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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un protocollo di applicazione del interferometrica fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM), un metodo di risoluzione di microscopia eccellente 3-dimensional localizzazione singola molecola, per l'imaging del citoscheletro actina in cellule di mammifero aderenti. Questo approccio permette la visualizzazione basata sulla luce delle caratteristiche strutturali nanoscala che altrimenti rimarrebbero irrisolti da convenzionale microscopia ottica di diffrazione limitata.

Abstract

Microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione diretta di biomolecole specifici all'interno delle cellule. Tuttavia, per microscopia a fluorescenza convenzionale, la risoluzione spaziale è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm entro il piano dell'immagine e> 500 nm lungo l'asse ottico. Come risultato, la microscopia a fluorescenza è stata a lungo fortemente limitato nell'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali all'interno delle cellule. Il recente sviluppo di metodi di microscopia Super Resolution ha superato questa limitazione. In particolare, l'avvento di fluorofori photoswitchable permette al microscopio di risoluzione super di localizzazione basati, che fornisce potere di risoluzione si avvicina alla scala molecolare di lunghezza. Qui, descriviamo l'applicazione di un metodo di risoluzione di microscopia eccellente tridimensionale sulla base di singola molecola di localizzazione, microscopia ed interferometria multifase, chiamato interferometrica fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM). Questo metodo fornisce una risoluzione quasi isotropa sulladell'ordine di 20 nm nelle tre dimensioni. Protocolli per la visualizzazione del citoscheletro actina filamentosa, compresa la preparazione del campione e il funzionamento dello strumento iPALM, sono descritte qui. Questi protocolli sono facilmente adattabili e istruttivo per lo studio di altre caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule.

Introduzione

La visualizzazione delle strutture cellulari complesse è stata a lungo parte integrante di dati biologici e la scoperta. Sebbene microscopia a fluorescenza può celle di immagine con alta specificità molecolare, il suo potere di risoluzione è limitata dalla diffrazione a ~ 200 nm nel piano immagine (x, y, o dimensione laterale) e> 500 nm lungo l'asse ottico (z, o dimensione assiale) 1,2. Pertanto, l'osservazione delle caratteristiche ultrastrutturali è stato storicamente limitato a microscopia elettronica (EM). Fortunatamente, il recente sviluppo della microscopia super-risoluzione ha aggirato questo limite, consentendo la risoluzione spaziale nel 10-100 nm gamma 1-6. In particolare, super risoluzione approcci basati sulla localizzazione singola molecola, nota con acronimi quali PALM (fotoattivati localizzazione Microscopy) 4, FPALM (Fluorescence fotoattivati localizzazione Microscopy) 5 (d) STORM (diretta Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 6,7, VERNICE ( Point accumulo per l'imaging Nanoscale Topografia) 8, GSDIM (giardino Stato Depletion Microscopia seguito dal ritorno molecolare individuale) 9, o SMACM (Single-molecola attiva-Control Microscopy) 10, così come le loro implementazioni in 3 dimensioni (3D), come ad esempio PALM interferometrica (iPALM) 11 o 3D-STORM 12, sono stati preziosi nel rivelare nuove intuizioni l'organizzazione su scala nanometrica di numerose strutture biologiche, tra cui gli assoni e sinapsi neuronali 13, adesioni focali 14,15, giunzioni cellula-cellula 16, pori nucleari 17 e centrosomi 18-20, solo per citarne alcuni.

Un'altra caratteristica ultrastrutturale nelle cellule per i quali la microscopia super-risoluzione è potenzialmente utile è il citoscheletro di actina. Il complesso reticolo di filamentosa (f) actina nella corteccia cellulare gioca un ruolo fondamentale nel controllo della forma cellulare e le proprietà meccaniche 21. L'organizzazione of f-actina è attivamente e dinamicamente regolata anche se numerose proteine regolatrici che influenzano fortemente la polimerizzazione, reticolazione, il fatturato, la stabilità e la topologia di rete 22. Tuttavia, anche se la caratterizzazione dell'architettura trabecolato f-actina è importante per intuizioni meccanicistici in una vasta gamma di processi cellulari, le piccole dimensioni (~ 8 nm) dei filamenti F-actina ostacola la loro osservazione convenzionale microscopia ottica diffrazione limitata; in tal modo, la visualizzazione di struttura fine actina è finora stata eseguita esclusivamente da EM. Qui, descriviamo i protocolli per la visualizzazione del citoscheletro F-actina in cellule di mammifero aderenti, utilizzando la tecnica di microscopia super-risoluzione iPALM per sfruttare la sua capacità di altissima precisione in 3D 11,23. Anche se lo strumento iPALM è altamente specializzato, istruzioni sulla creazione di un tale strumento è stato descritto di recente 23, mentre l'accesso al microscopio iPALM ospitato dalla Horeparto Hughes Medical Institute è stato messo a disposizione della comunità di ricerca con un costo minimo. Inoltre, i metodi di preparazione dei campioni descritti sono direttamente applicabili agli approcci alternativi 3D Super Resolution, come quelli basati su defocalizzazione astigmatica della funzione di diffusione di punto (PSF) 12 o bi-piano di rivelazione 24, che sono più ampiamente disponibili.

Notiamo che un ingrediente necessario per basati su localizzazione singola molecola di microscopia super-risoluzione, in generale, è il fluoroforo photoswitchable 25, che permette i tre requisiti fondamentali per la microscopia di risoluzione super-based localizzazione singola molecola per essere soddisfatti: i) ad alta singola molecola luminosità e contrasto rispetto a segnali di fondo; ii) la distribuzione sparsa di singole molecole in un determinato lasso di immagine; e iii) ad alta densità spaziale di etichettatura sufficiente per catturare il profilo della struttura sottostante (noto anche come Nyquist-Shacriterio di campionamento nnon) 26. Così, per ottenere risultati soddisfacenti, enfasi dovrebbe essere posta ugualmente sia la corretta preparazione dei campioni per ottimizzare fluoroforo photoswitching e per garantire la ultrastruttura sottostante, nonché sugli aspetti strumentazione e acquisizione degli esperimenti.

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Protocollo

1. Imaging Preparazione dei campioni

  1. Dal momento che i segnali fluorescenza di fondo interferiscono con fluorescenza dalle etichette fluoroforo, pulire i vetrini dal primo risciacquo in acqua deionizzata (DDH 2 O) e quindi aria di essiccazione utilizzando aria compressa. Successivamente, eseguire attacco in plasma e un detersivo plasma per 15 secondi, o più, se necessario.
  2. Per abilitare la correzione della deriva e la calibrazione iPALM, usare # 1.5 rotondo (diametro 22 mm) vetrini pre-puliti integrati con nanoparticelle fluorescenti come punti di riferimento, che servono fiducials come altamente fotostabili per la calibrazione affidabile e la correzione della deriva. A causa del lungo tempo di acquisizione necessario per accumulare sufficiente densità fluoroforo (> 15 - 30 min), campione deriva è inevitabile.
  3. Posizionare ogni coprioggetti fiducialed in una piastra di coltura tissutale 6-bene. sterilizzare dalla radiazione ultravioletta (UV) in una cappa a flusso laminare per 15 min.
  4. In una cappa a flusso laminare sterile, preparare fibrosoluzione Nectin per il rivestimento coverglass diluendo 1 mg / ml soluzione madre fibronectina in tampone fosfato soluzione salina sterile Dulbecco (DPBS) ad una concentrazione finale 2 - 10 mg / ml. Sciacquare ogni coprioggetti tre volte con DPBS e incubare con 2 ml di soluzione di fibronectina notte a 4 ° C. Successivamente, aspirare la soluzione fibronectina e risciacquare una volta con DPBS.
  5. Lavare le cellule brevemente con DPBS. Incubare di 1 - 2 ml di tripsina per alcuni minuti a 37 ° C finché le cellule si staccano e spegnere con ~ 10 ml di mezzo di coltura cellulare contenente siero fresco. Ad esempio, per le cellule umane ombelicale vena endoteliali (HUVEC), usare grande terreno di coltura nave endoteliale integrato con grandi fattori nave endoteliali e la penicillina o streptomicina.
    1. Replate le cellule su coprioggetti fibronectina rivestite (per densità sparse, piastra di <50.000 cellule per coprioggetti) e mantenere la cultura in un incubatore a 95% di umidità, 5% di CO 2, e 37 & #176; C.
  6. Per una buona conservazione delle belle strutture del citoscheletro F-actina, utilizzare soluzioni tampone sulla base di buone reagenti tampone 27.
    1. Ad esempio, preparare tampone PHEM come soluzione 2x magazzino (120 TUBI mM, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, pH 7,0 con KOH) sciogliendo 6,5 g di HEPES, 3,8 g di EGTA, e 190 mg di MgCl 2 in ~ 300 ml di DDH 2 O, con il pH regolato a 7,0 per aggiunta goccia a goccia di soluzione di KOH concentrato; quindi, aggiungere DDH 2 O per portare il volume a 500 ml. Sterilizzare il buffer usando un filtro di 0,22 micron, conservarlo a 4 ° C, e diluire 1: 1 con DDH 2 O prima dell'uso.
  7. Per ottenere i migliori risultati con etichettatura alta densità di f-actina, uso falloidina coniugata con fluorofori organici, come Alexa Fluor 647. Al punto di tempo desiderato dopo replating cellule, fissare le celle come segue:
    1. Aspirare i media di ogni cultura e che contengono il ceesemplare II. Delicatamente ma rapidamente erogare 2 ml di caldi fissativi estrazione (37 ° C) contenente 0,25% di glutaraldeide in tampone PHEM con 0,25% Triton X-100. Incubare a temperatura ambiente per 1 - 2 min. Per i passaggi successivi, usare 2 ml di fissativo o tempra tampone per coprioggetti, se non diversamente indicato.
    2. Sostituire il fissativo estrazione con un fissativo glutaraldeide 2,5% in tampone PHEM e lasciare che i campioni incubare per 10 - 12 min. Questo ed seguenti operazioni sono tutte effettuate a temperatura ambiente.
    3. Aspirare i fissativi e delicatamente sostituirli con tampone PHEM. Tilt e miscelare delicatamente, e poi lavare di nuovo con PHEM. Ripetere due volte.
    4. Per spegnere autofluorescenza da glutaraldeide, che può sopraffare segnali dai fluorofori desiderati, incubare i campioni con un buffer tempra preparata di recente contenente NaBH 4 ad una concentrazione di massa di 0,1% in PHEM. saranno osservati bolle abbondante. Di tanto in tanto toccare il piatto del campione delicatamente per dislodge le bolle. Lasciare incubare per 5 - 10 minuti.
    5. Aspirare il buffer di tempra e delicatamente sostituirlo con tampone PHEM. Risciacquare un paio di volte per eliminare le bolle. Pipettare in 2 ml di PHEM tampone e lasciarlo incubare al buio per 5 min. Ripetere due volte e lasciare che il resto del campione nel tampone PHEM quando fatto.
    6. Preparare una camera umida per falloidina incubazione con un grande plastico Petri riempita con un pezzo di carta assorbente generosamente inumidito con 5 - 10 ml di DDH 2 O. Mettere un grande foglio di Parafilm pulita sulla parte superiore del tovagliolo di carta bagnata.
    7. A causa del costo relativamente elevato dei phalloidin etichettato, utilizzare un piccolo volume per ogni etichettatura. Per l'etichettatura alta densità, iniziare con una concentrazione di 0,3 mM. Preparare ~ 60 microlitri per coprioggetti usando falloidina-Alexa Fluor 647 in tampone PHEM.
    8. Pipettare 55 - 60 microlitri della soluzione phalloidin sul foglio Parafilm nella camera umida. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere delicatamente il campione coverglass. Fare attenzione a notare la faccia cellule contenenti corretta.
    9. Rapidamente e picchiettare delicatamente via il tampone in eccesso toccando il bordo del coprioggetti con un pezzo di carta piegato assorbenti delicata, e quindi posizionare il lato cella coverglass rivolto verso il basso sulla goccia di soluzione falloidina sul Parafilm. Assicurarsi che non vi siano bolle intrappolati dal coprioggetti.
    10. Posizionare il coperchio sulla camera umida. Avvolgere la camera di foglio d'alluminio per proteggerlo dalla luce ambientale, e lasciare che il campione incubare una notte a 4 ° C. Il campione può essere conservato in questa condizione per diversi giorni. Assicurarsi che la camera di umidità rimane umida se lunga conservazione è prevista.
  8. Prima di immagini, inserire delicatamente il lato della cella coverglass up su un nuovo 6-pozzetti contenente 2 ml di tampone PHEM per pozzetto.
  9. Preparare tiolo-based buffer di imaging di ossigeno scavenging utilizzando le seguenti soluzioni madre: 1 M di glucosio, 1 M cisteamina, e 100x glucosio ossidasi / mixt enzima catalasiure (4 mg di catalasi e 10 mg di glucosio ossidasi in 100 microlitri di tampone PHEM, mescolati bene nel vortex) 28. Proprio prima di imaging, mescolare 75 ml di soluzione 1 M di glucosio, 30 ml di soluzione di 1 M cisteamina, e 3 ml di 100x miscela magazzino di enzimi. Regolare il volume di 300 ml con tampone PHEM e utilizzare immediatamente dopo la miscelazione per montare il campione.
  10. Per iPALM, preparare il campione di imaging utilizzando un # 1.5 coprioggetti pre-pulito (diametro 22 mm).
    1. In alternativa, utilizzare un vetrino (3 "x 1") con una doppia faccia spacer adesivo per facilitare l'assemblaggio se astigmatismo basato 3D-STORM 12 deve essere utilizzato.
    2. Per assemblare il campione di imaging, usare una pinza sottile per rimuovere delicatamente il coprioggetti esemplare dal buffer bene. Poi, rapidamente e delicatamente toccare l'eccesso di tampone toccando il bordo del coprioggetti con carta assorbente piegato.
    3. Posizionare il lato cellule coverglass rivolto verso l'alto su un pezzo di carta per lenti pulite. Lavare il campioneposizionando 30 - 50 ml di tampone di imaging sul campione, e rimuovere il tampone in eccesso inclinando e toccando con carta assorbente piegato.
    4. Ripetere la fase di risciacquo un paio di volte, e quindi inserire 30 - 50 ml di buffer di immagini sul campione. Blot asciugare il bordo del coprioggetti e posizionare più molto piccoli punti di resina epossidica indurimento rapido sulla zona secca.
    5. Abbassare lentamente un'altra # 1.5 coprioggetti pre-puliti (comune, coverglass tondo, diametro 18 mm) sul centro del 22-mm coverglass cellule contenenti. Lasciate che il buffer di imaging bagnare entrambi vetrini per capillarità. I piccoli punti di resina epossidica indurimento rapido dovrebbero aderire ad entrambe le vetrini.
    6. Premere delicatamente sul campione assemblato utilizzando carta assorbente piegato per diffondere uniformemente la pressione. Utilizzare una pressione sufficiente a rendere cellula-sottile campione e persino (<15 micron), ma non così tanto da schiacciare le cellule. Gauge lo spessore corretto osservando gli anelli modello di Newton. Inoltre, assicurarsi di eseguire questa step delicatamente per ridurre al minimo le bolle d'aria. Se necessario, praticare con vetrini vuoti più volte in anticipo.
  11. Sigillare il campione con fuso vasellina-lanolina-paraffina (VALAP, fotografia preparato da 100 g ciascuno di vaselina, lanolina e paraffina, fusi insieme) 29, lavare il campione sigillato con DDH 2 O, e asciugare con aria compressa. Il campione è ora pronto per il montaggio sul microscopio per l'imaging.

2. Posizionamento del campione e iPALM Allineamento

  1. Spostare la lente obiettivo superiore a molla verso l'alto per consentire la rimozione del supporto del campione. Posizionare il campione sigillate previste al punto 1.10 sul supporto del campione e fissare con diversi piccoli magneti in terre rare. Applicare olio di immersione su entrambi i lati del campione imaging. Collocare il supporto del campione di nuovo nel percorso ottico e abbassare delicatamente la lente obiettivo superiore.
  2. Attivare i laser di eccitazione. Accendere il dispositivo Electron Moltiplicando Charge-Coupled (EMCCD) della fotocamera in modalità frame-trasferimento.
    1. Ruotare nei filtri di emissione adeguati. Attivare un otturatore meccanico per bloccare il percorso fascio superiore (Figura 1A) e aprire il percorso del fascio inferiore. Portare la lente dell'obiettivo fondo a fuoco da traduzione in piccoli incrementi utilizzando l'attuatore piezoelettrico.
    2. Una volta che il fiducial è a fuoco, aprire il percorso del fascio superiore bloccando il percorso del raggio inferiore e per portare la lente superiore dell'obiettivo a fuoco in modo simile. Monitorare la larghezza del fiducial sul display del computer per il fuoco ottimale.
  3. Per una corretta centratura, aperto sia la parte superiore e percorsi di raggio inferiore. Regolare manualmente la lente obiettivo superiore mentre l'obiettivo di fondo è mantenuto costante utilizzando una coppia di micro-fine viti, finché le immagini fiduciali sono sovrapposti più vicino possibile, idealmente entro un pixel.
    1. Successivamente, eseguire regolazioni di precisione in modo che le immagini di riferimento nel punto 2.3 si sovrappongono all'interno di un decimo di pixel EMCCD. Regolare la parte superiore2 assi specchi piezoelettrici montati tramite il software di controllo mentre si tiene entrambe le lenti dell'obiettivo e la riflessione di fondo specchi costante. Confronta i centri dei fiducial della parte superiore e la parte inferiore di vista oggettivi tramite il display del computer per guidare il processo.

3. La calibrazione del Setup iPALM

NOTA: Poiché emissione di fluorescenza è incoerente, per interferenza da osservare in iPALM, l'lunghezze di percorso attraverso la parte superiore e inferiore obiettivi devono essere vicini l'uno all'altro, in pochi micron. Ciò può essere ottenuto come segue:

  1. Con i laser, le telecamere continuamente in streaming, ed entrambi i percorsi ottici superiore e inferiore aperta, oscillare il portacampioni z-piezo utilizzando una forma d'onda di tensione sinusoidale generata dal software di controllo per un continuo di oscillazione asse z su una grandezza di 400 nm .
  2. Sfruttando il fatto che, in posizione di allineamento ottimale, l'intensità fiducial varia poco con tegli oscillazione, tradurre manualmente il gruppo separatore di fascio motorizzato su o giù fino l'intensità dei oscilla fiduciali per effetto di interferenza singolo fotone desiderato. Questo significa la stretta corrispondenza delle cammino ottico. Un rapporto picco-valle> 10 può essere realizzato in casi ottimali (Figura 1D).
  3. Per garantire che sia l'ampiezza e fase in ciascuna superficie sono più uniforme possibile attraverso il campo, regolare lo specchio fondo del gruppo beam splitter piccoli passi per perfezionare il divario e gli angoli di inclinazione. Eseguire fascio splitter bene allineamento traducendo il campione in 8 nm z-passi oltre 800 nm.
    1. Monitorare l'intensità fiducial tra telecamere # 1 - 3. Regolare l'altezza, la posizione e l'inclinazione dello specchio inferiore nell'assieme beam splitter a piccoli passi, in modo tale che la fase di oscillazione della fotocamera # 1 rispetto alla telecamera # 2 è massimizzata, idealmente a 120 ° (Figura 1B-D).
    2. Dopo l'inizialel'allineamento è completo, tradurre il campione per la ricerca di un campo adeguato di vista che contiene sia le cellule di immagine e più fiducials nelle vicinanze. Posizionare un recinto intorno al sistema per bloccare la luce diffusa e perturbazioni ambientali. Una volta che l'area di esposizione viene trovata, eseguire la procedura al punto 3.4 di nuovo, e registrare la curva di calibrazione per l'utilizzo nelle successive z coordinata estrazioni utilizzando il comando "Acquisisci scansioni di calibrazione vs campione Piezo Posizione" nell'interfaccia principale.

4. Acquisizione dati

  1. Una volta che una zona desiderata viene trovato e la curva di calibrazione si ottiene, inserire i nomi dei file appropriati nel software. Aprire sia la parte superiore e percorsi di raggio inferiore. Aumentare la potenza di eccitazione del laser 642 nm al massimo. Per Alexa Fluor 647, può essere necessario un periodo iniziale di fluoroforo spegnimento (Figura 2A).
    1. Esporre con una costante di eccitazione 642 nm per 5 minuti, o più, se necessario, fino SImolecola ngle lampeggiante viene osservato (Figura 2B). Il software consente di incrementare automaticamente l'attivazione foto 405 nm durante il corso di acquisizione. Un gran numero di fotogrammi di acquisizione sono di solito necessari per le funzionalità filamentosi da essere chiaramente visibile (> 50.000 fotogrammi). Quando si è pronti, iniziare l'acquisizione di set di immagini crude utilizzando il comando "Start iPALM Acquisition" nell'interfaccia principale.
  2. Durante l'acquisizione, regolare il livello di fotoattivazione regolando l'intensità del laser 405 nm per mantenere la giusta densità lampeggiante come necessario (vedi esempi della Figura 2B).
    NOTA: Una volta che l'acquisizione è stata completata, il software permette di convertire automaticamente i file di immagine in formato binario corretto. L'archivio dati nel server calcolo viene montata come un'unità di rete, consentendo ai dati di essere copiati direttamente lì per l'ulteriore elaborazione.

5. Data Processinge analisi

  1. Eseguire l'analisi della localizzazione utilizzando un software personalizzato sviluppato per estrarre i parametri di best-fit per tutte le singole molecole, così come per i fiducial 11,15,23. Questo produce non solo i x, y-coordinate, ma anche l'intensità che viene utilizzato per l'analisi della curva di calibrazione.
    1. Importare i dati di calibrazione grezzi acquisiti nella fase 3.5 utilizzando il comando "Estrai Peaks più etichette" dal menu "File" per eseguire la localizzazione singola molecola. Dopo l'analisi iniziale di localizzazione, coordinate ottenute dalle telecamere # 1 - 3 sono presenti in canali rosso, verde e blu, rispettivamente, e possono essere salvati per ulteriori analisi utilizzando il comando "Salva elaborato come IDL (.sav)" nell'ambito del " menu File ".
  2. Per portare i dati dalle telecamere # 1 - 3 nella registrazione utilizzando i fiducial fluorescenti integrate sui vetrini, selezionare più fiducial luminose per fornire una copertura dell'immagine centrale (ad esempio,Figura 1B) utilizzando il comando "Anchor Fiducial punti" sotto il menu "Trasformazioni immagine". Utilizzare i set di triple di localizzazione coordinate dalle telecamere # 1 - 3 ottenuto dai fiducial brillanti nella fase 5.1 per calcolare la rotazione e ridimensionamento della matrice che porterà le telecamere # 1 e # 3 nel registro con la macchina fotografica # 2. Con un numero sufficientemente elevato di fiducial, di ordine superiore deformazione polinomio può essere eseguita per adatta meglio.
  3. Una volta che la matrice di trasformazione è calcolata, trasformare i dati grezzi di telecamere # 1 - 3 insieme per ottenere i dati grezzi sommati. Eseguire un altro giro di analisi di localizzazione per produrre un più precise x, y-coordinare e per determinare il contributo relativo di ciascun canale della telecamera per i dati grezzi sommati; utilizzare il comando "Transform Crudo, Salva e Salva Sum (.dat)" sotto il menu "Trasformazioni immagine". Questo rapporto di intensità contiene le informazioni coordinata z.
  4. Selezionare un fiduciale luminoso ed eseguire Z-calibrazione montaggio usando la funzione "Test Wind Point 3D" nella finestra di pop-up facendo clic su "Z-coordinare le operazioni" sotto il menu "Funzioni speciali". Questo si adatta funzioni 3-sinusoidali alle intensità dei 3 canali di telecamera per determinare la curva di calibrazione. Il file di calibrazione viene salvato per un ulteriore uso sui principali set di dati.
  5. Per verificare la qualità della curva di calibrazione, eseguire l'estrazione coordinata z, come descritto in precedenza 23. Per fiducials ben educati in un sistema ben calibrato, la coordinata z dovrebbe scalare linearmente, dal momento che i set di dati di calibrazione sono prese con uno sweep lineare z-posizione. Inoltre, gli z-posizioni di tutti fiducials dovrebbero scalare con una pendenza simile.
  6. Una volta che una calibrazione soddisfacente si ottiene, eseguire la localizzazione e l'analisi di trasformazione per i set di dati di immagine RAW acquisiti al punto 4 seguente stessa procedura descritta nei passaggi 5.1-5.3. Una volta fatto, caricare il file di calibrazione dal passaggio 5.4 ed eseguire l'estrazione z coordinata utilizzando le funzioni "Pick WND File" e "Estratto Z punto" nella finestra di pop-up facendo clic su "Z-coordinare le operazioni" sotto il menu "Funzioni speciali".
    NOTA: Dal momento che il tempo di acquisizione è> 15 min, deriva meccanico deve essere previsto.
  7. Per eseguire la correzione della deriva in x, y, selezionare un fiduciale luminoso dalle coordinate di localizzazione. Questo fiducial dovrebbe essere presente in tutti i fotogrammi. Quindi, utilizzare la x, deriva del fiduciali coordinata y per allineare tutte le altre coordinate entro lo stesso lasso di nuovo in registrazione (Figura 3A-B) con la funzione "Test / Scrivi Guide Star" sotto il menu "Trasformazioni immagine". Z-coordinare registrazione può essere eseguita in modo simile accedendo al "Test Guide Star" e le funzioni di "Write Guide Star" nella finestra pop-up facendo clic su "Z-coordinare le operazioni" sotto il menu "Funzioni speciali".
  8. Quando il campione può presentare leggera inclinazione, eseguire la correzione di inclinazione, fornendo i x, y, z-coordinate dei 3 punti di riferimento che definisce il piano che dovrebbe essere impostato il livello con la funzione "Elimina XYZ Tilt" nella finestra di pop-up facendo clic su " Z-coordinare le operazioni "nel menu" Funzioni speciali ".
  9. A seguito delle correzioni di deriva e di inclinazione, salvare le coordinate di localizzazione. Ricostruire immagine risoluzione eccellente per ulteriori analisi (Figura 4A-D) utilizzando il comando "Render" nell'interfaccia principale. Il colore può essere usato per indicare la coordinata z. In alternativa, una vista laterale della zona selezionata può anche essere reso. Le coordinate di localizzazione possono essere esportati come file di testo per l'ulteriore quantificazione, oppure l'immagine ricostruita possono essere salvati come file .tif.

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Risultati

requisiti critici per iPALM sono l'allineamento, la registrazione e la calibrazione dei sistemi ottici. Queste sono necessarie per garantire una corretta interferenza all'interno del 3-way beam splitter requisito per l'estrazione coordinata z. Per attivare il monitoraggio continuo, costante punto di fonti di fluorescenza sono necessari. Ciò può essere ottenuto mediante fluorescenza Au o nanoparticelle bimetalliche 23 la cui fotoluminescenza derivare da localizzat...

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Discussione

Il sistema ottico di iPALM si basa su un disegno obiettivo 4 π dual-opposti, come illustrato nella Figura 1A. La configurazione è costruito utilizzando parti sia custom-lavorati e commerciali opto-meccanici, come descritto in precedenza 23 ed elencati nella tabella 1. In aggiunta al nostro setup, l'Howard Hughes Medical Institute (HHMI) ospita un sistema che è accessibile alla comunità scientifica presso l'Advanced Imaging Center presso il Campus ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

YW e PK ringraziano sostegno finanziario della Fondazione Nazionale delle Ricerche di Singapore, assegnato a PK (NRF-NRFF-2011-04 e NRF2012NRF-CRP001-084). Ringraziamo anche il laboratorio e il nucleo di microscopia aperte strutture MBI per il supporto delle infrastrutture.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
optical tableNewport, CARS4000iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical tableNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055output power=100 mw
laser-561Newport, CA1168931output power=200 mw
laser-488Newport, CA1137970output power=200 mw
laser-405Newport, CA1142279output power=100 mw
broadband dielectric mirrorsThorlabs, NJBB1-E02laser combiner
dichroic beamsplitterSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optic tunable filterAA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear polarizerNewport, CA05LP-VIS-B
baseplatelocal workshopcustomized
turning mirror (22.5°)Reynard Corpporation, CAcustomized22.5° mirror
motorized optic mountsNew Focus, CA8816
motorized XYZ translation stageThorlabs, NJMT3/M-Z6sample holder
T-Cube DC servo motor controllerThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, GermanyS-303.CD
objective lensNikon, JapanMRD01691objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stageNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotary Solenoid/ShutterDACO Instruments, CT5423-458
3-way beam splitterRocky Mountain Instruments, COcustomizedbeamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, GermanyS-316.10
motorized five-axis tilt alignerNew Focus, CA8081
Picmotor ethernet controllerNew Focus, CA8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation modulePhysik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
band-pass filterSemrock, NYFF01-523/20filters
band-pass filterSemrock, NYFF01-588/21
band-pass filterSemrock, NYFF01-607/30
band-pass filterSemrock, NYFF01-676/37
notch filterSemrock, NYNF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronizationDellPrecision T3500PC, 4 sets
coverslips with fiducialHestzig, VA600-100AuFsample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectinMillipore, MTFC010
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16%
glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial FactorsLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287staining
sodium borohydride (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101imaging buffer
glucose oxidaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cysteamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415sample sealing
lanolinSigma aldrich, MOL7387
parafin waxSigma aldrich, MO327204
Immersion oilElectron Microscopy Sciences, PA16915-04imaging. Cargille Type HF

Riferimenti

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