O uso de um cartucho de filtro para Amostras de filtração de água e extração de DNA Ambiental

Resumo

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Resumo

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introdução

DNA Ambiental (Edna) em ambientes aquáticos refere-se a material genético encontrado na coluna de água. Estudos recentes demonstraram a utilidade de Edna para a detecção de peixes de vários ambientes aquáticos, incluindo lagoas ^{1-3, 4-8} rios, córregos ^9, e água do mar ^10-14. A maioria destes estudos focados em detecção de um único ou poucos invasiva ^1,4-6,8,14 e raras ou ameaçadas espécies de ^3,9, enquanto alguns estudos recentes tentativa de detecção simultânea de múltiplas espécies em comunidades de peixes locais ^{7,9, 12,13,15} e mesocosmos ^11,12.

A última abordagem é chamada de "metabarcoding" e Edna metabarcoding utiliza um ou vários conjuntos de primers de PCR para coamplify uma região do gene através de amostras taxonomicamente diversas. Isto é seguido por uma preparação da biblioteca com indexação e adição do adaptador, e as bibliotecas indexados são analisados ​​por uma sequenciação de alto rendimento paraleloplataforma. Recentemente Miya et al. ¹² desenvolveram iniciadores de PCR universais para metabarcoding Edna de peixes (chamados "MiFish"). Os primers MiFish alvo uma região hipervariável do gene 12S rRNA mitocondrial (163-185 pb), que contém informações suficientes para identificar os peixes a família taxonômica, gênero e espécie, exceto para alguns dos congéneres estreitamente relacionadas. Com o uso desses iniciadores em Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² detectou mais de 230 espécies marinhas subtropicais de aquários com conhecidos de composição de espécies e os recifes de coral perto do aquário.

Além de otimizar o protocolo metabarcoding para acomodar a água do mar natural, com diferentes níveis de concentração de Edna de peixes, temos notado que os primers MiFish ocasionalmente falhou para amplificar a região alvo para a preparação da biblioteca subsequente. Uma das razões mais prováveis ​​para esta amplificação PCR vencida é a falta de quantidades adequadas de teADN mplate contida em pequenos volumes de água filtrada (isto é, 1-2 G). Embora a concentração Edna de um grupo taxonômico específico é desconhecido antes da amplificação, filtragem de grandes volumes de água (> 1-2 L) seria um meio simples e eficaz para recolher mais Edna dos ambientes aquáticos com abundância de peixes raros e de biomassa, tal como -mar aberto e de profundidade ecossistemas.

Em relação a filtros de fibra de disco convencionalmente utilizados em uma série de pesquisas EdNA peixe ^16, os cartuchos de filtro têm a vantagem de acomodar maiores volumes de água antes de entupimento ^17. Na verdade, um estudo recente mostrou grande volume (> 20 L) filtração de amostras de água do mar costeiras usando cartuchos de filtro ^18. Além disso, eles são embalados individualmente e estéril, e vários passos do fluxo de trabalho experimental pode ser realizada no invólucro do filtro, reduzindo assim a probabilidade de contaminação a partir do laboratório de ^19. O últimoO recurso é fundamental para Edna metabarcoding, em que o risco de contaminação permanece entre os maiores experimental desafia ^20,21. Apesar destas vantagens técnicas de cartuchos de filtro, que não tem sido usado em estudos EdNA de peixes com duas excepções ^8,15.

Aqui nós fornecemos um protocolo para a filtração de amostras de água com o cartucho de filtro e a extracção de EdNA a partir do seu filtro sem ter que cortar abrir o invólucro. Nós também fornecemos dois sistemas de filtração de água alternativas, dependendo dos volumes de água (≤4 L ou> 4 L). Para comparar o desempenho do protocolo recém-desenvolvido e um protocolo previamente utilizados através de um filtro de fibra de vidro em nosso grupo de pesquisa ^12,14,22,23, eu executo Edna metabarcoding análise da água do mar a partir de um tanque do aquário enorme (7.500 m ³ ) com a composição de espécies conhecidas, e mostrar o número de espécies detectadas derivados dos dois protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo foi desenvolvido para metabarcoding EdNA de peixes, mas também é aplicável a EdNA de outros organismos.

Protocolo

NOTA: Este protocolo não lidar com métodos de amostragem de água e metabarcoding. A água pode ser colhidas amostras de diferentes maneiras, dependendo fins de estudo ¹⁶ e veja Miya et al. ¹² para detalhes dos métodos metabarcoding usando primers MiFish. Note-se que a água amostra deve ser mantido muito frio e filtrou-se dentro de algumas horas para evitar a degradação de EdNA. Observe também que este protocolo envolve o uso de um agitador rotativo e uma incubadora, e este último deve ser grande o suficiente para acomodar o ex. Além disso, uma centrifugadora que pode acomodar-se a 15 ml e 50 ml de tubos cónicos é indispensável para remover o líquido remanescente no filtro e pós-filtragem para recolher DNA extraído no interior do cartucho, respectivamente.

1. O processamento de uma tampa de rosca e um L saco de plástico 1

NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é> 4 L.

1. Perfurar um furo através do centro de um parafuso cAP (ligado a um saco de plástico descartável de 1 L) com o mesmo diâmetro (4,8 mm) como o tubo que se projecta a partir de um conector luer macho. Usando alicates diagonais, encurtar o tubo do conector luer macho de um comprimento apropriado (ca. 3 mm), para evitar o entupimento de uma pequena quantidade de água no interior da tampa depois de filtração.
2. Aplicar uma cola adesiva especializada para o polietileno (PE) e polipropileno (PP) para que o fundo e a superfície do conector luer macho e tampa de rosca, respectivamente. Aguarde alguns minutos para uma boa união adesiva (consulte as instruções do fabricante).
3. Insira o conector luer macho no buraco da tampa de rosca. Aguardar até que a ligação adesiva completa das duas partes (normalmente> 24 hr). Esterilizar a tampa de rosca com o conector macho luer com 10% de lixívia comercial (ca. 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso.
4. Perfurar dois buracos nos dois cantos inferiores do saco de plástico 1 L, de modo a pendurar-lo de um mesh painel (passo 3). Certifique-se de que o diâmetro dos furos é maior do que o das pontas sobre o painel de malha.

2. Montagem do Sistema de Filtração

1. Prenda o tubo de vácuo elevado para o conector de entrada de uma bomba de aspiração e fixar a outra extremidade do tubo a um colector. Certifique-se de que os três t-válvulas vermelhas do colector estão na "posição de desligado" (ou seja, horizontal).
2. Vestindo um jogo limpo de luvas, inserir um luer fêmea montagem e um conector de vácuo nas extremidades superior e inferior do tubo de borracha de vácuo para filtração, respectivamente.
3. Cuidadosamente anexar o luer fêmea encaixe para um orifício de saída do cartucho de filtro e montar o conector de vácuo para uma rolha de silicone.

3. Filtração de amostras de água (≤4 L), utilizando o cartucho de filtro

NOTA: Ignore esta etapa se o volume de filtração é> 4 L. Este sistema de filtragem requer uma auto-pé painel fou pendurar o saco de plástico cheio com 1 L de água. Um painel de malha, vários dentes, e um suporte para o painel, todos disponíveis a partir de lojas on-line, seria útil para a montagem desta unidade. Autoclave a entrada e saída tampas luer do cartucho do filtro antes do uso.

1. Despeje a 1 L de água recolhidos num saco de plástico e feche a tampa de rosca com o conector luer macho.
2. Cuidadosamente ligar um orifício de entrada do cartucho de filtro montado com o conector luer macho do saco de plástico. Não aperte o conector luer-lock; caso contrário, a unidade vai vazar uma vez que o bombeamento começa. Certifique-se de que todas as ligações estão seguras antes de pendurar o saco de plástico a partir de um painel de malha.
3. pendurar cuidadosamente o saco de plástico com o cartucho de filtro a partir de dois pinos no painel de malha e inserir uma rolha de silicone a uma porta de entrada do colector.
4. Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Executar o colector até que o cartucho de filtro é seco, then transformar o t-válvula vermelha para a posição desligado.
5. Repetir 3.1-3.4 passos até que a quantidade desejada de água é filtrada.
   NOTA: Para 1 L de água retirado dos recifes de coral subtropicais, leva cerca de três minutos para a filtração.
6. Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo.
7. Tapar ambas as extremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer.
8. Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas.
9. Armazenar o cartucho do filtro a -20 ° C antes da extração de DNA.

4. Filtração de água (> 4 L) amostras utilizando o cartucho de filtro

Nota: Ignore esta etapa se o volume de filtração de água é ≤4 L. Este sistema de filtragem requer uma garrafa livro 10 L equipado com uma válvula e uma ponta de pipeta de 10 ml descartável. Um diâmetro interno de 10 ml a ponta da pipeta (15,0 mm) e uma conicidade da pontafinal deve caber a um diâmetro externo da válvula (15,0 mm) e a porta de entrada do cartucho do filtro, respectivamente. Ambas as ligações são firmemente retidas durante a filtração num encaixe por atrito. Esterilizar a ponta da pipeta com lixívia comercial a 10% (cerca de 0,6% de hipoclorito de sódio) antes do uso.

1. Prepara-se uma quantidade apropriada de água amostrada na garrafa livro. Firmemente inserir o 10 ml ponta da pipeta na válvula de 10 L garrafa livro.
2. Inserir firmemente a porta de saída do cartucho de filtro na extremidade da ponta da pipeta e inserir a rolha de silicone para o orifício de entrada do colector. Ligue o aspirador. Abra as t-válvulas vermelhas para filtração. Execute o colector até que o cartucho de filtro é seca, em seguida, vire o t-válvula vermelha para a posição desligado.
   NOTA: Para 10 L de água do mar tomado a partir dos recifes de coral subtropicais exteriores, que leva cerca de 30-40 min para a filtração.
3. Remova cuidadosamente o cartucho do filtro do saco de plástico e o conector de vácuo. Cap tantoextremidades do cartucho com as tampas de entrada e de saída luer. Rotular a tampa do cartucho e luer de entrada adequadamente usando uma caneta de solvente-prova para secagem rápida e rotulagem não-manchas. Armazenar o cartucho de filtro a -20 ° C antes da extracção do ADN.

5. Extração de Edna do Filtro

NOTA: Nos passos 4 e 5, usamos um kit comercial, em grande parte, na sequência de um protocolo para "sangue nucleada" fornecido pelo kit. Para simplificar, descreve-se o procedimento para o processamento de um cartucho individual. Na prática, recomenda-processamento 8 (ou o número máximo de centrífuga) ou menos filtros de cada vez.

1. Pré-aqueça uma incubadora a 56 ° C.
2. Preparar um tubo de 2,0 ml por corte da tampa articulada do tubo. Elimine a tampa.
   NOTA: Este tubo é usado como tubo de recolha para o líquido remanescente no filtro.
3. Remova a entrada (NÃO saída) tampa luer do cartucho do filtro e inserir o i porta de entradanto do tubo de coleta. Firmemente selar um tubo de ligação entre o cartucho e a recolha utilização de uma película de auto-selagem.
4. Insira a unidade combinados em um adaptador de centrífuga para um tubo cônico de 15 ml. Centrifuga-se o cartucho em 5000 xg durante 1 min para remover o líquido remanescente no filtro.
5. Remover o tubo de recolha do cartucho de filtro e rejeitar o tubo. Re-tampa da abertura de entrada do cartucho.
6. Prepara-se uma mistura de 20 ul de solução de proteinase-K, 220 ul de PBS (salino tamponado com fosfato; não fornecida pelo kit) e 200 ul de tampão de AL.
   NOTA: O cartucho do filtro acomoda até quatro vezes os volumes de mistura (. Ca 1,8 ml).
7. Retire a tampa de entrada e adicione a mistura (440 mL) para dentro do cartucho do filtro utilizando uma ponta de pipeta. Inserir a pipeta completamente para dentro da abertura de entrada de modo a que a ponta da pipeta é visível no interior do cartucho imediatamente acima da membrana.
8. Re-tampa da abertura de entrada e posicionar o carro filtroTridge num agitador rotativo.
9. Coloque o agitador rotativo na incubadora pré-aquecido a 56 ° C e ligar o agitador a uma velocidade de 20 rpm durante 20 min.
10. Durante a incubação, preparar um novo tubo de 2,0 ml, rotular o tubo adequadamente usando uma caneta de solvente-prova e colocá-lo em um tubo cônico de 50 ml.
    NOTA: Os primeiros (2,0 ml) e últimos tubos (50 ml) são utilizados para a recolha do ADN extraído e para segurar o tubo de 2,0 ml, respectivamente.
11. Após a incubação, remover a tampa de entrada e inserir a entrada (NÃO saída) da porta do cartucho dentro do tubo de 2,0 ml dentro do tubo de 50 ml. Fechar o tubo cónico de 50 ml com uma tampa de rosca.
12. Centrifuga-se o tubo cónico de 50 ml a 5000 xg durante 1 min para recolher o ADN extraído a partir do cartucho. Remova o cartucho do filtro e do tubo de 2,0 ml usando uma pinça esterilizados e tampa do tubo. Descarte o cartucho do filtro.

6. Purificação de DNA extraído

NOTA: Nós eluir Edna com 100 ul de tampão AE em vez de 200 ul especificadas no manual do kit comercial.

1. Adicionar 200 uL de etanol (96-100%) para o DNA extraído no tubo de 2,0 ml a partir do passo acima (ca. 440 uL), e homogeneizar por agitação em vórtex.
2. Pipetar a mistura numa coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar a 5.000 xg durante 1 min. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
3. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar 500 ul de tampão de AW1, e centrifugação durante 1 min a 5000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
4. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, adicionar AW2 tampão de 500 ul, e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha.
5. Prepare um novo tubo de 1,5 ml (não fornecido no kit) e rotular o tubo adequadamente usando uma caneta à prova d'água para a secagem rápida e não-manchando rotulagem. Transferir a coluna de centrifugação tO tubo de 1,5 ml.
6. Elui-se o ADN por adição de 100 ul de tampão AE para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Incubar durante 1 min à temperatura ambiente, e depois centrifugar a 6000 xg durante 1 min.
7. Descartar a coluna de rotação e tampa do tubo. Armazenar o ADN purificado a -20 ° C.

Resultados

É tecnicamente difícil isolar e quantificar única Edna peixe da Edna volume extraído, porque os primers MiFish coamplify região alvo de alguns vertebrados não-peixes, tais como aves e mamíferos, com produtos de PCR do mesmo tamanho (ca. 170 pb ) ^12. Em vez de quantificar peixes Edna, realizamos MiFish metabarcoding análise de Edna de um tanque do aquário com composição de espécies conhecidas usando dois métodos diferentes de filtração e extracção do A...

Discussão

Em muitos estudos metabarcoding utilizando amostras ambientais, tais como a água eo solo, tratamento pós-filtração do cartucho de filtro é geralmente da seguinte forma ^24,25: 1) o corte aberto ou fissuras da caixa com ferramentas manuais (cortador de tubos ou um alicate); 2) remoção do filtro a partir do cartucho; e 3) o filtro de corte em pedaços pequenos com uma lâmina de barbear para a extracção do ADN. Para evitar tais pesado e procedimentos que são propensas à contaminação no laboratório ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10 ml pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10 L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"