Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Résumé

Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.

Résumé

La microscopie à fluorescence permet la visualisation directe de biomolécules spécifiques dans les cellules. Cependant, pour la microscopie par fluorescence classique, la résolution spatiale est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image et> 500 nm le long de l'axe optique. Par conséquent, la microscopie par fluorescence a longtemps été sévèrement limité à l'observation des caractéristiques ultrastructurales dans les cellules. Le développement récent des méthodes de microscopie super-résolution a surmonté cette limitation. En particulier, l'avènement de fluorophores photoswitchable permet de super résolution microscopie à base de localisation, ce qui fournit un pouvoir de résolution approcher l'échelle moléculaire longueur. Ici, nous décrivons l'application d'une méthode ultra tridimensionnelle résolution microscopie basée sur une seule molécule microscopie localisation et interférométrie polyphasique, appelé interférométrique photoactive Localisation Microscopie (iPALM). Cette méthode offre une résolution quasi isotrope sur laordre de 20 nm dans les trois dimensions. Des protocoles pour la visualisation du cytosquelette d'actine filamenteuse, y compris la préparation des échantillons et le fonctionnement de l'instrument iPALM, sont décrits ici. Ces protocoles sont également facilement adaptable et instructif pour l'étude d'autres caractéristiques ultrastructurales dans les cellules.

Introduction

La visualisation des structures cellulaires complexes depuis longtemps partie intégrante de connaissances biologiques et de découverte. Bien que la microscopie de fluorescence peut imager des cellules ayant une spécificité moléculaire élevée, son pouvoir de résolution est limitée par la diffraction à ~ 200 nm dans le plan d'image (x, y ou dimension latérale), et> 500 nm le long de l'axe optique (z, ou dimension axiale) ^1,2. Par conséquent, l'observation des caractéristiques ultrastructurales ont toujours été limitées à la microscopie électronique (EM). Heureusement, le développement récent de nanoscope a contourné cette limite, ce qui permet une résolution spatiale dans le 10 - gamme de 100 nm ^1-6. En particulier, super résolution approches basées sur la localisation unique molécule, connue par des acronymes tels que PALM (photoactive Localisation Microscopy) ^4, FPALM (Fluorescence photoactive Localisation Microscopy) ⁵ (d) STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) ^6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topographie) ^8, GSDIM (État sol Depletion Microscopie suivi par retour moléculaire individuel) ^9, ou SMACM (Single-Molecule Active-contrôle Microscopy) ^10, ainsi que leurs (3D) implémentations 3 dimensions, telles que PALM interférométrique (iPALM) ¹¹ ou 3D-STORM ^12, ont été précieux pour révéler de nouvelles perspectives dans l'organisation à l' échelle nanométrique de nombreuses structures biologiques, y compris les axones neuronaux et synapses ^13, adhérences focales ^14,15, jonctions cellule-cellule ^16, les pores nucléaires ¹⁷ et centrosomes ^18-20, pour ne citer que quelques - uns.

Une autre caractéristique ultrastructural dans les cellules pour lesquelles nanoscope est potentiellement utile est le cytosquelette d'actine. Le maillage complexe de filamenteuse (f) actine dans le cortex cellulaire joue un rôle essentiel dans le contrôle de la forme cellulaire et les propriétés mécaniques ^21. L'organisation of f-actine est active et dynamique régulée si de nombreuses protéines régulatrices qui influencent fortement la polymérisation, la réticulation, le chiffre d' affaires, la stabilité et la topologie du réseau ^22. Cependant, bien que la caractérisation de l'architecture meshwork f-actine est important pour des idées mécanistes dans un large éventail de processus cellulaires, la petite taille (~ 8 nm) des filaments f-actine entrave leur observation par microscopie optique conventionnelle limitée par la diffraction; ainsi, la visualisation de structure fine actine a jusqu'à présent été exclusivement réalisé par EM. Ici, nous décrivons les protocoles pour visualiser le cytosquelette d'actine F dans les cellules de mammifères adhérentes, en utilisant la technique de microscopie super résolution iPALM pour tirer parti de sa capacité de très haute précision en 3D ^11,23. Bien que l'instrument iPALM est hautement spécialisée, des instructions sur la mise en place d' un tel instrument a été récemment décrit ^23, alors que l' accès au microscope iPALM hébergé par le Hopupille Hughes Medical Institute a également été mis à la disposition de la communauté scientifique à un coût minime. En outre, les méthodes de préparation des échantillons décrits ici sont directement applicables à d' autres approches 3D super - résolution, tels que ceux basés sur défocalisation astigmate de la fonction d'étalement de point (PSF) ¹² ou bi-plan de détection ^24, qui sont plus largement disponibles.

Nous notons qu'un ingrédient nécessaire pour la microscopie de super - résolution basée sur la localisation unique de molécule en général est le fluorophore photoswitchable ^25, qui permet aux trois exigences critiques pour la microscopie super - résolution basée sur la localisation unique de molécule à être remplies: i) élevé seule molécule luminosité et le contraste par rapport aux signaux d'arrière-plan; ii) la distribution clairsemée de molécules simples dans une trame d'image donnée; et iii) de haute densité spatiale d'étiquetage suffisant pour capturer le profil de la structure sous-jacente (également connue sous le nom de Nyquist-Shacritère d'échantillonnage nLes) ^26. Ainsi, pour obtenir des résultats satisfaisants, l'accent doit être mis aussi à la fois sur la bonne préparation des échantillons pour optimiser fluorophore photocommutation et de préserver l'ultrastructure sous-jacent, ainsi que sur les instruments et d'acquisition aspects des expériences.

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Protocole

1. Préparation des échantillons d'imagerie

1. Comme les signaux de fluorescence de fond interfèrent avec la fluorescence des étiquettes fluorophores, nettoyer les couvre - objets d'abord les rincer dans de l'eau déminéralisée (ddH ₂ O), puis les séchage à l' air à l'air comprimé. Par la suite, effectuer une gravure par plasma dans un nettoyeur à plasma pendant 15 secondes, ou plus si nécessaire.
2. Pour activer la correction de la dérive et de l'étalonnage iPALM, utilisez # 1.5 ronde (diamètre 22 mm) couvre-objets préalablement nettoyées embarqués avec des nanoparticules fluorescentes comme points repères qui servent fiducials comme hautement photostables pour l'étalonnage fiable et correction de la dérive. En raison du long temps d'acquisition requise pour accumuler la densité fluorophore suffisante (> 15 - 30 min), la dérive de l'échantillon est inévitable.
3. Placez chaque lamelle fiducialed dans une plaque de culture de tissus à 6 puits. Stériliser par rayonnement ultraviolet (UV) dans une hotte à flux laminaire pendant 15 min.
4. Dans une hotte à flux laminaire stérile, préparer fibronectine solution pour le revêtement coverglass en diluant 1 mg ml solution mère / fibronectine dans un tampon phosphate stérile une solution saline de Dulbecco (DPBS) à une concentration finale 2-10 ug / ml. Rincer chaque lamelle trois fois avec du DPBS et incuber avec 2 ml de la solution de fibronectine pendant une nuit à 4 ° C. Par la suite, aspirez la solution de fibronectine et rincer une fois avec DPBS.
5. Rincer les cellules brièvement avec DPBS. Incuber avec 1 - 2 ml de trypsine pendant quelques minutes à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent et étancher avec ~ 10 ml de milieu de culture cellulaire contenant du sérum frais. Par exemple, pour les cellules humaines ombilicales veine endothéliales (HUVEC), utiliser un grand milieu de culture navire endothéliale complétée avec de grands facteurs navire endothéliales et de la pénicilline ou la streptomycine.
   1. Réensemencement les cellules sur la lamelle de fibronectine (pour la densité clairsemée, plaque <50.000 cellules par lamelle) et maintenir la culture dans un incubateur réglé à 95% d' humidité, 5% de CO _2, et 37 & #176; C.
6. Pour une bonne conservation des structures fines du cytosquelette f-actine, utiliser des solutions tampons en fonction des réactifs tampons de bonnes ^27.
   1. Par exemple, préparer un tampon de MEHP comme solution 2x mère (PIPES 120 mM, HEPES 50 mM , EGTA 20, 4 mM de _MgCl2, pH 7,0 avec KOH) en dissolvant 6,5 g d'HEPES, 3,8 g d'EGTA et 190 mg de MgCl ₂ dans ~ 300 ml d'ddH ₂ O, avec le pH ajusté à 7,0 par addition goutte à goutte d' une solution de KOH concentrée; puis ajouter ddH ₂ O pour amener le volume à 500 ml. Stériliser le tampon en utilisant un filtre de 0,22 um, le stocker à 4 ° C, et diluer 1: 1 avec ddH ₂ O avant utilisation.
7. Pour obtenir les meilleurs résultats avec un étiquetage de haute densité de la F-actine, on utilise la phalloïdine conjuguée avec des fluorophores organiques, tels que Alexa Fluor 647. Au point de temps souhaité après réensemencement des cellules, fixer les cellules comme suit:
   1. Aspirer les médias de chaque puits de culture contenant le CEspécimen ll. Doucement mais passer rapidement de 2 ml d'eau tiède (37 ° C), des fixateurs d'extraction contenant 0,25% de glutaraldéhyde dans un tampon de MEHP avec 0,25% de Triton X-100. Incuber à température ambiante pendant 1 - 2 min. Pour les étapes suivantes, en utilisant 2 ml de fixatif ou d'un tampon de trempe par lamelle, sauf indication contraire.
   2. Remplacer le fixateur d'extraction avec un glutaraldéhyde fixateur de 2,5% dans un tampon MEHP et laisser les échantillons incuber pendant 10-12 min. Ceci et les étapes suivantes sont toutes réalisées à température ambiante.
   3. Aspirer les fixateurs et doucement les remplacer avec un tampon de MEHP. Tilt et agiter doucement, puis lavez à nouveau avec MEHP. Répéter deux fois.
   4. Pour étancher l' autofluorescence de glutaraldéhyde, ce qui peut submerger les signaux provenant des fluorophores souhaités, incuber les échantillons avec un tampon de trempe fraîchement préparée contenant du NaBH ₄ à une concentration massique de 0,1% dans les MEHP. bulles profuses seront observées. appuyez sur le plat à l'occasion de l'échantillon doucement pour Dislodge les bulles. Laisser incuber pendant 5 - 10 min.
   5. Aspirer le tampon de trempe et doucement le remplacer avec un tampon de MEHP. Rincez plusieurs fois pour enlever les bulles. Pipette dans 2 ml de MEHP tampon et laisser incuber dans l'obscurité pendant 5 min. Répéter deux fois et laisser l'échantillon reste dans un tampon MEHP lorsque vous avez terminé.
   6. Préparer une chambre d'humidité pour phalloïdine incubation en utilisant une grande boîte de Pétri en plastique rembourrée avec un morceau de serviette en papier généreusement humidifié avec 5 - 10 ml de ddH ₂ O. Placez une grande feuille de Parafilm propre sur le dessus de la serviette en papier humide.
   7. En raison du coût relativement élevé de phalloïdine marquée, utilisez un petit volume pour chaque étiquetage. Pour l'étiquetage de haute densité, commencer avec une concentration de 0,3 uM. Préparer ~ 60 pi par lamelle en utilisant phalloïdine-Alexa Fluor 647 dans un tampon MEHP.
   8. Introduire à la pipette 55 - 60 ul de la solution de phalloïdine sur la feuille de Parafilm dans la chambre d'humidité. En utilisant des pinces fines, retirez délicatement le coverg spécimenfille. Veillez à noter le visage contenant des cellules correctes.
   9. appuyez rapidement et doucement l'excès de tampon en touchant le bord de la lamelle avec un morceau de papier plié absorbant délicat, puis placer le côté de la cellule coverglass vers le bas sur la goutte de solution de phalloïdine sur le Parafilm. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles piégées par la lamelle.
   10. Placez le couvercle sur la chambre d'humidité. Enveloppez la chambre dans une feuille d'aluminium pour le protéger de la lumière ambiante, et de laisser l'échantillon incuber une nuit à 4 ° C. L'échantillon peut être conservé dans cet état pendant plusieurs jours. Assurez-vous que la chambre d'humidité reste humide si le stockage à long est prévu.
8. Avant imagerie, placez doucement le côté de la cellule coverglass vers le haut sur une nouvelle plaque de 6 puits contenant 2 ml de tampon de MEHP par puits.
9. Préparation des tampons d'imagerie à base de thiol de l'oxygène en utilisant les balayé les solutions mères suivantes: 1 M de glucose, 1 M cystéamine et 100x glucose oxydase / catalase mixte de l'enzymeure (4 mg de catalase et 10 mg de glucose oxydase dans 100 ul de tampon de MEHP, bien mélangés par tourbillonnement ^28). Juste avant l'imagerie, mélanger 75 pi de 1 M solution de glucose, 30 pi de solution 1 M de cystéamine et 3 pl de 100x mélange stock enzyme. Réglez le volume à 300 pi avec un tampon de MEHP et utiliser immédiatement après le mélange pour monter l'échantillon.
10. Pour iPALM, préparer l'échantillon d'imagerie utilisant un pré-nettoyé # 1.5 coverglass (diamètre 22 mm).
    1. Vous pouvez également utiliser une lame de verre (3 "x 1") avec un adhésif double face entretoise à l' aide dans l'ensemble si elle est basée astigmatisme-3D-STORM ¹² doit être utilisé à la place.
    2. Pour assembler l'échantillon d'imagerie, utilisez une pince fine pour enlever délicatement la lamelle d'échantillon du puits de tampon. Puis, rapidement et doucement tapoter l'excès de tampon en touchant le bord de la lamelle avec du papier absorbant plié.
    3. Placez le côté de la cellule de lamelle orientée vers le haut sur un morceau de papier de verre propre. Rincer l'échantillonen plaçant 30 - 50 pi de tampon d'imagerie sur l'échantillon, et enlever l'excès de tampon en inclinant et en tapotant avec du papier absorbant plié.
    4. Répétez l'étape de rinçage à quelques reprises, puis placer 30 - 50 pi de tampon d'imagerie sur l'échantillon. Séchez le bord de la lamelle et placez plusieurs très petits points d'époxy à durcissement rapide sur la zone sèche.
    5. Abaissez lentement une autre pré-nettoyée # 1.5 lamelle (lamelle rond, diamètre brut, 18 mm) sur le centre de la 22-mm coverglass contenant des cellules. Laisser le tampon d'imagerie mouille les deux couvre-objets par capillarité. Les petits points d'époxy à durcissement rapide doivent respecter les deux couvre-objets.
    6. Appuyez doucement sur l'échantillon assemblé à l'aide de papier absorbant plié pour répartir la pression uniformément. Utiliser une pression suffisante pour que l'échantillon de cellules minces et même (<15 pm), mais pas autant que pour écraser les cellules. Jauge l'épaisseur correcte en observant des anneaux de motif de Newton. Aussi, assurez-vous d'effectuer cette step doucement pour minimiser les bulles d'air. Si nécessaire, pratiquer avec couvre-objets vides plusieurs fois au préalable.
11. Sceller l'échantillon avec fondu Vaseline-lanoline paraffine (valap, Stock préparé à partir de 100 g chacune de gelée de pétrole, la lanoline, et de la paraffine, fondus ensemble) ^29, rincer l'échantillon scellé avec ddH ₂ O, et sécher à l' air comprimé. L'échantillon est maintenant prêt à être monté sur le microscope pour l'imagerie.

2. Placement de l'échantillon et l'alignement iPALM

1. Déplacer la lentille d'objectif supérieure d'un ressort vers le haut pour permettre le retrait du porte-échantillon. Placer l'échantillon scellé préparés à l'étape 1.10 sur le porte-échantillon et le fixer avec plusieurs petits aimants de terres rares. Appliquer de l'huile d'immersion des deux côtés de l'échantillon de formation d'image. Placez le porte-échantillon de nouveau dans le chemin optique et abaissez doucement la lentille supérieure objectif.
2. Allumez les lasers d'excitation. Allumez le périphérique Electron Multipliant Charge-Coupled (EMCCD) appareil photo en mode de transfert de trame.
   1. Faire pivoter les filtres d'émission appropriés. Activer un obturateur mécanique pour bloquer le trajet du faisceau haut (figure 1A) et d' ouvrir le trajet du faisceau inférieur. Apportez l'objectif de fond au point par translation par petits incréments à l'aide de l'actionneur piézo-électrique.
   2. Une fois que le fiducial est mis au point, ouvrir le chemin de poutre supérieure tout en bloquant la trajectoire du faisceau de fond et porter l'objectif haut dans le foyer d'une manière similaire. Surveiller la largeur de la mire sur l'écran d'ordinateur pour la mise au point optimale.
3. Pour centration appropriée, ouvert à la fois le haut et les chemins de faisceau bas. Ajustez manuellement la lentille objectif prioritaire tandis que l'objectif de fond est maintenue constante à l'aide d'une paire de micro-fine les vis de réglage, jusqu'à ce que les images repères se chevauchent aussi étroitement que possible, idéalement au sein d'un pixel.
   1. Par la suite, effectuer des réglages fins pour que les images repères dans l'étape 2.3 chevauchement au sein d'un dixième de pixel EMCCD. Réglez le hautmiroirs piézoélectriques montés 2 axes via le logiciel de contrôle tout en maintenant les deux lentilles de l'objectif et la réflexion de fond miroirs constant. Comparez les centres des mires de haut et les vues de dessous objectives via l'écran d'ordinateur pour guider le processus.

3. Calibrage de la configuration iPALM

NOTE: Depuis l' émission de fluorescence est incohérente, d'interférence à observer dans iPALM, le chemin longueurs par le haut et les objectifs de fond doit être proche de l'autre, à quelques microns. Ceci peut être réalisé comme suit:

1. Avec les lasers sur les caméras flux continu, et les deux trajectoires de rayon supérieur et inférieur ouvert, faire osciller le porte-échantillon z piézoélectrique en utilisant une forme d'onde de tension sinusoïdale générée par le logiciel de commande pour une oscillation continue de l'axe z sur une amplitude de 400 nm, .
2. En profitant du fait que, lors de l'alignement optimal, l'intensité de repère varie peu avec le til oscillation, traduire manuellement l'ensemble de diviseur de faisceau motorisé vers le haut ou vers le bas jusqu'à ce que l'intensité des repères oscille en raison de l'effet désiré d'interférence à photon unique. Cela signifie la concordance étroite des longueurs de trajet optique. Un rapport de pic à vallée> 10 peut être réalisé dans le meilleur des cas (figure 1D).
3. Pour veiller à ce que l'amplitude et la phase à chaque surface sont aussi uniforme que possible à travers le champ, régler le miroir de fond de l'ensemble de diviseur de faisceau en petites étapes pour affiner l'écart et les angles d'inclinaison. Effectuer diviseur de faisceau alignement fin en traduisant l'échantillon dans 8 nm z étapes de plus de 800 nm.
   1. Surveiller l'intensité fiducial entre les caméras n ° 1 - 3. Réglez la hauteur, la position, et l'inclinaison du miroir de fond dans l'ensemble de diviseur de faisceau en petites étapes, de telle sorte que la phase d'oscillation de la caméra # 1 par rapport à la caméra n ° 2 est maximisée, idéalement à 120 ° (figure 1B-D).
   2. Une fois que le premieralignement est terminé, traduire l'échantillon à analyser pour un champ de vision approprié qui contient les deux cellules à l'image et plusieurs mires à proximité. Placez une enceinte autour du système pour bloquer la lumière parasite et les perturbations ambiantes. Une fois que la zone d'imagerie est trouvé, effectuer la procédure à l'étape 3.4 à nouveau, et enregistrer la courbe d'étalonnage pour une utilisation dans z coordonnées suivantes extractions en utilisant la commande "Acquisition d'étalonnage Scans vs Piezo Sample Position" dans l'interface principale.

4. Acquisition de données

1. Une fois qu'une zone souhaitée est trouvée et la courbe d'étalonnage est obtenue, entrez les noms de fichiers appropriés dans le logiciel. Ouvrez le dessus et les chemins de faisceau bas. Augmenter la puissance d'excitation du laser à 642 nm au maximum. Pour Alexa Fluor 647, une période initiale de mise hors fluorophore peut être nécessaire (figure 2A).
   1. Expose avec une excitation constante 642 nm pendant 5 minutes, ou plus si nécessaire, jusqu'à ce que simolécule ngle clignotante est observée (figure 2B). Le logiciel permet une augmentation automatique de 405-nm photo activation au cours de l'acquisition. Un grand nombre de cadres d'acquisition sont généralement nécessaires pour les fonctions filamenteuses d'être clairement visible (> 50.000 cadres). Lorsque vous êtes prêt, commencer l'acquisition d'ensembles d'images brutes en utilisant la commande "Start iPALM Acquisition" dans l'interface principale.
2. Lors de l'acquisition, réglez le niveau de photoactivation en ajustant l'intensité du laser de 405 nm pour maintenir la densité clignotante appropriée au besoin (voir les exemples dans la figure 2B).
   NOTE: Une fois que l'acquisition est terminée, le logiciel convertit automatiquement les fichiers d'image dans le format binaire approprié. Le référentiel de données dans le serveur de calcul est monté en tant que lecteur réseau, ce qui permet aux données d'être copiées directement là pour un traitement ultérieur.

5. Traitement des donnéeset analyse

1. Effectuer une analyse de localisation à l' aide d' un logiciel développé sur mesure pour extraire des paramètres les mieux adaptées pour toutes les molécules simples, ainsi que pour les mires ^11,15,23. On obtient ainsi non seulement les coordonnées x, y de coordonnées, mais aussi l'intensité qui est utilisée pour l'analyse de la courbe d'étalonnage.
   1. Importer les données d'étalonnage premières acquises à l'étape 3.5 en utilisant la commande "Extraire Peaks multiples étiquettes" dans le menu "Fichier" pour effectuer la localisation seule molécule. Suite à l'analyse initiale de localisation, coordonnées obtenues à partir de caméras # 1 - 3 sont présents dans les canaux, respectivement rouge, vert et bleu, et peuvent être sauvegardés pour une analyse ultérieure en utilisant la commande "Enregistrer traité comme IDL (.sav)" sous la rubrique " fichier "menu.
2. Pour apporter des données à partir de caméras # 1 - 3 dans l' enregistrement à l' aide des repères fluorescents embarqués sur les lamelles, sélectionner plusieurs repères lumineux pour fournir une couverture de l'image centrale (par exemple,Figure 1B) en utilisant la commande "Points Anchor repères" sous le menu "Transformations d'images". Utilisez les ensembles triples de coordonnées de localisation à partir de caméras # 1 - 3 obtenus à partir des repères lumineux à l'étape 5.1 pour calculer la rotation et de la matrice mise à l'échelle qui va apporter des caméras n ° 1 et n ° 3 dans le registre avec la caméra n ° 2. Avec un nombre suffisamment important de repères, d'ordre supérieur gauchissement polynôme peut être effectuée pour mieux adaptée.
3. Une fois que la matrice de transformation est calculée, de transformer les données brutes des caméras n ° 1 - 3, ainsi que pour obtenir les données brutes sommées. Effectuez une autre série d'analyses de localisation pour obtenir un plus précis x, y coordonner et de déterminer la contribution relative de chaque canal de caméra pour les données brutes additionnées; utilisez la commande "Transform Raw, Enregistrer et Enregistrer Somme (.dat)" sous le menu "Transformations d'images". Ce rapport d'intensité contient les informations de coordonnée z.
4. Sélectionnez un fiducial lumineux et exécuter z-calibration montage en utilisant la fonction "Test Wind Point 3D" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales". Cela s'adapter fonctions 3-sinusoïdales aux intensités des canaux 3 de la caméra pour déterminer la courbe d'étalonnage. Le fichier d'étalonnage est alors enregistré pour une utilisation ultérieure sur les principaux ensembles de données.
5. Pour tester la qualité de la courbe d'étalonnage, effectuer une extraction coordonnée z, comme décrit précédemment ^23. Pour fiducials bien élevés dans un système bien calibré, la coordonnée z devrait évoluer linéairement, étant donné que les ensembles de données d'étalonnage sont prises avec un balayage linéaire z position. En outre, les z-positions de tous les mires devraient évoluer avec une pente similaire.
6. Une fois un étalonnage satisfaisant est obtenu, effectuer la localisation et l'analyse de transformation pour les ensembles de données d'images brutes acquises à l'étape 4 suivant la même procédure décrite dans les étapes 5.1-5.3. Une fois terminé, charger le fichier d'étalonnage de l'étape 5.4 et d'effectuer l'extraction coordonnée z en utilisant les fonctions "Pick WND Fichier" et "Extraire coordonnée Z" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales".
   NOTE: Depuis le temps d'acquisition est> 15 min, la dérive mécanique est à prévoir.
7. Pour effectuer la correction de dérive en x, y, sélectionnez un fiducial lumineux à partir des coordonnées de localisation. Ce repère doit être présente dans tous les cadres. Ensuite, utilisez le x, dérive de la fiducial coordonnée y d'aligner toutes les autres coordonnées dans le même cadre de nouveau dans l' enregistrement (figure 3A-B) en utilisant la fonction "Test / écriture Guide Star" dans le menu "Transformations d'images". Enregistrement de coordonnée Z peut être effectuée de manière similaire en accédant au "Guide de test Star" et les fonctions "Write Guide Star" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur "Z-coordonner les opérations" dans le menu "Fonctions spéciales".
8. Comme l'échantillon peut présenter une légère inclinaison, effectuer une correction d'inclinaison en fournissant les x, y, z les coordonnées des points de référence 3 définissant le plan qui doit être régler le niveau en utilisant la fonction "Supprimer XYZ Tilt" dans la boîte de dialogue pop-up en cliquant sur " Z-coordonner les opérations "sous le menu" Fonctions spéciales ".
9. À la suite des dérives et d'inclinaison corrections, enregistrer les coordonnées de localisation. Reconstruire une image de super résolution pour une analyse ultérieure (figure 4A-D) en utilisant la commande "Render" sur l'interface principale. La couleur peut être utilisé pour indiquer la coordonnée z. En variante, une vue latérale de la zone sélectionnée peut également être rendue. Les coordonnées de localisation peuvent être exportées sous forme de fichiers texte pour plus de quantification, ou l'image reconstruite peuvent être enregistrés dans un fichier .tif.

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Résultats

exigences critiques pour iPALM sont l'alignement, l'enregistrement, et le calibrage des systèmes optiques. Ceux-ci sont nécessaires pour assurer une bonne interférence dans le 3-way diviseur de faisceau requis pour l'extraction coordonnée z. Pour permettre une surveillance continue, de sources ponctuelles constantes de fluorescence sont nécessaires. Ceci peut être réalisé en utilisant des nanoparticules fluorescentes Au ou bimétalliques ²³ dont la photolum...

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Discussion

Le système optique de iPALM est basé sur une conception à double objectif opposé 4-π, comme illustré sur la figure 1A. La configuration est construit en utilisant des pièces opto-mécaniques à la fois sur mesure usinées et commerciales, comme décrit plus haut ²³ et énumérés dans le tableau 1. En plus de notre configuration, le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) héberge un système qui est accessible à la communauté scientifique au Centre d...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
optical table	Newport, CA	RS4000	iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table	Newport, CA	S-2000
laser-642	Newport, CA	1185055	output power=100 mw
laser-561	Newport, CA	1168931	output power=200 mw
laser-488	Newport, CA	1137970	output power=200 mw
laser-405	Newport, CA	1142279	output power=100 mw
broadband dielectric mirrors	Thorlabs, NJ	BB1-E02	laser combiner
dichroic beamsplitter	Semrock, NY	LM01-427-25
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic, France	AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer	Newport, CA	05LP-VIS-B
baseplate	local workshop	customized
turning mirror (22.5°)	Reynard Corpporation, CA	customized	22.5° mirror
motorized optic mounts	New Focus, CA	8816
motorized XYZ translation stage	Thorlabs, NJ	MT3/M-Z6	sample holder
T-Cube DC servo motor controller	Thorlabs, NJ	TDC001
Piezo Phase Shifter	Physik Instrumente, Germany	S-303.CD
objective lens	Nikon, Japan	MRD01691	objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage	New Focus, CA	9062-COM-M
Pico Motor Actuator	New Focus, CA	8301
rotary Solenoid/Shutter	DACO Instruments, CT	5423-458
3-way beam splitter	Rocky Mountain Instruments, CO	customized	beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner	Physik Instrumente, Germany	S-316.10
motorized five-axis tilt aligner	New Focus, CA	8081
Picmotor ethernet controller	New Focus, CA	8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module	Physik Instrumente, Germany	E-509/E-503/E-517
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-523/20	filters
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-588/21
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-607/30
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-676/37
notch filter	Semrock, NY	NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter	Thorlabs, NJ	FW103H
EMCCD	Andor, UK	DU-897U-CSO-#BV	3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization	Dell	Precision T3500	PC, 4 sets
coverslips with fiducial	Hestzig, VA	600-100AuF	sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin	Millipore, MT	FC010
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	15710	fixation. 16%
glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	16220	25%
triton X-100	Sigma aldrich, MO	T8787
HUVEC cells	Life Technologies, CA	C-015-10C
Medium 200	Life Technologies, CA	M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors	Life Technologies, CA	A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline		14190367
Pennicillin/Streptomycin		15140122
Trypsin/EDTA	Life Technologies, CA	25200056
PIPES	Sigma aldrich, MO	P1851	PHEM
HEPES	1st base, Malaysia	BIO-1825
EGTA	Sigma aldrich, MO	E3889
MgCl2	Millipore, MT	5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen, CA	A22287	staining
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma aldrich, MO	480886	quenching
glucose	1st base, Malaysia	BIO-1101	imaging buffer
glucose oxidase	Sigma aldrich, MO	G2133
catalase	Sigma aldrich, MO	C9322
cysteamine	Sigma aldrich, MO	30070
Epoxy	Thorlabs, NJ	G14250
vaseline	Sigma aldrich, MO	16415	sample sealing
lanolin	Sigma aldrich, MO	L7387
parafin wax	Sigma aldrich, MO	327204
Immersion oil	Electron Microscopy Sciences, PA	16915-04	imaging. Cargille Type HF