JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Özet

Floresan mikroskopi hücreleri içinde belirli biyomoleküllerin doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan. Bununla birlikte, geleneksel floresan mikroskobu için, uzamsal çözünürlük optik eksen boyunca görüntü düzleminde ve> 500 nm olan ~ 200 nm ila kırınımı ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, floresan mikroskobu uzun ciddi hücre içinde ultrastrüktürel özellikler gözlem sınırlıdır. süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri son gelişmeler bu sınırlamanın üstesinden gelmiştir. Özellikle, photoswitchable fluorophores gelişi moleküler uzunlukta ölçeği yaklaşan çözme gücü sağlar yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi, sağlar. Burada, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu (iPALM) olarak adlandırılan tek-molekül yerelleştirme mikroskopi ve çok fazlı interferometriye dayalı üç boyutlu süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulanmasını açıklar. Bu yöntem neredeyse izotropik çözünürlük sağlarher üç boyutta da 20 nm sırası. iPALM aletin numune hazırlama ve işlemler dahil, ipliksi aktin hücre iskeleti görselleştirmek için protokoller, burada açıklanmıştır. Bu protokoller de hücrelerde diğer ultrastrüktürel özellikleri çalışma için kolaylıkla adapte ve öğreticidir.

Giriş

kompleks hücresel yapıların görselleştirme uzun biyolojik anlayışlar ve keşif ayrılmaz olmuştur. floresan mikroskopi, onun çözme gücü ~ 200 resim düzleminde nm (x, y, veya lateral boyut) ve> 500 nm optik eksen boyunca (z, ya da eksenel boyut) kırınım yüksek moleküler özgüllük ile görüntü hücreleri sınırlı olsa da 1,2. Bu nedenle, ultrastrüktürel özellikleri gözlem tarihsel elektron mikroskobu (EM) ile sınırlı kalmıştır. 100 nm aralığında 1-6 - Neyse, süper çözünürlük mikroskopisi son gelişme 10 uzaysal çözünürlüğü sağlayan bu sınırı hile vardır. Özellikle, süper çözünürlük gibi PALM (photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 4, FPALM (Floresan photoactivated Yerelleştirme Mikroskobu) 5 (d) STORM (doğrudan Stokastik Optik İmar Mikroskopi) 6,7, BOYA (as kısaltmaları tarafından bilinen tek bir molekül lokalizasyonu dayalı yaklaşımlar poGörüntüleme Nano Topografya) 8 için int Birikim, GSDIM (Ground Devlet tükenmesi Mikroskopi 9) bireysel moleküler dönüşü takiben, ya da SMACM (Tek Molekül Aktif Kontrol Mikroskopi) 10, yanı sıra bunların 3 boyutlu (3D) uygulamaları, interferometrik PALM (iPALM) 11 veya 3D-STORM 12, nöronal aksonlar, çok sayıda biyolojik yapıların nano örgüte yeni bakış açıları ortaya dahil olmak üzere değerli olmuştur ve fokal yapışıklıklar 14,15, hücre-hücre kavşak 16, nükleer 17 gözeneklerin, 13 sinapsların ve sentrozomlar 18-20, birkaç isim.

süper çözünürlüklü mikroskopi potansiyel olarak yararlı olduğu hücrelerde başka ultrastrüktürel özelliği aktin hücre iskeleti olduğunu. Hücre kortekste filamentli (f) aktin için kompleks ağ örgüsü hücre şekli ve mekanik özellikleri 21 kontrolünde önemli bir rol oynar. organizasyon of f-aktin aktif ve dinamik güçlü polimerizasyonu, çapraz bağlanmayı, ciro, istikrar ve ağ topolojisini 22 etkileyen çok sayıda düzenleyici proteinler olsa düzenlenir. Ancak, f-aktin ağ örgüsü mimarisinin karakterizasyonu hücresel süreçlerin çeşitli bir yelpazede, geleneksel kırınım sınırlı ışık mikroskobu ile kendi gözlemini engelleyen f-aktin filamentler küçük boyutlu (~ 8 nm) içine mekanistik anlayışlar için önemli olmasına rağmen; böylece, aktin ince yapısı görselleştirme, şimdiye kadar sadece EM ile yapılmaktadır. Burada, biz, yapışık memeli hücrelerinde f-aktin hücre iskeleti görselleştirmek 3D 11,23 yılında çok yüksek hassasiyetli yeteneği yararlanmak için iPALM süper çözünürlük mikroskopi tekniği kullanarak protokolleri açıklar. IPALM enstrüman son derece uzmanlaşmış olmasına rağmen, böyle bir araç kurma hakkında talimat, son zamanlarda 23 tarif edilmiştir Ho tarafından barındırılan iPALM mikroskop erişim sırasındakoğuş Hughes Tıp Enstitüsü de minimum maliyetle araştırma topluluğuna kullanılabilir hale getirilmiştir. Buna ek olarak, burada açıklanan numune hazırlama yöntemleri daha geniş mevcut gibi nokta dağılım fonksiyonu (PSF) ve astigmat odaktan uzaklaşma dayalı olanlar gibi alternatif 3D süper çözünürlük yaklaşımları, 12 veya bi-düzlem algılama 24, doğrudan uygulanabilir.

Biz genel olarak tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için gerekli bir maddedir yerine getirilmesi tek-molekül yerelleştirme tabanlı süper çözünürlük mikroskopi için üç kritik gereksinimleri izin veren photoswitchable fluorofor 25 olduğuna dikkat: i) yüksek tek-molekül arka plan sinyallerine parlaklık ve kontrast akraba; ii) Belirli bir resim çerçevesi içinde tek moleküllerin seyrek dağılımı; Ayrıca Nyquist-Sha olarak bilinen altta yatan yapının (profilini yakalamak için yeterli etiketleme ve iii) yüksek uzaysal yoğunluknnon örnekleme kriteri) 26. Bu nedenle, tatmin edici sonuçlar elde etmek için ağırlık florofor photoswitching optimize etmek ve altta yatan ultrastrüktürel korumak hem de deney cihazı ve alıcı yönleri için numunelerin uygun hazırlanması hem de eşit yerleştirilmelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Görüntüleme Numune Hazırlama

  1. Arka plan floresan sinyalleri florofor etiketlerden floresan ile etkileştikleri ilk (GKD 2 O) deiyonize suda durulama ve daha sonra basınçlı hava kullanarak hava-kurutma ile coverglasses temizleyin. Daha sonra, 15 saniye için bir plazma temizleme plazma aşındırma yerine veya gerekirse daha fazla.
  2. sürüklenme düzeltme ve iPALM kalibrasyon etkinleştirmek için, # 1.5 yuvarlak (22 mm çap) güvenilir kalibrasyon ve sürüklenme düzeltilmesi için olduğu gibi son derece ışığa, referanslar hizmet referans işaretleri gibi floresan nanopartiküller ile gömülü önceden temizlenmiş coverglasses kullanın. Nedeniyle yeterli fluorofor yoğunluğu birikir gereken uzun satın alma süresi (> 15 - 30 dk), örnek sürüklenme kaçınılmazdır.
  3. 6-çukurlu doku kültürü plakasının her bir fiducialed coverglass yerleştirin. 15 dakika boyunca, bir laminar akış başlığı içinde ultraviyole (UV) ışıma ile sterilize.
  4. Steril bir laminer akış kaputu, fibro hazırlamak10 ug / ml - bir nihai konsantrasyonda 2 steril Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) içinde 1 mg / ml stok çözeltisi fibronektin seyreltilerek coverglass kaplama adiponektin çözeltisi. Her DPBS ile üç kez coverglass durulayın ve 4 ° C'de bir gece fibronektin çözeltisinin 2 ml'si ile inkübe edin. Daha sonra, fibronektin çözüm aspirat ve DPBS ile bir kez yıkayın.
  5. DPBS kısaca hücreleri durulayın. hücreleri ayırmak ve taze serum içeren hücre kültür ortamının ~ 10 ml söndürün kadar 37 ° C 'de, bir kaç dakika boyunca tripsin, 2 ml 1 - kuluçkalayın. Örneğin, insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) için, daha büyük damar endotel faktörleri ve penisilin veya streptomisin ile desteklenmiş büyük damar endotel kültür ortamı kullanın.
    1. (Seyrek yoğunluğu, levha CO2 ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde, 37 ve #176 ° C.
  6. F-aktin hücre iskeletinin ince yapılarının uygun korunması için iyi, tampon reaktif 27 dayalı tampon çözümleri kullanın.
    1. Örneğin, bir 2 x stok çözeltisi olarak PHEM tamponu hazırlamak (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, KOH ile 4 mM MgCl2, pH 7.0) HEPES, 6.5 g, EGTA, 3.8 g, ve 190 mg arasında eritilmesi ile konsantre KOH çözeltisi damla damla ilave edilerek 7.0'a ayarlandı pH GKD 2 O ~ 300 ml 'si içinde MgCl2; Daha sonra, 500 ml hacim getirmek için GKD 2 O ekleyin. , 0.22 mikron filtre kullanılarak tampon sterilize 4 ° C sıcaklıkta saklayın ve bunu 1 sulandırmak: Kullanmadan önce GKD 2 O ile 1.
  7. f-aktin yüksek yoğunluklu etiketleme ile en iyi sonuçları elde etmek için, kullanım faloidin şöyle hücreleri düzeltmek, bu tür hücre şarjı sonra istenilen zaman noktasında Alexa Fluor 647 gibi organik fluorophores, konjuge:
    1. iyi ce içeren her kültürden medya aspirell örnek. Yavaşça ama çabuk% 0.25 Triton X-100 ile PHEM tamponu içinde% 0.25 glutaraldehid içeren sıcak (37 ° C) ekstraksiyon fiksatif 2 ml dağıtın. 2 dakika - 1, oda sıcaklığında inkübe edin. takip eden adımlar için sabitleyici 2 ml, ya da başka şekilde belirtilmediği sürece, coverglass başına tampon söndürülmesi.
    2. PHEM tampon maddesi içinde bir% 2.5 glutaraldehid fiksatif ile ekstre Fiksatif yerine ve numuneler 10 inkübe edin - 12 dakika. Bu ve takip eden adımlar tüm oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
    3. fiksatif dışarı aspire ve yavaşça PHEM tamponu ile değiştirin. Tilt ve girdap yavaşça ve sonra PHEM ile tekrar yıkayın. İki kez tekrarlayın.
    4. Istenen floroforlar gelen sinyalleri bastırmak PHEM içinde% 0.1 bir kütle konsantrasyonunda NaBH4 ihtiva eden yeni hazırlanmış bir söndürme tamponu ile numune inkübe olabilir glutaraldehit gelen otoflüoresanı, soğutulur. Miktarda kabarcık gözlemlenecektir. Bazen disl hafifçe örnek çanak dokununkabarcıklar odge. 10 dakika - bu 5 için inkübe edelim.
    5. Söndürme tampon dışarı aspire ve yavaşça PHEM tamponu ile değiştirin. kabarcıklar temizlemek için birkaç kez durulayın. PHEM 2 ml pipetle tampon ve 5 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin. İki kez tekrarlayın ve işiniz bittiğinde PHEM tamponunda örnek dinlendirin.
    6. GKD 2 O. 10 ml - Petri kabı cömertçe 5 ile nemlendirilmiş kağıt havlu parçası ile boşluklarla büyük bir plastik kullanarak inkübasyon faloidin için bir rutubet gözünün hazırlayın ıslak kağıt havlu üstüne temiz Parafilm büyük bir yaprak yerleştirin.
    7. Nedeniyle işaretlenmiş falloidinle nispeten yüksek maliyetine bağlı olarak, her bir etiketleme için küçük bir hacim kullanımı. Yüksek yoğunluklu etiketleme için 0.3 uM bir konsantrasyonda ile başlar. PHEM tamponu falloidin-Alexa Fluor 647 ile coverglass başına ~ 60 ul hazırlayın.
    8. Pipet 55 - nem odasında Parafilm tabaka üzerine falloidin çözeltisi 60 ul. Ince forseps kullanarak, hafifçe örnek coverg kaldırmakkız. Doğru hücre içeren yüzünü dikkat dikkatli olun.
    9. Hızlı ve yavaşça hassas emici bir kağıt katlanmış bir parça ile coverglass kenarına dokunarak aşırı tampon uzak dokunun ve ardından Parafilm Phalloidin solüsyonu damlasına üzerine aşağı bakacak şekilde coverglass hücre tarafı yerleştirin. coverglass tarafından yakalanan hava kabarcığı olmadığından emin olun.
    10. nem odası kapağı yerleştirin. Ortam ışıktan korumak için alüminyum folyo ile bölme sarın ve örnek 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Numune birkaç gün bu durumda muhafaza edilebilir. Uzun depolama planlanmış ise nem odası nemli kalır emin olun.
  8. görüntüleme önce hafifçe PHEM tamponu 2 mi çukur başına ihtiva eden yeni bir 6-yuvalı plaka üzerine coverglass ile yan yerleştirin.
  9. Aşağıdaki stok çözümleri kullanarak oksijen temizlenmiş tiyol-temelli görüntüleme tamponlar hazırlayın: 1 M glükoz, 1 M sistamin ve 100x glukoz oksidaz / katalaz enzimi MixtURE (katalaz 4 mg ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır PHEM tampon 100 ul, glukoz oksidaz, 10 mg), 28. Sağ görüntüleme önce, 1 M glükoz çözeltisinin 75 ul 1 M sisteamin çözeltisi 30 ul ve 100x hazır enzim karışımı 3 ul karıştırın. PHEM tamponu ile 300 ul ses seviyesini ayarlamak ve örnek monte karıştırma hemen sonra kullanın.
  10. iPALM için, önceden temizlenmiş # 1.5 coverglass (22 mm çap) ile görüntüleme örneği hazırlayın.
    1. Alternatif olarak, astigmatizma tabanlı 3D-STORM 12 yerine kullanılmak üzere ise mecliste yardımcı olmak için bir çift taraflı yapışkan ayırıcı ile bir cam slayt (3 "x 1") kullanın.
    2. görüntüleme örneği monte etmek için, yavaşça de tampon örnek coverglass kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Sonra, hızlı ve yavaşça katlanmış emici kağıt ile coverglass kenarına dokunarak aşırı tampon uzak dokunun.
    3. Temiz objektif bir kağıt parçası üzerinde yukarı bakacak şekilde coverglass hücre tarafı yerleştirin. örnek durulayın30 yerleştirerek - ve, numune üzerine görüntüleme tampon 50 ul eğerek ve katlanmış emici kağıt ile dokunarak fazla tampon kaldırmak.
    4. durulama adım birkaç kez tekrarlayın ve sonra 30 koyun - numune üzerine görüntüleme tampon 50 ul. Leke coverglass kenarını kurutun ve kurutulmuş alanı üzerine hızlı sertleşen epoksi birden çok küçük noktalar koyun.
    5. Yavaşça hücre içeren 22 mm coverglass merkezi üzerine başka önceden temizlenmiş # 1.5 coverglass (düz, yuvarlak coverglass, 18 mm çapında) indirin. Görüntüleme tampon kılcal etki ile her iki coverglasses ıslak olsun. Hızlı sertleşen epoksi küçük noktalar her iki coverglasses uymalıdır.
    6. Yavaşça basıncı eşit yaymak için katlanmış emici kağıt kullanılarak monte numune üzerine basın. Hatta örnek hücre ince ve (<15 mikron) yapmak için yeterli basınç kullanın, ancak hücreleri ezmek için çok fazla değil. Newton halkaları desen gözlemleyerek doğru kalınlığı ölçmek. Ayrıca, bu st gerçekleştirmek için emin olunep nazikçe hava kabarcıklarını en aza indirmek için. Gerekirse, önceden boş coverglasses birkaç kez uygulama.
  11. Eritilmiş vazelin-lanolin-parafin ile örnek Seal 29 (valap, hisse senedi, g vazelin, lanolin ve parafin her 100 hazırlanır birlikte eritilir), GKD 2 O ile mühürlü numune durulayın ve basınçlı hava ile kuru bir darbe. Örnek şimdi görüntüleme için mikroskop üzerine monte etmek için hazırdır.

2. Örnek Yerleştirme ve iPALM Hizalama

  1. numune tutucu çıkarılması için izin vermek için yukarıya doğru yaylı En objektif lens getirin. numune tutucu üzerine adım 1.10 hazırlanan mühürlü numune yerleştirin ve birkaç küçük nadir toprak mıknatıslar ile sabitleyin. Görüntüleme numunenin her iki tarafında immersiyon uygulanır. optik yoluna geri numune tutucu yerleştirin ve yavaşça üst objektif lens düşük.
  2. uyarma lazerler açın. (Elektron Çarpma Charge-Coupled Cihazda EMC açınçerçeve aktarım modunda CD) kamera.
    1. Uygun emisyon filtreleri döndürün. Üst ışın yolu (Şekil 1A) blok ve alt kiriş yolunu açmak için mekanik bir deklanşör etkinleştirin. Piezo çalıştırıcıyı kullanarak küçük artışlarla çeviri tarafından odak haline alt objektif lens getirin.
    2. yanlılık odak sonra, alt ışın yolunu bloke ederken üst ışın yolunu açmak ve benzer şekilde odak haline üst objektif lens getirmek. Optimum odak için bilgisayar ekranındaki miyar komponenti genişliğini izleyin.
  3. Uygun santralizasyonunun, üstü açık hem de alt kiriş yolları. alt amaç mikro-ince ayar vidalarının bir çift kullanarak sabit tutulurken referans görüntüler ideal bir piksel içinde, mümkün olduğunca yakından çakışan kadar elle üst objektif lens ayarlayın.
    1. Daha sonra, ince ayar yapmak bir EMCCD piksel onda biri içinde adımda fiducial görüntüleri 2.3 örtüşme böylece. üst ayarlayınkontrol yazılımı ile 2-eksenli piezo monte aynalar hem nesnel lensler tutarak ve alt yansıma sabit yansıtır. sürecine rehberlik etmek bilgisayar ekranı aracılığıyla üst fiducials ve alt objektif görüş merkezleri karşılaştırın.

iPALM Kur 3. Kalibrasyon

NOT: floresan emisyon tutarsız olduğundan parazit iPALM gözlenen için, yol üst yoluyla uzunlukları ve alt hedefler birkaç mikron içinde, birbirine yakın olmalıdır. aşağıdaki gibi elde edilebilir:

  1. kameralar sürekli akış ve hem üst hem de alt kiriş yolları açık, üzerinde lazerler ile, 400 nm büyüklükte üzerinde sürekli bir z-ekseni salınım için kontrol yazılımı tarafından üretilen bir sinüzoidal gerilim dalga formu kullanarak numune tutucusu z-piezo salınım .
  2. Aslında yararlanan, optimum uyum dışında olduğunu, referans yoğunluğu t küçük değişirO salınım manuel nedeniyle istenen tek foton girişim etkisi yukarı veya aşağı referans dolaşacaktır yoğunluğu kadar motorlu ışın ayırıcı takımını çevirmek. Bu optik yol uzunlukları yakın eşleştirme belirtir. > 10 bir tepe-Valley oranı uygun durumlarda (Şekil 1D) 'de elde edilebilir.
  3. boşluğu ve tilt açıları ince ayar için küçük adımlarla ışın ayırıcı montaj alt ayna ayarlamak, her yüzeyde genlik ve faz hem de alanın karşısındaki mümkün olduğunca tekdüze olmasını sağlamak için. 800 nm üzerinde 8 nm z-adımlarla örnek çevirerek ışın ayırıcı ince ayarı gerçekleştirin.
    1. Böyle kamera # salınım fazı 1 göreli kameraya 2. maksimize olduğunu, ideal olarak küçük adımlarla ışın ayırıcı montaj içinde alt aynanın yüksekliği, konumunu ve eğimini ayarlayın, 3. - kameralar 1. arasında yanlılık yoğunluğunu izlemek 120 ° (Şekil 1B-D).
    2. ilk kezhizalama tamamlandığında, yakın görüntü ve çoklu fiducials hem hücreleri içeren bir görüş alanına uygun taramak için örnek çevirmek. kaçak ışık ve ortam tedirginlikler engellemek için sistem etrafında bir muhafaza yerleştirin. Görüntüleme alanı bulunduğunda, yine adım 3.4 yordamı yürütmek ve ana arayüzünde "Örnek Piezo Pozisyonu vs Kalibrasyon tarar Edinme" komutunu kullanarak sonraki z koordinat çekimlerinde kullanılmak üzere kalibrasyon eğrisi kaydedin.

4. Veri Toplama

  1. istenen bölge bulunur ve kalibrasyon eğrisi elde edildikten sonra, yazılımın içine uygun dosya adlarını girin. üst ve alt kiriş yolları ikisini de açın. maksimum 642 nm lazer uyarma gücünü artırmak. Alexa Fluor 647 için kapatarak fluorofor bir başlangıç dönemi (Şekil 2A) ihtiyaç duyulabilir.
    1. si kadar 5 dakika veya gerektiğinde daha uzun bir süre sabit bir 642-nm eksitasyon ile açığaYanıp sönen ngle molekülü (Şekil 2B) görülmektedir. Yazılım satın alma sırasında 405 nm fotoğraf aktivasyon otomatik artmasını sağlar. ipliksi özellikler açıkça görünür olabilmesi için satın alma kare Büyük numaralar genellikle gereklidir (> 50.000 kare). Hazır olduğunuzda, ana arayüzünde komutu "Başlat iPALM Toplama" seçeneğini kullanarak ham görüntü setleri satın başlar.
  2. (Şekil 2B örneklere bakınız) gerektiği gibi satın alma sırasında, ayar 405-nm lazer yoğunluğu ayarlayarak fotoaktivasyon seviyesi uygun yanıp sönen yoğunluğunu korumak için.
    NOT: edinimi tamamlandığında, yazılım otomatik olarak uygun ikili biçime görüntü dosyalarını dönüştürmek olacaktır. hesaplama sunucusunda veri deposu veri doğrudan daha fazla işlenmek üzere orada kopyalanacak sağlayan bir ağ sürücüsü olarak monte edilir.

5. Veri İşlemeve Analiz

  1. Tüm tek moleküllerin yanı sıra fiducials 11,15,23 için en uygun parametreleri ayıklamak için geliştirilmiş özel bir yazılım kullanılarak yerelleştirme analizi yapın. Bu x, y-koordinatı, aynı zamanda kalibrasyon eğrisi analizi için kullanılan yoğunluğu sadece verir.
    1. komutunu kullanarak adım 3.5 edinilen ham kalibrasyon verilerini almak tek-molekül yerelleştirme yapmak için "Dosya" menüsünden "Peaks Çoklu Etiketlerin Özü". İlk yerelleştirme analizi takiben, 1 kamera # elde edilen koordinatları - 3 sırasıyla kırmızı, yeşil ve mavi kanalları mevcut ve altında komutu kullanarak daha fazla analiz için "(.sav) IDL olarak İşlenmiş kaydet" kaydedilebilir " dosya "menüsünden.
  2. Kameralar # 1 veri getirmek için - (lamelleri üzerinde gömülü floresan miyar komponentlerinin kullanarak kayıt içine 3 merkez görüntünün kapsama sağlamak için birkaç parlak, referanslar seçin, örneğin,"Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Çapa Fiducial Noktaları" komutunu kullanarak Şekil 1B). Kamera # 2 ile kayıt içine kameralar 1. ve 3. getirecek dönme ve ölçekleme matris hesaplamak için adım 5.1 parlak fiducials elde edilen 3 - yerelleştirme kameralar 1. koordinatları üçlü setleri kullanın. miyar yeterince büyük bir sayı ile daha yüksek dereceden polinom çözgü iyi uyuyor için yapılabilir.
  3. özetlenebilir ham verileri elde etmek için bir araya 3 - dönüşüm matrisi hesaplandıktan sonra, kameralar 1. ham verilerini dönüştürmek. y koordinatı ve toplanır ham verilere her kamera kanalının göreli katkısını belirlemek için, daha kesin x elde etmek için yerelleştirme analizi başka yuvarlak gerçekleştirin; Komut "Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Raw, Kaydet ve Kaydet Sum (.dat) Transform" kullanın. Bu yoğunluk oranı z koordinat bilgileri içerir.
  4. parlak Fiducial seçin ve z gerçekleştirmekKalibrasyon "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak açılan iletişim işlevi "Test Wind Point 3D" seçeneğini kullanarak uydurma. Bu kalibrasyon eğrisi belirlemek için 3 kamera kanallarının şiddetleri 3-sinüs fonksiyonları uyacaktır. Kalibrasyon dosyası, daha sonra ana veri kümeleri üzerinde ileride kullanılmak üzere kaydedilir.
  5. Kalibrasyon eğrisinin kalitesini test etmek için, daha önce tarif edildiği gibi 23, çıkarma Z koordinatı gerçekleştirin. Kalibrasyon veri setleri z konumunda doğrusal süpürme ile alınır çünkü iyi kalibre sistemde uslu fiducials için, z koordinatlı, doğrusal ölçek gerekir. Ayrıca, tüm fiducials z-pozisyonları benzer bir eğimle ölçekli olmalıdır.
  6. tatmin edici bir kalibrasyon elde edildikten sonra, adım 5,1-5,3 özetlenen aynı prosedür takip 4. adımda elde edilen ham görüntü veri setleri için yerelleştirme ve dönüşüm analizi gerçekleştirmek. Bittiğinde, adım 5 kalibrasyon dosyasını yüklemek.4 ve gerçekleştirmek "WND Dosya seç" ve "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak açılan iletişim kutusunda "Z Koordinat Extract" fonksiyonlarını kullanarak çıkarma z koordinatı.
    NOT: kazanım süresi> 15 dakika olduğundan, mekanik sürüklenme beklenebilir.
  7. x sürüklenme düzeltme gerçekleştirmek için, y, yerelleştirme koordinatlardan parlak bir referans seçin. Bu referans tüm çerçeveler mevcut olmalıdır. Ardından, "Görüntü Dönüşümler" menüsü altında "Kılavuzu Yıldız yazın / Testi" işlevini kullanarak (Şekil 3A-B) kayıt içine tekrar aynı çerçevede diğer tüm koordinatları hizalamak için miyar komponenti sürüklenme y koordinatı, x kullanabilirsiniz. Z-koordinat kaydı "Özel Fonksiyonlar" menüsü altında "Operasyon Z koordinatı" tıklayarak "Test Kılavuzu Yıldızı" ve pop-up iletişim "Guide Yıldız yazın" fonksiyonları erişerek benzer yapılabilir.
  8. Numune hafif eğim gösterebilir gibi, "tıklayarak açılan iletişim kutusunda" XYZ Tilt Kaldır "fonksiyonunu kullanarak düzeyini ayarlamak gerekir uçağı tanımlayan 3 referans noktalarının x, y, z koordinatlarını vererek eğim düzeltme yapmak Özel Fonksiyonlar "menüsünden" altında "Operasyon Z koordinatı.
  9. Sürüklenme ve eğim düzeltmeleri ardından, yerelleştirme koordinatlarını kaydedin. Ana arayüzü "Render" komutunu kullanarak daha fazla analiz (Şekil 4A-D) için süper çözünürlük görüntüyü yeniden. Renk Z koordinatı belirtmek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, seçilen alan bir yandan görünüşüdür da kılınabilir. yerelleştirme koordinatları daha ölçümü için metin dosyaları olarak ihraç edilebilir veya yeniden görüntü tif dosyası olarak kaydedilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

iPALM için kritik şartlar optik sistemlerin hizalama, kayıt ve kalibrasyon vardır. çıkarma z koordinatı için bu 3 yollu ışın ayırıcı koşul içinde uygun girişim sağlamak için gereklidir. sürekli izleme etkinleştirmek için, floresan sabit nokta kaynağı gereklidir. Bu flüoresan Au veya olan Fotolüminesans lokalize yüzey plazmon rezonansı (lspr) ortaya bimetalik nano-tanecikleri 23 kullanılarak elde edilebilir. Onlar aydınlatma üzerine kararlı bir t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Şekil 1A 'de gösterildiği gibi iPALM optik sistemi, 4-π çift karşıt amaçlı tasarım dayanmaktadır. Tablo 1'de önceki 23 anlatıldığı ve listelenen kurulum, özel işlenmiş ve ticari opto-mekanik parçalar kullanılarak inşa edilmiştir. Bizim kurulumuna ek olarak, Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Janelia Araştırma Kampüsü'nde İleri Görüntüleme Merkezi bilim dünyası için erişilebilir bir sistem barındırır. Tam me...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

YW ve PK minnetle PK (NRF-NRFF-2011-04 ve NRF2012NRF-CRP001-084) verilir Singapur Ulusal Araştırma Vakfı, finansman desteği kabul. Biz de altyapı desteği için MTE açık laboratuvar ve mikroskopi çekirdek imkanları teşekkür ederim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
optical tableNewport, CARS4000iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical tableNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055output power=100 mw
laser-561Newport, CA1168931output power=200 mw
laser-488Newport, CA1137970output power=200 mw
laser-405Newport, CA1142279output power=100 mw
broadband dielectric mirrorsThorlabs, NJBB1-E02laser combiner
dichroic beamsplitterSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optic tunable filterAA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear polarizerNewport, CA05LP-VIS-B
baseplatelocal workshopcustomized
turning mirror (22.5°)Reynard Corpporation, CAcustomized22.5° mirror
motorized optic mountsNew Focus, CA8816
motorized XYZ translation stageThorlabs, NJMT3/M-Z6sample holder
T-Cube DC servo motor controllerThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, GermanyS-303.CD
objective lensNikon, JapanMRD01691objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stageNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotary Solenoid/ShutterDACO Instruments, CT5423-458
3-way beam splitterRocky Mountain Instruments, COcustomizedbeamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, GermanyS-316.10
motorized five-axis tilt alignerNew Focus, CA8081
Picmotor ethernet controllerNew Focus, CA8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation modulePhysik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
band-pass filterSemrock, NYFF01-523/20filters
band-pass filterSemrock, NYFF01-588/21
band-pass filterSemrock, NYFF01-607/30
band-pass filterSemrock, NYFF01-676/37
notch filterSemrock, NYNF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronizationDellPrecision T3500PC, 4 sets
coverslips with fiducialHestzig, VA600-100AuFsample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectinMillipore, MTFC010
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16%
glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial FactorsLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287staining
sodium borohydride (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101imaging buffer
glucose oxidaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cysteamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415sample sealing
lanolinSigma aldrich, MOL7387
parafin waxSigma aldrich, MO327204
Immersion oilElectron Microscopy Sciences, PA16915-04imaging. Cargille Type HF

Referanslar

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyofizikSay 118S per z n rl k mikroskopiPALMiPALMFloresanF aktinTek Molek l Yerelle tirmePhotoswitchable Fl oroforlarnterferometre

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır