה. עם השימוש של פריימרים אלו metabarcoding עדנה, מייה et al. ¹² זוהה יותר מ -230 מינים ימיים סובטרופי מטנקים אקווריום עם שוניות אלמוגים והרכב מינים ליד האקווריום.

תוך אופטימיזציה של פרוטוקול metabarcoding כדי להתאים מי ים טבעי עם רמות משתנות של ריכוז עדנה מן הדגים, יש לנו לב כי פריימרים MiFish נכשלו מדי פעם כדי להגביר את אזור היעד להכנת ספרייה שלאחר מכן. אחת הסיבות סבירות יותר עבור הגברת PCR מוצלחת זה הוא חוסר הכמות מספקת של template DNA הכלול בנפחים קטנים של מים מסוננים (כלומר 1-2 L). למרות ריכוז עדנה מקבוצת טקסונומיות ספציפית הוא לידיעה לפני ההגברה, סינון של כרכי מים גדולים (> 1-2 L) תהיה דרך פשוטה ויעילה כדי לאסוף יותר עדנה מן הסביבות המימיות עם שפע דגים נדיר ביומסה, כגון מערכות אקולוגיות תחת כיפת האוקיינוס ​​במעמקי הים.

ביחס מסננים סיבים דיסק כמקובל בשימוש במספר של מחקר עדנה דגי ^16, מחסניות מסננות יש את היתרון של אדיב כרכי מים גדולים לפני סתימת ^17. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה נפח גדול (> 20 L) סינון של דגימות מי ים החוף באמצעות מחסניות מסננות ^18. בנוסף, הם בנפרד ארוזים וסטרילי, וכמה מדרגות העבודה הניסיונית יכולות להתבצע בית המסנן, ובכך להקטין את ההסתברות של זיהום מהמעבדה ^19. האחרוןתכונה חיונית עדנה metabarcoding, שבו את הסיכון לזיהום נותר בין הניסוי הגדול אתגרים ^20,21. למרות היתרונות הטכניים האלה של מחסניות מסננות, זה לא נעשה שימוש במחקרי עדנה של דגים עם שני חריגים ^8,15.

כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור סינון של דגימות מים עם מחסנית מסנן וסחיטת עדנה ממסנן שלה מבלי לחתוך את הדיור. כמו כן אנו מספקים שתי מערכות סינון מים חלופיות תלוי כרכי מים (L ≤4 או> 4 L). כדי להשוות את הביצועים של הפרוטוקול החדש שפותח ובפרוטוקול בעבר בשימוש באמצעות מסנן מזכוכית בקבוצת המחקר שלנו ^12,14,22,23, אנו מבצעים עדנה metabarcoding ניתוח של מי ים מטנק אקווריום ענק (7,500 מ ^'3 ) עם הרכב מינים, ולהראות את מספר המינים שזוהו נגזרים משני הפרוטוקולים כתוצאות נציג. h פרוטוקול זהכפי שפותחו עבור metabarcoding עדנה מן הדגים, אך גם לגבי עדנה מאורגניזמים אחרים.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה אינו עוסק מי דגימה ושיטות metabarcoding. מים אפשר יהיה לטעום באופנים שונים בהתאם למטרות המחקר ¹⁶ ותראו מייה et al. ¹² לפירוט אודות שיטות metabarcoding באמצעות פריימרים MiFish. ראוי לציין, כי המים שנדגמו צריכים להישמר מאוד קרים מסוננים בתוך כמה שעות, כדי למנוע שפלה של עדנה. כמו כן שימו לב כי פרוטוקול זה כרוך בשימוש של שייקר רוטרי באינקובטור, והאחרון חייב להיות גדול מספיק כדי להכיל את לשעבר. בנוסף, בצנטריפוגה שיכולה להכיל שני 15 מיליליטר ו 50 מ"ל צינורות חרוטים הם הכרחיים כדי להסיר את הנוזל הנותר מן מסנן סינון דואר לאסוף DNA שחולץ בתוך המחסנית, בהתאמה.

1. עיבוד ראש מתברג ושקית פלסטיק L 1

הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L.

1. לקדוח חור דרך המרכז של ג בורגap (מצורף בשקית ניילון 1 L הפנויה) עם אותו קוטר (4.8 מ"מ) כמו הצינור מקרין מתוך מחבר luer נעילת זכר. באמצעות צבת אלכסונית, לקצר את הצינור של מחבר luer נעילת הזכר לגובה בלתי הולם (ca. 3 מ"מ) כדי למנוע סתימת כמות קטנה של מים בתוך הכובע לאחר סינון.
2. החלת הדבקה מיוחדת עבור פוליאתילן (PE) ו פוליפרופילן (PP) הוא בתחתית המשטח של מחבר luer נעילת זכר בורג כובע, בהתאמה. יש להמתין מספר דקות עבור מליטת דבק טובה (עיין בהוראות היצרן).
3. הכנס את מחבר luer נעילת זכר לתוך החור של מתברג. חכה עד מליטת דבק המלאה של שני חלקים (בדרך כלל> 24 שעות). לעקר את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר עם 10% אקונומיקה מסחרי (ca. תת-כלורי נתרן 0.6%) לפני השימוש.
4. פאנץ שני חורים בשתי הפינות בתחתית שקית ניילון 1 L כדי לתלות אותו ממקור שאינו mesלוח h (שלב 3). ודאו בקוטר של החורים הוא גדול יותר מזה של השיניים בלוח הרשת.

2. אסיפה של מערכת הסינון

1. צרף צינורות ואקום גבוה למחבר הקלט של משאבת aspirator ולצרף את הקצה השני של צינורות אל סעפת. הקפד כי T-שסתום אדום שלוש הסעפת נמצא "במצב הכבוי" (כלומר, אופקי).
2. לבישת סט של כפפות נקיות, הכנס luer הנשי הולם ומחבר ואקום בקצות העליון והתחתון של צינורות גומי ואקום לסינון, בהתאמה.
3. בזהירות לצרף את luer הנקבה ההולמת ליציאת לשקע של מחסנית המסנן ולצרף למחבר ואקום פקק סיליקון.

סינון 3. דגימות מים (≤4 L) באמצעות מסנן Cartridge

הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L. זה מערכת סינון דורשת f לוח עומד עצמיאו לתלות את שקית פלסטיק ובה 1 ליטר של מים. פנל רשת, חודים מרובים, עמדו על הלוח, כולם הזמין מחנויות מקוונות, יהיו שימושיים להרכבת יחידה זו. חיטוי הכניסה ויציאה כמוס luer עבור המחסנית המסננת לפני השימוש.

1. יוצקים את המים 1 L שנדגמו לתוך שקית ניילון ולסגור את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר.
2. בזהירות לחבר יציאת כניסה של מחסנית המסנן התאספה עם מחבר luer נעילת הזכר של שקית הניילון. אל מעל להדק את מחבר luer נעילה; אחרת היחידה תדלוף פעם השאיבה מתחילה. ודא שכל החיבורים מחוברים היטב לפני שאני תולה את שקית הפלסטיק פאנל רשת.
3. בזהירות לתלות את שקית הניילון עם המחסנית המסננת משתי שיניים בלוח הרשת וכנס פקק סיליקון לתוך יציאת כניסה של הסעפת.
4. הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, tתרנגולת להפוך את t-שסתום אדום למצב כבוי.
5. חזור על 3.1-3.4 צעדים עד כמות המים הרצויה מסוננת.
   הערה: לקבלת 1 ליטר של מים שנלקחו שוניות אלמוגים סובטרופי, זה לוקח בערך שלוש דקות הסינון.
6. מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום.
7. כיסוי או בשני הקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה.
8. לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה.
9. אחסן את מחסנית המסנן ב -20 C לפני מיצוי DNA.

סינון 4. מים (> 4 L) דוגמאות באמצעות מסנן Cartridge

ההערה: דלג על שלב זה אם נפח מי הסינון הוא ≤4 ל מערכת סינון זה דורש בקבוק ספר 10 L מצויד שסתום טיפ של 10 מיליליטר פיפטה חד פעמי. בקוטר פנימי של קצה פיפטה 10 מ"ל (15.0 מ"מ) להתחדד של קצהבסוף צריך להתאים כדי בקוטר חיצוני של השסתום (15.0 מ"מ) יציאת כניסת של מחסנית מסנן, בהתאמה. חיבורי שניהם נשמרים באופן מאובטח במהלך הסינון בהתקף חיכוך. לעקר את קצה פיפטה עם 10% אקונומיקה מסחרי (חומצת נתרן בקירוב 0.6%) לפני השימוש.

1. הכן את כמות מתאימה של מים שנדגמו בבקבוק הספר. בחוזקה והכנס את קצה פיפטה 10 מ"ל לתוך השסתום של הבקבוק הספר 10 L.
2. בחוזקה להכניס את פתח היציאה של מחסנית המסנן לתוך סוף קצה פיפטה והכנס את פקק סיליקון לתוך יציאת הכניסה של הסעפת. הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, ולאחר מכן להפעיל את T-שסתום אדום למצב הכבוי.
   הערה: לקבלת 10 ליטר של מי ים שנלקח שוניות אלמוגים סובטרופי חיצוניות, זה לוקח בערך 30-40 דקות עבור הסינון.
3. מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום. שווי הואהקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה. לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה. אחסן את מחסנית המסנן ב -20 ° C לפני מיצוי DNA.

הפקת 5. עדנה מהמסננת

הערה: שלבי 4 ו -5, אנו משתמשים ערכה מסחרית, בעקבות פרוטוקול במידה רב "דם בעלי הגרעין" שמספק ערכה. לשם פשטות, אנו מתארים את ההליך לעיבוד מחסנית פרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 8 (או את המספר המרבי של צנטריפוגות) או מסננים פחות בכל פעם.

1. מחממים באינקובטור ל -56 מעלות צלזיוס.
2. להכין צינור 2.0 מ"ל על ידי חיתוך כובע צירים מהצינור. מחק את הכובע.
   הערה: צינור זה משמש צינור איסוף עבור הנוזל הנותר במסנן.
3. הסר את הכניסה (לא מוצא) luer כובע ממחסנית המסנן והכנס את i יציאת כניסהn כדי צינור האיסוף. בחוזקה לאטום חיבור בין צינור המחסנית ואיסוף באמצעות סרט עצמי איטום.
4. הכנס את יחידת בשילוב למתאם צנטריפוגות במשך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה מחסנית ב 5000 XG דקות 1 כדי להסיר את הנוזל הנותר במסנן.
5. הסר את צינור איסוף ממחסנית מסנן וזורקים הצינור. Re-כובע נמל המפרצון של המחסנית.
6. הכינו תערובת של 20 μl פתרון proteinase-K, 220 μl PBS (פוספט בופר; לא מסופק על ידי בערכה) ו -200 μl חיץ AL.
   הערה: המחסנית המסננת להכיל עד פי ארבעה כרכים של התערובת (. Ca 1.8 מיליליטר).
7. הסר את הפקק ולהוסיף את התערובת (440 μl) לתוך המחסנית מסנן באמצעות קצה פיפטה. הכנס פיפטה לחלוטין ליציאת הכניסה כך קצה פיפטה גלוי בתוך המחסנית בדיוק מעל הממברנה.
8. Re-כובע יציאת הכניסה ולמקם את המכונית המסננתtridge על שייקר רוטרי.
9. מניחים את שייקר רוטרי בחממה שחומם מראש ב 56 C ולהדליק את שייקר במהירות של 20 סל"ד במשך 20 דקות.
10. במהלך הדגירה, להכין צינור 2.0 מ"ל חדש, תווית הצינור כראוי באמצעות עט ממס הוכחה ולמקם אותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: לשעבר (2.0 מ"ל) וצינורות האחרון (50 מ"ל) משמשים לאיסוף DNA המחולץ ועבור החזקת הצינור 2.0 מ"ל, בהתאמה.
11. לאחר הדגירה, להסיר את הפקק והכנס את הכניסה (לא לשקע) יציאה של המחסנית לתוך צינור 2.0 מיליליטר בתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. סגור את צינור חרוטי 50 מ"ל עם ראש מתברג.
12. צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 5000 XG במשך 1 דקות כדי לאסוף את ה- DNA חילוץ מהמחסנית. הוצא את המחסנית המסננת ואת צינור 2.0 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים מכסה את הצינור. מחק את מחסנית המסנן.

טיהור 6. של ה- DNA החילוץ

הערה: אנו elute עדנה עם 100 μl חיץ AE במקום 200 μl שצוין במדריך של הערכה המסחרית.

1. הוסף 200 μl אתנול (96-100%) ל- DNA חילוץ בצינור 2.0 מ"ל מהשלב לעיל (בערך 440 μl), ומערבבים היטב על ידי vortexing.
2. Pipet את התערובת לתוך עמוד ספין להציב צינור איסוף 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 5000 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
3. מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, ולהוסיף 500 μl חיץ AW1, צנטריפוגות דקות 1 ב 5000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
4. מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, להוסיף AW2 חיץ 500 μl, ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 20,000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
5. הכין צינור 1.5 מיליליטר חדש (בתנאי שלא על ידי בערכה) ואת התווית הצינור כראוי באמצעות עט עמיד למים עבור ייבוש מהיר ולא מורח תיוג. מעבירים את t טור ספיןo הצינור 1.5 מ"ל.
6. Elute את ה- DNA על ידי הוספת 100 חיץ μl AE למרכז הממברנה טור ספין. דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 6000 XG דקות 1.
7. מחק את טור הספין מכסה את הצינור. אחסן את ה- DNA מטוהרים ב -20 ° C.

תוצאות

מבחינה טכנית, קשה לבודד ולכמת עדנה דגים רק מן עדנה בתפזורת חילוץ, משום פריימרים MiFish coamplify באזור היעד מכמה חוליות שאינם דגים, כגון עופות ויונקים, עם מוצרי ה- PCR של באותו גודל (ca. 170 נ"ב ^12). במקום לכימות דגי עדנה, אנו מבצעים MiFish metabarcoding ניתוח של ...

Discussion

במחקרים רבים metabarcoding באמצעות דגימות סביבתיות כגון מים ואדמה, טיפול סינון לתפקיד מחסנית המסנן הוא בדרך כלל כדלקמן ^24,25: 1) חיתוך פתוח או פיצוח דיור עם כלי יד (חותך צינורות או צבת); 2) הסרת המסנן מהמחסנית; ו -3) חיתוך המסנן לחתיכות קטנות עם סכין גילוח להפקת DNA. כדי להימנע ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"