L'utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Riepilogo

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduzione

DNA ambientale (Edna) in ambienti acquatici si riferisce a materiale genetico trovato nella colonna d'acqua. Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di Edna per la rilevazione di pesci da vari ambienti acquatici, tra stagni, fiumi ^{1-3 4-8,} torrenti ^9, e l'acqua di mare ^10-14. La maggior parte di questi studi si sono concentrati sulla individuazione di un unico o pochi invasivo ^1,4-6,8,14 e rare o minacciate specie di ^3,9, mentre alcuni studi recenti hanno tentato il rilevamento simultaneo di più specie in comunità ittiche locali ^{7,9, 12,13,15} e mesocosmi ^11,12.

Quest'ultimo approccio è chiamato "metabarcoding" e Edna metabarcoding utilizza uno o più set di primer PCR per coamplify una regione del gene attraverso campioni tassonomicamente diversi. Questo è seguito da preparazione biblioteca indicizzazione e aggiunta adattatore, e le librerie indicizzati sono analizzate per un high-throughput sequenziamento parallelopiattaforma. Recentemente Miya et al. ¹² hanno sviluppato universali primer PCR per metabarcoding Edna dai pesci (chiamati "MiFish"). I primer MiFish bersaglio una regione ipervariabile della mitocondriale 12S rRNA gene (163-185 bp), che contiene informazioni sufficienti per identificare i pesci alla famiglia tassonomica, genere e specie ad eccezione di alcuni congeneri strettamente correlati. Con l'uso di questi primer a Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² rilevati più di 230 specie marine subtropicali da acquari con noti composizione delle specie e barriere coralline vicino l'acquario.

Mentre l'ottimizzazione del protocollo metabarcoding per accogliere l'acqua di mare naturale, con livelli di concentrazione Edna dai pesci varia, abbiamo notato che i primer MiFish di tanto in tanto non è riuscito a amplificare la regione di destinazione per la successiva preparazione biblioteca. Uno dei motivi più probabili per questo l'amplificazione PCR infruttuoso è la mancanza di adeguate quantità di Template DNA contenuto in piccoli volumi di acqua filtrata (cioè 1-2 L). Anche se la concentrazione Edna da uno specifico gruppo tassonomico è inconoscibile prima l'amplificazione, la filtrazione di grandi volumi d'acqua (> 1-2 L) sarebbe un mezzo semplice ed efficace per raccogliere più Edna dagli ambienti acquatici con scarsa abbondanza di pesce e la biomassa, come ad esempio open-mare e in acque profonde ecosistemi.

Rispetto al filtri in fibra disco convenzionalmente utilizzato in un certo numero di ricerca pesci Edna ^16, cartucce filtranti hanno il vantaggio di ospitare volumi idrici grandi prima intasamento ^17. In realtà, un recente studio ha dimostrato grande volume (> 20 L) filtrazione di campioni di acqua di mare costiere che utilizzano cartucce filtranti ^18. Inoltre, essi sono confezionati singolarmente e sterile, e diversi passaggi del flusso di lavoro sperimentale possono essere eseguite nell'alloggiamento del filtro, riducendo così la probabilità di contaminazione da laboratorio ^19. L'ultimocaratteristica è fondamentale per Edna metabarcoding, in cui il rischio di contaminazione rimane tra le più grandi sfide sperimentale ^20,21. Nonostante questi vantaggi tecnici di cartucce filtranti, non è stato utilizzato in studi Edna di pesci con due eccezioni ^8,15.

Qui forniamo un protocollo per la filtrazione dei campioni di acqua con la cartuccia del filtro e l'estrazione di Edna dal filtro senza dover tagliare aprire l'alloggiamento. Forniamo anche due sistemi di filtrazione dell'acqua alternativi a seconda dei volumi d'acqua (≤4 L o> 4 L). Per confrontare le prestazioni del protocollo di nuova concezione e un protocollo precedentemente utilizzato utilizzando un filtro in fibra di vetro nel nostro gruppo di ricerca ^12,14,22,23, eseguiamo Edna metabarcoding analisi di acqua di mare da un serbatoio acquario enorme (7.500 m ³ ) con nota composizione delle specie, e visualizza il numero di specie rilevate derivati ​​dai due protocolli come risultati rappresentativi. Questo protocollo hcome stato sviluppato per la metabarcoding Edna dai pesci, ma è anche applicabile ad Edna da altri organismi.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo non si occupa di metodi di campionamento e di acqua metabarcoding. L'acqua può essere campionato in modi diversi a seconda fini di studio ¹⁶ e vedere Miya et al. ¹² per i dettagli sui metodi metabarcoding utilizzando primer MiFish. Si noti che l'acqua campione deve essere mantenuto molto freddo e filtrato entro poche ore per evitare la degradazione di Edna. Si noti inoltre che questo protocollo prevede l'utilizzo di un agitatore rotativo e un incubatore, e quest'ultimo deve essere sufficientemente grande per accogliere il primo. Inoltre, una centrifuga che può ospitare anche 15 ml e 50 ml provette coniche è indispensabile per rimuovere il liquido residuo dal filtro post-filtrazione e raccogliere DNA estratto all'interno della cartuccia, rispettivamente.

1. Elaborazione di un tappo a vite e di un sacchetto di plastica L 1

NOTA: Saltare questo punto se il volume di filtrazione è> 4 L.

1. Praticare un foro attraverso il centro di una vite cap (attaccato ad un sacchetto di plastica 1 L getta) con lo stesso diametro (4,8 mm) come il tubo sporgente da un connettore luer lock maschio. Utilizzando pinze diagonali, accorciare il tubo del connettore luer lock maschio per una lunghezza appropriata (ca. 3 mm) per evitare l'intasamento di una piccola quantità di acqua all'interno del tappo dopo filtrazione.
2. Applicare una colla adesiva specializzata per il polietilene (PE) e polipropilene (PP) sia al fondo e la superficie del connettore luer lock maschio e tappo a vite, rispettivamente. Attendere qualche minuto per una buona tecnica di incollaggio (consultare le istruzioni del produttore).
3. Inserire il connettore luer lock maschio nel foro del tappo a vite. Attendere fino a completa incollaggio delle due parti (di solito> 24 ore). Sterilizzare il tappo a vite con il connettore luer lock maschio con il 10% di candeggina commerciale (ca. 0,6% di sodio ipoclorito) prima dell'uso.
4. Punzone due fori ai due angoli inferiori del sacchetto di plastica 1 L per appendere da un mesPannello h (fase 3). Assicurarsi che il diametro dei fori è maggiore di quella dei rebbi sul pannello mesh.

2. Montaggio del sistema di filtrazione

1. Attaccare alta tubo vuoto al connettore di ingresso di una pompa di aspirazione e collegare l'altra estremità del tubo ad un collettore. Assicurarsi che i tre rossi t-valvole del collettore sono in posizione "off" (cioè orizzontale).
2. Indossare un set pulito di guanti, inserire un luer raccordo femmina e un connettore vuoto alle estremità superiore e inferiore del tubo di gomma a vuoto per filtrazione, rispettivamente.
3. Fissare accuratamente raccordo luer femmina a una luce di uscita della cartuccia del filtro e collegare il connettore vuoto per un tappo di silicone.

3. Filtrazione di campioni d'acqua (≤4 L) utilizza la cartuccia filtro

NOTA: Saltare questo punto se il volume di filtrazione è> 4 L. Questo sistema di filtrazione richiede un pannello autoportante Fo appendere il sacchetto di plastica riempito con 1 L di acqua. Un pannello a maglie, più poli, e uno stand per il pannello, tutti disponibili da negozi online, sarebbe utile per l'assemblaggio di questa unità. Autoclave entrata e uscita tappi luer per la cartuccia del filtro prima dell'uso.

1. Versare l'acqua campionata 1 L nel sacchetto di plastica e chiudere il tappo a vite con il connettore luer lock maschio.
2. collegare cautela una luce di ingresso della cartuccia filtrante assemblato con il connettore luer lock maschio del sacchetto di plastica. Non stringere eccessivamente il connettore luer-lock; altrimenti l'unità colerà volta il pompaggio inizia. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano sicuri prima di appendere il sacchetto di plastica da un pannello a rete.
3. appendere cautela il sacchetto di plastica con la cartuccia filtrante da due rebbi sul pannello di rete e inserire un tappo di silicone in una porta di ingresso del collettore.
4. Accendere l'aspiratore. Aprire le t-valvole rosse per la filtrazione. Eseguire il collettore finché la cartuccia del filtro è asciutto, tgallina girare la t-valvola rossa in posizione off.
5. Ripetere 3,1-3,4 passi fino a quando è filtrata la quantità desiderata di acqua.
   NOTA: per 1 L di acqua prelevata dalle barriere coralline subtropicali, ci vogliono circa tre minuti per la filtrazione.
6. Rimuovere con cautela la cartuccia del filtro dal sacchetto di plastica e il connettore del vuoto.
7. Cap entrambe le estremità della cartuccia con i tappi luer ingresso e di uscita.
8. Etichettare il tappo della cartuccia e luer ingresso appropriato utilizzando una penna a prova di solvente per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso.
9. Conservare la cartuccia del filtro a -20 C prima estrazione del DNA.

4. filtrazione di acqua (> 4 L) I campioni utilizza la cartuccia filtro

Nota: Ignorare questo passaggio se il volume di filtrazione dell'acqua è ≤4 L. Questo sistema di filtrazione richiede una bottiglia libro 10 L dotato di una valvola e un usa e getta punta da 10 ml pipetta. Un diametro interno di 10 ml pipetta punta (15,0 mm) e conicità della puntaend dovrebbe adattarsi ad un diametro esterno della valvola (15,0 mm) e la porta di ingresso della cartuccia filtrante, rispettivamente. Entrambi i collegamenti vengono mantenuti in modo sicuro durante la filtrazione in un impeto di attrito. Sterilizzare la punta della pipetta con candeggina commerciale del 10% (circa 0,6% di ipoclorito di sodio) prima dell'uso.

1. Preparare una quantità adeguata di acqua campionata in bottiglia libro. Inserire saldamente la punta della pipetta 10 ml nella valvola di 10 L bottiglia libro.
2. inserire strettamente la luce di uscita della cartuccia filtrante nell'estremità punta della pipetta e inserire il tappo di silicone nella porta di ingresso del collettore. Accendere l'aspiratore. Aprire le t-valvole rosse per la filtrazione. Eseguire il collettore fino a quando la cartuccia del filtro è asciutto, quindi ruotare la t-valvola rossa in posizione off.
   NOTA: per 10 L di acqua di mare prelevata dalla subtropicali barriere coralline esterne, ci vogliono circa 30-40 minuti per la filtrazione.
3. Rimuovere con cautela la cartuccia del filtro dal sacchetto di plastica e il connettore del vuoto. Cap entrambiestremità della cartuccia con i tappi luer ingresso e di uscita. Etichettare il tappo della cartuccia e luer ingresso appropriato utilizzando una penna a prova di solvente per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso. Conservare la cartuccia del filtro a -20 ° C prima dell'estrazione del DNA.

5. Estrazione di Edna dal filtro

NOTA: in punti 4 e 5, si usa un kit commerciale, in gran parte a seguito di un protocollo per "sangue nucleate" fornito dal kit. Per semplicità, si descrive la procedura per l'elaborazione di una cartuccia singola. In pratica, si consiglia di elaborazione 8 (o il numero massimo della centrifuga) o meno filtri alla volta.

1. Preriscaldare un incubatore a 56 ° C.
2. Preparare una provetta 2,0 ml tagliando il tappo incernierato dal tubo. Eliminare il tappo.
   NOTA: Questo tubo viene utilizzato come un tubo di raccolta per il liquido rimasto nel filtro.
3. Rimuovere l'ingresso (NOT uscita) tappo luer dalla cartuccia del filtro e inserirlo il foro di entratanto il tubo di raccolta. Strettamente sigillare un collegamento tra il tubo della cartuccia e la raccolta utilizzando una pellicola autosigillante.
4. Inserire l'unità combinata in un adattatore per centrifugare per un tubo da 15 ml. Centrifugare la cartuccia a 5.000 xg per 1 min per rimuovere il liquido rimanente nel filtro.
5. Rimuovere il tubo di raccolta dalla cartuccia del filtro e gettare il tubo. Re-cap porta di ingresso della cartuccia.
6. Preparare una miscela di 20 ml soluzione di proteinasi-K, 220 ml di PBS (tampone fosfato salino, non fornito dal kit) e 200 microlitri di buffer AL.
   NOTA: La cartuccia del filtro può ospitare fino a quattro volte i volumi della miscela (. Circa 1,8 ml).
7. Togliere il tappo di ingresso e aggiungere la miscela (440 ml) nella cartuccia filtro con un puntale. Inserire la pipetta completamente nella porta di ingresso in modo che la punta della pipetta è visibile all'interno della cartuccia appena sopra la membrana.
8. Re-cap porta di ingresso e posizionare la macchina del filtrocartuccia in un agitatore rotativo.
9. Posizionare rotativo nell'incubatrice preriscaldato a 56 ˚C e accendere l'agitatore ad una velocità di 20 rpm per 20 min.
10. Durante l'incubazione, preparare un nuovo tubo di 2,0 ml, etichettare il tubo in modo appropriato con una penna resistente ai solventi e metterlo in un tubo conico da 50 ml.
    NOTA: I primi (2,0 ml) e quest'ultimo tubi (50 ml) vengono utilizzati per la raccolta del DNA estratto e per trattenere il tubo 2,0 ml, rispettivamente.
11. Dopo l'incubazione, rimuovere il tappo di ingresso e inserire l'ingresso (NOT uscita) porta della cartuccia nel tubo 2,0 ml nel tubo conico 50 ml. Chiudere il tubo conico da 50 ml con tappo a vite.
12. Centrifugare la provetta conica da 50 ml a 5.000 xg per 1 min per raccogliere il DNA estratto dalla cartuccia. Rimuovere la cartuccia del filtro e il tubo di 2,0 ml con pinze sterili e tappare la provetta. Eliminare la cartuccia del filtro.

6. La purificazione del DNA estratto

NOTA: eluire Edna con 100 microlitri di buffer AE invece di 200 microlitri specificati nel manuale del kit commerciale.

1. Aggiungere 200 ml di etanolo (96-100%) per il DNA estratto nel tubo da 2,0 ml dal gradino sopra (circa 440 ml), e mescolare bene nel vortex.
2. Preparare la miscela in una colonna di spin collocato in un tubo di raccolta da 2 ml. Centrifugare a 5.000 g per 1 min. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
3. Porre la colonna di spin in una nuova 2 ml tubo di raccolta, aggiungere 500 microlitri tampone AW1, e centrifugare per 1 min a 5.000 x g. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
4. Porre la colonna di spin in una nuova 2 ml tubo di raccolta, aggiungere 500 microlitri tampone AW2, e centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. Gettare il flow-through e il tubo di raccolta.
5. Preparare una nuova provetta da 1,5 ml (non fornito dal kit) ed etichettare il tubo in modo appropriato con una penna impermeabile per asciugatura rapida ed etichettatura, non grasso. Trasferire la colonna di spin to il tubo di 1,5 ml.
6. Eluire il DNA aggiungendo 100 microlitri tampone AE al centro della membrana Spin Column. Incubare per 1 min a temperatura ambiente, quindi si centrifuga a 6000 xg per 1 min.
7. Eliminare la colonna di spin e tappare la provetta. Conservare il DNA purificato a -20 ° C.

Risultati

È tecnicamente difficile isolare e quantificare solo Edna pesce dal Edna massa estratta, perché i primer MiFish coamplify la regione di destinazione da parte di alcuni vertebrati non-pesce, come uccelli e mammiferi, con prodotti di PCR della stessa dimensione (ca. 170 bp ) ^12. Invece di quantificare pesce Edna, eseguiamo MiFish metabarcoding analisi di Edna da un serbatoio acquario con nota la composizione delle specie utilizzando i due diversi metodi di filtraggio ...

Discussione

In molti studi metabarcoding utilizzando campioni ambientali come l'acqua e il suolo, il trattamento post-filtrazione della cartuccia filtrante è generalmente come segue ^24,25: 1) taglio aperto e screpolature della custodia con utensili manuali (taglio per tubi o pinze); 2) la rimozione del filtro dalla cartuccia; e 3) taglio del filtro in piccoli pezzi con una lametta per l'estrazione del DNA. Per evitare tali diversi metodi di estrazione del DNA ingombrante e richiede tempo procedure che sono sogge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"