JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول لتطبيق التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)، 3-الأبعاد جزيء واحد توطين طريقة سوبر قرار المجهر، لتصوير الهيكل الخلوي الأكتين في خلايا الثدييات ملتصقة. هذا النهج يسمح التصور القائم خفيفة من الميزات الهيكلية النانوية التي من شأنها أن تبقى على خلاف ذلك دون حل نتيجة التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود.

Abstract

مضان المجهر يمكن رؤية مباشرة من الجزيئات الحيوية محددة داخل الخلايا. ومع ذلك، للفحص المجهري مضان التقليدية، ويقتصر القرار المكانية التي الحيود إلى ~ 200 نانومتر داخل الطائرة صورة و> 500 نانومتر على طول المحور البصري. ونتيجة لذلك، المجهر مضان منذ فترة طويلة محدودة للغاية في مراقبة ملامح التركيبية داخل الخلايا. والتغلب على التطورات الأخيرة في طرق الفحص المجهري سوبر القرار هذا الحد. على وجه الخصوص، وظهور fluorophores photoswitchable تمكن القائم على توطين سوبر قرار المجهري، والتي تنص على حل السلطة يقترب من النطاق طول الجزيئي. هنا، نحن تصف تطبيق سوبر طريقة قرار المجهر ثلاثي الأبعاد على أساس واحد جزيء المجهري التعريب والتداخل متعدد المراحل، ودعا التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM). يوفر هذا الأسلوب قرار موحد الخواص على ما يقرب منترتيب 20 نانومتر في جميع الأبعاد الثلاثة. بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل أداة iPALM، توصف هنا. هذه البروتوكولات هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة ومفيدة لدراسة الخصائص التركيبية الأخرى في الخلايا.

Introduction

كان التصور من الهياكل الخلوية المعقدة منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من رؤى البيولوجية والاكتشاف. على الرغم من أن الفحص المجهري مضان يمكن أن خلايا صورة مع خصوصية جزيئية عالية، ويقتصر حل السلطة عن طريق حيود إلى ~ 200 نانومتر في الطائرة صورة (س، ص، أو البعد الأفقي) و> 500 نانومتر على طول المحور البصري (ض، أو البعد المحوري) 1،2. وبالتالي، فإن مراقبة ملامح التركيبية تاريخيا تقتصر على المجهر الإلكتروني (EM). لحسن الحظ، فإن التطورات الأخيرة في القرار المجهر السوبر والتحايل هذا الحد، مما يتيح القرار المكانية في 10 - مجموعة نانومتر 100 1-6. على وجه الخصوص، نهج سوبر قرار بناء على توطين جزيء واحد، والمعروف من قبل المختصرات مثل نخلة (PhotoActivated التعريب المجهري) 4، FPALM (الإسفار PhotoActivated التعريب المجهري) 5 (د) STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية التعمير المجهري) 6،7، والطلاء ( بوتراكم كثافة التصوير النانو طبوغرافية) 8، GSDIM (الدولة الأرضي استنفاد المجهر تليها عودة الجزيئية الفردية) 9، أو SMACM (أحادي جزيء نشط تحكم المجهري) 10، وكذلك () تطبيقات على 3 الأبعاد 3D، مثل PALM التداخل (iPALM) 11 أو 3D-STORM 12، كانت قيمة في الكشف عن رؤى جديدة في المنظمة النانو العديد من الهياكل البيولوجية، بما فيها المحاور العصبية والمشابك 13، الالتصاقات البؤرية 14،15، تقاطعات خلية خلية 16، المسام النووية 17 وجسيم مركزي 18-20، على سبيل المثال لا الحصر.

ميزة أخرى التركيبية في الخلايا التي سوبر قرار المجهر مفيد يحتمل أن تكون هي الهيكل الخلوي الأكتين. شبكه معقدة من الخيطية (و) -actin في القشرة خلية يلعب دورا أساسيا في التحكم في شكل الخلوية والخصائص الميكانيكية 21. المنظمة سبنشاط وحيوي ينظم و و الأكتين على الرغم من العديد من البروتينات التنظيمية التي تؤثر بقوة البلمرة، يشابك، والدوران، والاستقرار، وهيكل الشبكة (22). ومع ذلك، على الرغم من أن توصيف العمارة شبكه-و أكتين مهم للرؤى الآلية إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، وحجم صغير (~ 8 نانومتر) من شعيرات و أكتين يعيق مراقبتهم من قبل التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود. وبالتالي، فإن التصور من هيكل غرامة الأكتين وحتى الآن تم تنفيذ حصريا من قبل EM. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي، و الأكتين في خلايا الثدييات الملتصقة، وذلك باستخدام سوبر قرار تقنية المجهر iPALM للاستفادة من قدرتها دقة عالية جدا في 3D 11،23. على الرغم من أن أداة iPALM متخصصة للغاية، وقد وصفت تعليمات حول إعداد مثل هذا الصك مؤخرا 23، في حين أن الوصول إلى المجهر iPALM استضافته هوكما أحرز جناح معهد هيوز الطبي المتاح للمجتمع البحوث بأقل تكلفة ممكنة. بالإضافة إلى ذلك، أساليب إعداد العينات المذكورة هنا قابلة للتطبيق مباشرة إلى النهج البديلة 3D السوبر القرار، مثل تلك التي تقوم على defocusing اللابؤرية وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) 12 أو ثنائية طائرة الكشف عن 24، والتي تتوفر على نطاق أوسع.

ونلاحظ أن عنصر ضروري لقرار المجهر سوبر استنادا توطين جزيء واحد في العام هو fluorophore photoswitchable 25، والذي يسمح الشروط الثلاثة الهامة للأساس توطين جزيء واحد سوبر قرار المجهر الواجب توافرها: أ) ارتفاع واحد جزيء السطوع والتباين بالنسبة إلى الإشارات الخلفية؛ ب) توزيع متفرق من الجزيئات واحدة في إطار صورة معينة. وثالثا) كثافة مكانية عالية من وضع العلامات كافية لالتقاط الملامح العامة للهيكل الأساسي (المعروف أيضا باسم نيكويست شاالمعيار أخذ العينات nnon) 26. وهكذا، للحصول على نتائج مرضية، ينبغي التشديد على قدم المساواة على كل من الإعداد المناسب من العينات لتحسين fluorophore photoswitching والحفاظ على التركيب الدقيق الأساسي، فضلا عن أدوات القياس واكتساب جوانب التجارب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد العينات التصوير

  1. منذ إشارات مضان الخلفية تتداخل مع مضان من العلامات fluorophore، وتنظيف coverglasses قبل الشطف لأول مرة في المياه المتأينة ([ده 2 O) ثم الهواء تجفيفها باستخدام الهواء المضغوط. وفي وقت لاحق، نفذ النقش البلازما في نظافة البلازما لمدة 15 ثانية، أو أطول إذا لزم الأمر.
  2. لتمكين تصحيح الانحراف والمعايرة iPALM، استخدم # 1.5 الجولة (22 مم) coverglasses تنظيفها قبل جزءا لا يتجزأ من النانوية مع الفلورسنت كعلامات الإيمانية، التي تخدم fiducials كما صامد للغاية لمعايرة موثوقة وتصحيح الانحراف. ويرجع ذلك إلى اكتساب الوقت الطويل اللازم لتجميع ما يكفي من كثافة fluorophore (> 15-30 دقيقة)، عينة الانجراف أمر لا مفر منه.
  3. وضع كل ساترة fiducialed إلى 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة. تعقيم لهم من قبل الأشعة فوق البنفسجية (UV) الأشعة في غطاء تدفق الصفحي لمدة 15 دقيقة.
  4. في غطاء تدفق الصفحي العقيمة، وإعداد الليفيحل nectin لطلاء ساترة عن طريق تمييع 1 ملغ / مل حل الأسهم فبرونيكتين في العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) إلى التركيز النهائي 2-10 ميكروغرام / مل. شطف كل ساترة ثلاث مرات مع DPBS واحتضان مع 2 مل من محلول فبرونيكتين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وفي وقت لاحق، نضح من الحل فبرونيكتين وشطف مرة واحدة مع DPBS.
  5. شطف الخلايا لفترة وجيزة مع DPBS. احتضان مع 1-2 مل من التربسين لدقائق قليلة عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا وتخمد مع ~ 10 مل من مستنبت الخلية التي تحتوي على مصل جديد. على سبيل المثال، للخلايا البشرية السري الوريد البطانية (HUVEC)، واستخدام واسع مستنبت البطانية سفينة تستكمل مع عوامل البطانية سفينة كبيرة والبنسلين أو الستربتومايسين.
    1. Replate الخلايا على ساترة المغلفة فبرونيكتين (لكثافة متفرق، لوحة <50000 خلية لكل ساترة) والحفاظ على الثقافة في حاضنة وضعت في 95٪ الرطوبة، 5٪ CO 2، و 37 & #176؛ ج.
  6. للحفاظ السليم للالهياكل الدقيقة من الهيكل الخلوي، و الأكتين، واستخدام المحاليل بناء على الكواشف عازلة جيد البالغ عددهم 27.
    1. على سبيل المثال، وإعداد عازلة PHEM كحل 2X الأوراق المالية (120 أنابيب مم، 50 مم HEPES 20 ملي EGTA، 4 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.0 مع KOH) عن طريق إذابة 6.5 غرام من HEPES، 3.8 غرام من EGTA، و 190 ملغ من MgCl 2 في ~ 300 مل من ده 2 O، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.0 بإضافة قطرة قطرة من محلول KOH المركزة. ثم، إضافة ده 2 O لتبرزي حجم 500 مل. تعقيم المنطقة العازلة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون، واحفظها في 4 درجات مئوية، وتمييع 1: 1 مع ده 2 O قبل الاستخدام.
  7. للحصول على أفضل النتائج مع وضع العلامات كثافة عالية من F-الأكتين، واستخدام phalloidin مترافق مع fluorophores العضوية، مثل فلور اليكسا 647. عند نقطة زمنية محددة بعد replating الخلية، وإصلاح الخلايا على النحو التالي:
    1. نضح في وسائل الإعلام من كل الثقافة التي تحتوي على جيدا معينة ليرة لبنانية. بلطف ولكن سرعان ما الاستغناء 2 مل من الحارة (37 درجة مئوية) مثبتات استخراج تحتوي على 0.25٪ غلوتارالدهيد في المخزن PHEM مع 0.25٪ تريتون X-100. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة. لخطوات لاحقة، استخدام 2 مل من تثبيتي أو التبريد عازلة في ساترة، ما لم ينص على خلاف ذلك.
    2. استبدال تثبيتي استخراج مع تثبيتي غلوتارالدهيد 2.5٪ في المخزن PHEM والسماح للعينات احتضان لمدة 10-12 دقيقة. وتجرى هذه والخطوات التالية كل في درجة حرارة الغرفة.
    3. نضح من المثبتات وبلطف استبدالها عازلة PHEM. الإمالة ودوامة بلطف، ثم يغسل مرة أخرى مع PHEM. كرر مرتين.
    4. لإرواء تألق ذاتي من غلوتارالدهيد، والتي يمكن أن تطغى على إشارات من fluorophores المطلوب، واحتضان العينات مع العازلة تبريد الطازجة التي تحتوي على NaBH 4 في تركيز كتلة من 0.1٪ في PHEM. وسيراعى في فقاعات وافر. في بعض الأحيان الاستفادة من طبق عينة بلطف إلى dislodge الفقاعات. السماح لها احتضان لمدة 5-10 دقائق.
    5. نضح من المخزن المؤقت التبريد وبلطف استبدالها عازلة PHEM. شطف عدة مرات لازالة الفقاعات. ماصة في 2 مل من PHEM العازلة والسماح لها احتضان في الظلام لمدة 5 دقائق. كرر مرتين وترك بقية العينة في المخزن PHEM عند الانتهاء.
    6. إعداد غرفة الرطوبة لphalloidin حضانة باستخدام بلاستيكية كبيرة مبطن طبق بيتري مع قطعة من منشفة ورقية مبللة بسخاء مع 5-10 مل من ده 2 O. وضع ورقة كبيرة من بارافيلم نظيفة على رأس منشفة ورقية مبللة.
    7. ويرجع ذلك إلى ارتفاع تكلفة نسبيا من phalloidin المسمى، استخدام كمية صغيرة لكل وضع العلامات. لارتفاع كثافة وضع العلامات، وتبدأ مع تركيز 0.3 ميكرومتر. إعداد ~ 60 ميكرولتر في ساترة باستخدام phalloidin-فلور اليكسا 647 في المخزن PHEM.
    8. ماصة 55-60 ميكرولتر من محلول phalloidin على ورقة بارافيلم في غرفة الرطوبة. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة بلطف coverg عينةمعشوقة. كن حذرا أن نلاحظ الوجه التي تحتوي على الخلايا الصحيحة.
    9. بسرعة وبلطف استفادة بعيدا عازلة الزائد عن طريق لمس حافة ساترة مع قطعة مطوية من الورق ماصة دقيقة، وبعد ذلك وضع الجانب الخلية ساترة لأسفل على قطرة من حل phalloidin على بارافيلم. تأكد من عدم وجود فقاعات المحاصرين من قبل ساترة.
    10. وضع غطاء على الرطوبة. التفاف غرفة في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء المحيط، والسماح للعينة احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يمكن أن تظل العينة في هذه الحالة لعدة أيام. تأكد من أن الغرفة الرطوبة تبقى رطبة إذا تم التخطيط التخزين الطويل.
  8. قبل التصوير، ضع بلطف الجانب الخلية ساترة حتى على لوحة 6 جيدا جديدة تحتوي على 2 مل من العازلة PHEM لكل بئر.
  9. إعداد مخازن التصوير القائم على ثيول-بكسح الأكسجين باستخدام حلول الأوراق المالية التالية: 1 M جلوكوز، 1 م cysteamine، و100X الجلوكوز أوكسيديز / الكاتالاز MIXT انزيملدى عودتهم (4 ملغ من الكاتلاز و 10 ملغ من أوكسيديز الجلوكوز في 100 ميكرولتر من العازلة PHEM، ويخلط جيدا قبل vortexing) 28. الحق قبل التصوير، وخلط 75 ميكرولتر من 1 M حل الجلوكوز، 30 ميكرولتر من محلول 1 M cysteamine، و 3 ميكرولتر من 100X الأسهم انزيم الخليط. ضبط مستوى الصوت إلى 300 ميكرولتر مع العازلة PHEM واستخدامها على الفور بعد خلط لتركيب العينة.
  10. لiPALM، وإعداد نموذج التصوير باستخدام تنظيفها قبل # 1.5 ساترة (22 مم).
    1. بدلا من ذلك، استخدم شريحة زجاجية (3 "س 1") مع الوجهين هل لاصقة للمساعدة في التجمع إذا القائم الاستجماتيزم 3D-STORM 12 لاستخدامه بدلا من ذلك.
    2. لتجميع عينة التصوير، واستخدام ملقط غرامة لإزالة بلطف ساترة عينة من المخزن المؤقت جيدا. ثم، بسرعة وبلطف استفادة بعيدا عازلة الزائد عن طريق لمس حافة ساترة مع ورقة ماصة مطوية.
    3. وضع الجانب الخلية ساترة مواجهة على قطعة من الورق عدسة نظيفة. شطف العينةعن طريق وضع 30 - 50 ميكرولتر من العازلة التصوير على العينة، وإزالة عازلة الزائد عن طريق إمالة والتنصت مع ورقة ماصة مطوية.
    4. كرر الخطوة الشطف عدة مرات، ثم وضع 30 - 50 ميكرولتر من العازلة التصوير على العينة. وصمة عار تجف حافة ساترة ووضع عدة نقاط صغيرة جدا من الايبوكسي علاج سريع إلى منطقة المجففة.
    5. انخفاض ببطء آخر تنظيفها قبل # 1.5 ساترة (عادي، جولة ساترة، 18 مم) على المركز ال 22 ملم ساترة التي تحتوي على الخلية. السماح المخزن المؤقت التصوير الرطب على حد سواء coverglasses بفعل الخاصية الشعرية. يجب على نقاط صغيرة من الايبوكسي علاج سريع الالتزام بكل coverglasses.
    6. اضغط بلطف على عينة تجميعها باستخدام ورقة ماصة مطوية لنشر الضغط بالتساوي. استخدام ما يكفي من الضغط لجعل عينة الخلايا رقيقة وحتى (<15 ميكرون)، ولكن ليس بقدر ما هو لسحق الخلايا. قياس سمك السليم من خلال مراقبة نمط حلقات لنيوتن. أيضا، تأكد من تنفيذ هذا الواحدالجيش الشعبي بلطف للحد من فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر، وممارسة مع coverglasses فارغة عدة مرات مسبقا.
  11. ختم العينة مع ذاب الفازلين، اللانولين، البارافين (VALAP، والأوراق المالية أعدت من 100 غراما لكل من الفازلين، اللانولين، والبارافين، ذاب معا) 29، وشطف عينة مختومة مع ده 2 O، وضربة الجافة مع الهواء المضغوط. العينة هي الآن جاهزة للتركيب على المجهر للتصوير.

2. التنسيب عينة وiPALM محاذاة

  1. نقل أعلى عدسة الهدف بنابض أعلى للسماح لإزالة من صاحب العينة. ضع عينة مختومة أعدت في الخطوة 1.10 على صاحب العينة وآمنة مع عدة مغناطيس الأرضية النادرة الصغيرة. تطبيق زيت الغمر على كلا الجانبين من عينة التصوير. وضع صاحب العينة مرة أخرى في مسار بصري وخفض بلطف أعلى عدسة الهدف.
  2. بدوره على الليزر الإثارة. بدوره على جهاز إلى جانب المسؤول عن الإلكترون ضرب (EMCCD) الكاميرا في وضع الإطار نقل.
    1. تدوير في المرشحات الانبعاثات المناسبة. تنشيط مفتاح ميكانيكي لمنع شعاع مسار الأعلى (الشكل 1A) وفتح مسار الشعاع السفلي. جلب عدسة موضوعية أسفل إلى تركيز الترجمة في زيادات صغيرة باستخدام المحرك بيزو.
    2. وبمجرد أن الإيماني هو في التركيز، وفتح مسار الشعاع كبار في حين وقف مسار الشعاع القاع، وتحقيق أعلى عدسة الهدف إلى التركيز بطريقة مماثلة. مراقبة عرض الإيمانية التي تظهر على شاشة الكمبيوتر لتركيز الأمثل.
  3. لحدانية التركيز السليم، وفتح كل من أعلى ومسارات شعاع القاع. ضبط يدويا أعلى عدسة الهدف في حين يتم الاحتفاظ الهدف السفلي ثابت وذلك باستخدام زوج من مجموعة مسامير الصغيرة على ما يرام، حتى تتداخل الصور الإيمانية بأكبر قدر ممكن، من الناحية المثالية في بكسل واحد.
    1. وفي وقت لاحق، نفذ تعديلات دقيقة بحيث الصور الإيمانية في الخطوة 2.3 التداخل ضمن عشر من بكسل EMCCD. ضبط أعلى2-محور المرايا محمولة بيزو عبر برنامج حاسوبي لمراقبة بينما تحتجز كل من العدسات موضوعية وانعكاس أسفل المرايا المستمر. مقارنة مراكز fiducials من أعلى وأسفل آراء موضوعية عبر شاشة الكمبيوتر لتوجيه العملية.

3. معايرة الإعداد iPALM

ملاحظة: نظرا لأن انبعاث مضان هو غير متماسكة، لتدخل الواجب مراعاتها في iPALM، المسار أطوال من خلال الجزء العلوي ويجب أن تكون الأهداف السفلية قريبة من بعضها البعض، في غضون بضعة ميكرونات. ويمكن تحقيق ذلك على النحو التالي:

  1. مع أشعة الليزر على والكاميرات تدفق مستمر، وكلا من أعلى وأسفل مسارات شعاع مفتوحة، التأرجح صاحب العينة ض بيزو باستخدام الموجي الجهد الجيبية التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج حاسوبي لمراقبة لاستمرار التذبذب ض محور على قوته 400 نانومتر .
  2. الاستفادة من حقيقة أنه، عند الخروج من المواءمة المثلى، وشدة الإيمانية تختلف قليلا مع تيكان التذبذب، يدويا ترجمة الآلية جمعية شعاع الخائن لأعلى أو لأسفل حتى شدة يتذبذب الإيمانية بسبب تأثير التدخل فوتون واحد المطلوب. هذا يدل على المماثلة بين أطوال مسار البصرية. وهناك نسبة من> 10 الذروة إلى الوادي لا يمكن أن يتحقق في الحالات المثلى (1D الشكل).
  3. للتأكد من أن كل من السعة والطور في كل السطحية متجانسة بقدر الإمكان عبر الميدان، وضبط المرآة السفلية للجمعية شعاع الخائن في خطوات صغيرة لضبط الفجوة وزوايا الميل. أداء شعاع الخائن محاذاة غرامة بترجمة العينة في 8 نانومتر ض الخطوات أكثر من 800 نانومتر.
    1. مراقبة كثافة الإيمانية بين الكاميرات # 1 - 3. ضبط الارتفاع، والموقف، والميل للمرآة أسفل داخل الجمعية شعاع الخائن في خطوات صغيرة، مثل أن المرحلة التذبذب الكاميرا رقم 1 بالنسبة للكاميرا تكبير # 2، من الناحية المثالية في 120 ° (الشكل 1B-D).
    2. مرة الأوليمحاذاة كاملة، ترجمة العينة إلى مسح لحقل مناسبة للعرض الذي يحتوي على كل الخلايا لصورة وfiducials متعددة في مكان قريب. وضع سياج حول نظام لمنع الضوء الشارد والاضطرابات المحيطة. حالما يتم العثور على منطقة التصوير، وتنفيذ الإجراء في الخطوة 3.4 ثانية، وتسجيل منحنى المعايرة لاستخدامها في عمليات الاستخراج زي تنسيق اللاحقة باستخدام الأمر "الحصول معايرة المسح مقابل عينة بيزو الوظيفة" في الواجهة الرئيسية.

4. الحصول على البيانات

  1. مرة واحدة تم العثور على المنطقة المرغوبة ويتم الحصول على منحنى المعايرة، أدخل أسماء الملفات المناسبة في البرنامج. فتح كل من أعلى ومسارات شعاع القاع. زيادة قوة الإثارة ليزر 642 نانومتر إلى الحد الأقصى. لفلور اليكسا 647، قد تكون هناك حاجة لفترة أولية مدتها fluorophore إطفاء (الشكل 2A).
    1. فضح مع المستمرة لإثارة 642 نانومتر لمدة 5 دقائق، أو أكثر إذا لزم الأمر، حتى الاشتراكيةلوحظ جزيء ngle وامض (الشكل 2B). البرنامج يتيح زيادة تلقائية من 405 نانومتر تنشيط الصورة أثناء عملية الاستحواذ. وتتطلب أعدادا كبيرة من إطارات اكتساب عادة لميزات الخيطية لتكون مرئية بشكل واضح (> 50،000 الإطارات). عندما تصبح جاهزة، تبدأ اقتناء مجموعات الصور الخام باستخدام الأمر "بدء iPALM اكتساب" في الواجهة الرئيسية.
  2. خلال عملية الاستحواذ، ضبط مستوى تنشيط ضوئي عن طريق ضبط شدة الليزر 405 نانومتر للحفاظ على كثافة الوميض المناسبة حسب الحاجة (انظر الأمثلة في الشكل 2B).
    ملاحظة: بمجرد الانتهاء من عملية الاستحواذ، يقوم البرنامج بتحويل ملفات الصور تلقائيا في شكل ثنائي السليم. هي التي شنت مستودع البيانات في الخادم حساب بمثابة محرك أقراص شبكة الاتصال، مما يسمح البيانات المراد نسخها مباشرة هناك لمزيد من المعالجة.

5. معالجة البياناتوتحليل

  1. لتحليل توطين باستخدام البرمجيات المتقدمة المخصصة لاستخراج المعلمات الأكثر ملائمة لجميع الجزيئات واحدة وكذلك لfiducials 11،15،23. هذا لن يحقق س، ص تنسيق، ولكن أيضا الشدة التي تستخدم لتحليل منحنى المعايرة.
    1. استيراد بيانات المعايرة الخام المكتسبة في الخطوة 3.5 باستخدام الأمر "استخراج قمم تسميات متعددة" ضمن القائمة "ملف" لتنفيذ توطين جزيء واحد. وبعد تحليل توطين الأولي، الإحداثيات التي تم الحصول عليها من الكاميرات # 1-3 موجودة في قنوات الأحمر والأخضر، والأزرق، على التوالي، ويمكن حفظها لمزيد من التحليل باستخدام الأمر "حفظ معالجتها على النحو المختبر الدولي للألماس (.sav)" تحت عنوان " ملف "القائمة.
  2. لجلب البيانات من الكاميرات # 1-3 في التسجيل باستخدام fiducials الفلورسنت المدمجة على لل coverslips، تحديد العديد من fiducials مشرق لتوفير التغطية للصورة المركزية (على سبيل المثال،الشكل 1B) باستخدام الأمر "مرساة إيمانية نقاط" ضمن القائمة "التحولات صورة". استخدام مجموعات ثلاثية من توطين ينسق من الكاميرات # 1-3 تم الحصول عليها من fiducials مشرقة في الخطوة 5.1 لحساب التناوب ورفع مصفوفة من شأنها أن تجلب الكاميرات رقم 1 ورقم 3 في السجل مع كاميرا # 2. مع عدد كبير بما فيه الكفاية من fiducials، العليا تزييفها متعدد الحدود لا يمكن أن يؤديها لنوبات أفضل.
  3. مرة واحدة يتم حساب مصفوفة التحويل، تحويل البيانات الخام من كاميرات # 1-3 معا للحصول على البيانات الخام لخص. أداء جولة أخرى من تحليل توطين لانتاج س أكثر دقة، ص تنسيق وتحديد المساهمة النسبية لكل قناة الكاميرا إلى البيانات الخام لخص. استخدام الأمر "تحويل الخام، وحفظ وحفظ مبلغ (دات)" ضمن القائمة "التحولات صورة". هذه نسبة كثافة يحتوي على معلومات زي تنسيق.
  4. حدد إيمانية مشرق وأداء Z-معايرة المناسب باستخدام وظيفة "اختبار الرياح نقطة 3D" في مربع الحوار المنبثقة بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة". هذا وسوف تتناسب مع وظائف 3 جيبية لشدة القنوات كاميرا 3 لتحديد منحنى المعايرة. ثم يتم حفظ ملف معايرة لاستخدامها مرة أخرى على مجموعات البيانات الرئيسية.
  5. لاختبار نوعية منحنى المعايرة، نفذ ض تنسيق الاستخراج، كما هو موضح سابقا 23. لfiducials حسن تصرف في نظام معايرة بشكل جيد، يجب توسيع نطاق ض تنسيق خطيا، منذ تتخذ مجموعات البيانات المعايرة مع حملة الخطي في زي الموقف. وعلاوة على ذلك، ينبغي للض مواقف جميع fiducials تحجيم مع انحدار مماثل.
  6. مرة واحدة يتم الحصول على معايرة مرضية، نفذ الترجمة والتحليل تحول لمجموعات البيانات صورة الخام المكتسبة في الخطوة 4 التالية نفس الإجراء الموضحة في الخطوات 5،1-5،3. عند الانتهاء، تحميل ملف معايرة من الخطوة 5.4 وأداء ض تنسيق عملية الاستخلاص باستخدام وظائف "اختيار WND ملف" و "استخراج Z تنسيق" في مربع الحوار المنبثقة بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة".
    ملاحظة: منذ وقت الاستحواذ> 15 دقيقة، والانحراف الميكانيكي هو متوقع.
  7. لإجراء تصحيح الانحراف في س، ص، حدد إيمانية مشرقة من الإحداثيات التعريب. وينبغي أن يكون هذا الإيمانية موجودة في جميع الأطر. ثم، استخدم x و y-تنسيق الانجراف الإيمانية للتنسيق بين جميع الإحداثيات الأخرى ضمن نفس الإطار العودة إلى تسجيل (الشكل 3A-B) باستخدام وظيفة "اختبار / كتابة دليل ستار" ضمن القائمة "التحولات صورة". تسجيل Z تنسيق لا يمكن أن يؤديها كذلك عن طريق الوصول إلى "اختبار دليل ستار" و "كتابة دليل ستار" وظائف في حوار منبثق بالنقر على "عمليات Z-تنسيق" ضمن القائمة "المهام الخاصة".
  8. كما العينة قد يحمل ميل طفيف، نفذ تصحيح الميل من خلال توفير س، ص، ض إحداثيات 3 نقاط مرجعية تحديد الطائرة التي يجب أن يتم تعيين مستوى باستخدام وظيفة "إزالة XYZ الميل" في مربع الحوار المنبثقة عن طريق النقر " عمليات Z-تنسيق "تحت عنوان" القائمة المهام الخاصة ".
  9. لاحقا إلى الانجراف والميل التصحيحات حفظ إحداثيات التعريب. إعادة بناء صورة قرار سوبر لمزيد من التحليل (الشكل 4A-D) باستخدام الأمر "تقدم" على الواجهة الرئيسية. اللون يمكن استخدامها للإشارة إلى ض تنسيق. بدلا من ذلك، عرض الجانب من المنطقة المحددة ويمكن أيضا أن يصدر. إحداثيات التعريب يمكن تصديرها كملفات نصية لمزيد من التحديد الكمي، أو يمكن حفظ صورة بناءها على النحو ملف .tif.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

متطلبات حاسمة لiPALM هي محاذاة، والتسجيل، ومعايرة النظم البصرية. هذه هي اللازمة لضمان التدخل السليم داخل 3 في اتجاه شعاع الخائن شرطا لض تنسيق الاستخراج. لتمكين المراقبة المستمرة، ومصادر نقطة ثابتة من مضان ضرورية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الفلورسنت ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويستند النظام البصري من iPALM على تصميم موضوعي 4 و- ð ثنائي تعارض، كما هو مبين في الشكل 1A. يتم إنشاء الإعداد باستخدام أجزاء كل من عرف تشكيله والتجارية البصريات الميكانيكية، كما هو موضح سابقا 23 والمدرجة في الجدول 1. بالإضافة إلى الإعداد لد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

ستشغل وPK الامتنان الدعم المالي من مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة، منحت لPK (جبهة الخلاص الوطني، NRFF-2011-04 وNRF2012NRF-CRP001-084). كما نشكر مختبر والأساسية المجهر مفتوحة مرافق MBI لدعم البنية التحتية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
optical tableNewport, CARS4000iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical tableNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055output power=100 mw
laser-561Newport, CA1168931output power=200 mw
laser-488Newport, CA1137970output power=200 mw
laser-405Newport, CA1142279output power=100 mw
broadband dielectric mirrorsThorlabs, NJBB1-E02laser combiner
dichroic beamsplitterSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optic tunable filterAA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear polarizerNewport, CA05LP-VIS-B
baseplatelocal workshopcustomized
turning mirror (22.5°)Reynard Corpporation, CAcustomized22.5° mirror
motorized optic mountsNew Focus, CA8816
motorized XYZ translation stageThorlabs, NJMT3/M-Z6sample holder
T-Cube DC servo motor controllerThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, GermanyS-303.CD
objective lensNikon, JapanMRD01691objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stageNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotary Solenoid/ShutterDACO Instruments, CT5423-458
3-way beam splitterRocky Mountain Instruments, COcustomizedbeamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, GermanyS-316.10
motorized five-axis tilt alignerNew Focus, CA8081
Picmotor ethernet controllerNew Focus, CA8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation modulePhysik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
band-pass filterSemrock, NYFF01-523/20filters
band-pass filterSemrock, NYFF01-588/21
band-pass filterSemrock, NYFF01-607/30
band-pass filterSemrock, NYFF01-676/37
notch filterSemrock, NYNF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronizationDellPrecision T3500PC, 4 sets
coverslips with fiducialHestzig, VA600-100AuFsample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectinMillipore, MTFC010
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16%
glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial FactorsLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287staining
sodium borohydride (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101imaging buffer
glucose oxidaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cysteamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415sample sealing
lanolinSigma aldrich, MOL7387
parafin waxSigma aldrich, MO327204
Immersion oilElectron Microscopy Sciences, PA16915-04imaging. Cargille Type HF

References

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118 iPALM F Photoswitchable Fluorophores

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved