JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для применения интерферометрических фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM), 3-х мерной локализации одной молекулы методом микроскопии сверхвысокого разрешения, к визуализации актинового цитоскелета в прикрепленных клетках млекопитающих. Такой подход позволяет на основе света визуализации наноразмерных структурных особенностей, которые в противном случае остаются нерешенными обычными дифракционной оптической микроскопии.

Аннотация

Флуоресцентная микроскопия позволяет осуществлять прямую визуализацию конкретных биомолекул внутри клетки. Тем не менее, для обычной флуоресцентной микроскопии, пространственное разрешение ограничено дифракцией до ~ 200 нм в плоскости изображения и> 500 нм вдоль оптической оси. В результате, флуоресцентной микроскопии уже давно сильно ограничены в наблюдении ультраструктурных признаков внутри клеток. Новейшая разработка методов микроскопии сверхвысокого разрешения преодолела это ограничение. В частности, появление фотопереключаемых флуорофоров позволяет локализации на основе суперразрешением микроскопии, которая обеспечивает разрешающую способность приближающейся масштаб молекулярной длины. Здесь мы опишем применение трехмерного супер способа разрешения микроскопии на основе одиночной молекулы локализации микроскопии и многофазных интерферометрии, называемой интерферометрической фотоактивированного локализации микроскопии (iPALM). Этот метод обеспечивает почти изотропный разрешения напорядка 20 нм во всех трех измерениях. Протоколы для визуализации волокнистый актин цитоскелета, в том числе подготовки образцов и эксплуатации прибора iPALM, описаны здесь. Эти протоколы также могут быть легко адаптированы и поучительно для изучения других ультраструктурных признаков в клетках.

Введение

Визуализация сложных клеточных структур уже давно неотъемлемой частью биологических идей и открытий. Хотя флуоресцентная микроскопия позволяет получать изображения клетки с высокой молекулярной специфичности, его разрешающая способность ограничена дифракции до ~ 200 нм в плоскости изображения (X, Y, или поперечный размер) и> 500 нм вдоль оптической оси (Z, или осевого размера) 1,2. Таким образом, наблюдение за ультраструктурных особенностей исторически ограничена электронной микроскопии (ЭМ). К счастью, в последнее время развитие суперразрешением микроскопии обходили это ограничение, что позволяет пространственное разрешение в 10 - диапазоне 1-6 100 нм. В частности, Суперразрешение подходы , основанные на одной молекулы локализации, известной под аббревиатурами , такими как PALM (фотоактивированного локализация микроскопия) 4, FPALM (флуоресценция фотоактивированного локализации микроскопия) 5 (d) STORM (прямая Стохастический оптическая микроскопия Реконструкция) 6,7, PAINT ( PoINT Накопление для работы с изображениями наноразмерных Топография) 8, GSDIM (State Ground Истощение Микроскопия с последующей индивидуальной молекулярной возвращения) 9 или SMACM (Single-Molecule Active-Control Микроскопия) 10, а также их 3-мерные (3D) реализации, такие как интерферометрическое PALM (iPALM) 11 или 3D-STORM 12, был ценным в выявлении новых идеи в наноразмерных организации многочисленных биологических структур, в том числе аксонов и синапсов 13, очаговые спайки 14,15, межклеточных соединений 16, ядерные поры 17 и центросомы 18-20, чтобы назвать несколько.

Еще одна особенность ультраструктурным в клетках, для которых Суперразрешение микроскопия потенциально полезным является актин цитоскелета. Комплекс плетение нитчатых (F) актина в клетки коры головного мозга играет существенную роль в контроле клеточного формы и механических свойств 21. Организация оF F-актин активно и динамично регулируется , хотя многочисленные регуляторные белки , которые оказывают сильное влияние на полимеризацию, сшивание, оборот, стабильность и топологию сети 22. Тем не менее, хотя характеристика F-актин сетчатой ​​архитектуры имеет важное значение для механистической способности проникновения в суть разнообразных клеточных процессов, малый размер (~ 8 нм) из F-актина нитей затрудняет их наблюдение с помощью обычной дифракционной световой микроскопии; Таким образом, визуализация актина тонкой структуры до настоящего времени исключительно в исполнении EM. Здесь мы описываем протоколы для визуализации F-актин цитоскелета в прикрепленных клетках млекопитающих, используя суперразрешением метод микроскопии iPALM , чтобы воспользоваться его очень высокой способности точности в 3D 11,23. Хотя прибор iPALM является узкоспециализированной, инструкция по настройке такого инструмента был описан недавно 23, в то время как доступ к микроскоп iPALM , организованном ХоWard Hughes Medical Institute также доступны для научного сообщества с минимальными затратами. Кроме того, способы получения образцов , описанные здесь , непосредственно применимы к альтернативным подходам 3D Super Resolution, таких как те , которые основаны на астигматизма расфокусировки функции рассеяния точки (PSF) 12 или би-плоскости обнаружения 24, которые более широко доступны.

Отметим , что необходимый компонент для одной молекулы локализации на основе суперразрешением микроскопии в целом является фотопереключаемых Флуорофор 25, что позволяет трем критическим требованиям для одной молекулы локализации на основе суперразрешением микроскопии должны быть выполнены: я) высокой одной молекулы яркость и контрастность по отношению к фоновых сигналов; б) разреженный распределение одиночных молекул в заданном кадре изображения; и III) высокая пространственная плотность маркировки, достаточной для захвата профиля базовой структуры (также известный как Найквиста-Шаnnon критерий выборки) 26. Таким образом, для удовлетворительных результатов, особое внимание следует уделять одинаково на обоих надлежащей подготовки образцов для оптимизации флуорофора photoswitching и сохранить основную ультраструктуры, а также на приобретение приборов и аспектов экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка изображений образцов

  1. Так как фон сигналы флуоресценции мешают флуоресценции от флуорофоров меток, очистить coverglasses сначала ополаскивают в деионизированной воде (DDH 2 O) , а затем сушка на воздухе их с помощью сжатого воздуха. Затем выполняют плазменного травления в плазме очистителя в течение 15 секунд, или дольше, если это необходимо.
  2. Чтобы включить коррекцию дрейфа и калибровки iPALM, используйте # 1.5 круглая (диаметр 22 мм) предварительно очищенную coverglasses внедренные с люминесцентными наночастиц в качестве реперных знаков, которые служат высоко фотостабильным реперные для надежной калибровки и коррекции дрейфа. Из-за долгого времени накопления необходимого для накопления достаточной плотности флуорофора (> 15 - 30 мин), дрейф образца неизбежно.
  3. Поместите каждую fiducialed покровного стекла в 6-луночного планшета для культуры ткани с. Стерилизовать их с помощью ультрафиолетового (УФ) излучения в колпаке с ламинарным потоком в течение 15 мин.
  4. В стерильный ламинарный, подготовить фиброзноnectin раствор для покровного стекла покрытия путем разбавления 1 мг / мл фибронектина исходного раствора в фосфатно-буферном солевом растворе стерильного Дульбекко (DPBS) до конечной концентрации 2 - 10 мкг / мл. Промыть каждый покровного стекла трижды ДЗФР и инкубировать с 2 мл раствора фибронектина в течение ночи при температуре 4 ° С. Впоследствии, аспирата из раствора фибронектина и промыть один раз с ДЗФР.
  5. Промойте клетки на короткое время с ДЗФР. Инкубируйте с 1 - 2 мл трипсина в течение нескольких минут при температуре 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяться и гасят ~ 10 мл свежей сыворотки, содержащей среду для культивирования клеток. Например, для эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), используют большой культуральной среды эндотелиальных сосудов, дополненную с большими факторами эндотелиальных сосудов и пенициллин или стрептомицин.
    1. Replate клеток на покровного стекла , покрытой фибронектином (для разреженной плотности, пластины <50000 клеток на покровного стекла) и поддерживать культуру в инкубатор при влажности 95%, 5% CO 2, и 37 & #176; С.
  6. Для правильного сохранения тонких структур F-актин цитоскелета, используют буферные растворы на основе буферных реагентов Гуда 27.
    1. Например, подготовить ФЭУ буфер как 2x маточного раствора (120 мМ ТРУБЫ, 50 мМ HEPES, 20 мМ ЭДТА , 4 мМ MgCl 2, рН 7,0 с помощью КОН) путем растворения 6,5 г HEPES, 3,8 г EGTA, и 190 мг MgCl 2 в ~ 300 мл DDH 2 O, с рН , доведенным до 7,0 добавлением по каплям концентрированного раствора KOH; Затем, добавьте DDH 2 O , чтобы довести объем до 500 мл. Стерилизацию буфер через фильтр 0,22 мкм, хранить его при температуре 4 ° С, и разбавить его 1: 1 с DDH 2 O перед использованием.
  7. Для достижения наилучших результатов с высокой плотностью маркировки Ф-актина, использование фаллоидином, конъюгированного с органическими флуорофоры, такие как Alexa Fluor 647. в нужной точке времени после ячейки replating, зафиксировать клетки, следующим образом:
    1. Аспирируйте средств массовой информации из каждой культуры и содержащих СЕLL образца. Аккуратно, но быстро обойтись 2 мл теплого (37 ° C) фиксаторов экстракции, содержащей 0,25% глутаральдегида в ФЭУ буфере с 0,25% Triton X-100. Выдержите при комнатной температуре в течение 1 - 2 мин. Для последующих стадий, используют 2 мл фиксаторе или закалкой буфера на покровного стекла, если не указано иное.
    2. Заменить закрепитель экстракции с 2,5% глутаральдегида фиксатором в буфере ФЭУ и пусть образцы инкубировать в течение 10 - 12 мин. Это и следующие шаги все проводят при комнатной температуре.
    3. Аспирацию из фиксаторов на и аккуратно заменить их ФЭУ буфером. Наклон и водоворот осторожно, а затем промыть снова с ФЭУ. Повторите дважды.
    4. Утолить аутофлюоресценция от глутаральдегида, который может сокрушить сигналы от желаемых флуорофоров, инкубировать образцов со свежеприготовленным закаливания буфером , содержащим NaBH 4 при массовой концентрации 0,1% в ФЭУ. будет наблюдаться Профузные пузыри. Время от времени нажмите на образец блюдо аккуратно Дизльodge пузыри. Пусть инкубировать в течение 5 - 10 мин.
    5. Аспирацию из буфера быстрого охлаждения и аккуратно заменить его ФЭУ буфером. Промыть несколько раз, чтобы убрать пузырьки. Пипетка в 2 мл ФЭУ буфера и пусть он инкубировать в темноте в течение 5 мин. Повторите два раза, и пусть остальные образца в буфере ФЭУ, когда сделано.
    6. Подготовьте камеру влажности для фаллоидином инкубацию с помощью большой пластиковой чашки Петри , дополненный с куском бумажным полотенцем щедро смоченным 5 - 10 мл DDH 2 O. Поместите большой лист чистой Parafilm сверху влажным бумажным полотенцем.
    7. Из-за относительно высокой стоимости меченого фаллоидином, использовать небольшой объем для каждой маркировки. Для получения высокой плотности маркировки, начинаются с концентрации 0,3 мкМ. Приготовьте ~ 60 мкл на покровного стекла с использованием фаллоидином-Alexa Fluor 647 в буфере ФЭУ.
    8. Пипетка 55 - 60 мкл раствора фаллоидином на лист Parafilm в камере влажности. Использование тонких щипцов, осторожно удалите образец covergдеваха. Будьте осторожны, чтобы отметить правильный клеток, содержащих лицо.
    9. Быстро и аккуратно прикосновением избыток буфера, прикоснувшись к краю покровного стекла с сложенный лист тонким впитывающей бумагой, а затем поместить стороны покровного стекла клеток, обращенную вниз на каплю фаллоидином раствора на парафильмом. Убедитесь, что нет никаких пузырей, захваченных покровного стекла.
    10. Поместите крышку на камере влажности. Оберните камеру в алюминиевую фольгу, чтобы защитить его от окружающего света, и пусть образец инкубировать в течение ночи при 4 ° С. Образец может быть в этом состоянии в течение нескольких дней. Убедитесь, что камера влажность остается влажной, если длительное хранение планируется.
  8. До обработки изображений, осторожно поместить сторону покровного стекла клеток вверх на новый 6-луночного планшета, содержащую 2 мл ФЭУ буфера на каждую лунку.
  9. Подготовка к кислороду продуваемых тиоловых на основе буферов изображений с использованием следующих исходных растворов: 1 М глюкозы, 1 М цистеамин и 100x глюкозооксидаза / фермент микст каталазыЮр (4 мг каталазы и 10 мг глюкозооксидазы в 100 мкл буфера для ФЭУ, хорошо перемешивают встряхиванием) 28. Непосредственно перед изображениями, смешайте 75 мкл 1 М раствор глюкозы, 30 мкл 1 М раствора цистеамина, а также 3 мкл 100-кратного сток ферментной смеси. Отрегулируйте громкость до 300 мкл с ФЭУ буфера и использовать сразу же после смешивания для установки образца.
  10. Для iPALM, подготовить образец формирования изображения с использованием предварительно очищенное # 1,5 покровного стекла (диаметр 22 мм).
    1. В качестве альтернативы, использовать предметное стекло (3 "х 1") с двухсторонней клейкой прокладки для помощи в сборке , если астигматизм на основе 3D-STORM 12 должен использоваться вместо этого.
    2. Чтобы собрать образец изображения, использовать тонкий пинцет, чтобы аккуратно удалить образец покровного стекла из буфера хорошо. Затем, быстро и аккуратно прикосновением избыток буфера, прикоснувшись к краю покровного стекла с складчатой ​​фильтровальной бумаги.
    3. Поместите сторону покровного стекла клеток стороной вверх на листе чистой бумаги линзы. Промыть образецпутем размещения 30 - 50 мкл буфера изображений на образец, и удалить избыточный буфер путем наклона и нарезание резьбы со сложенным впитывающей бумагой.
    4. Повторите операции полоскания несколько раз, а затем поместить 30 - 50 мкл буфера изображений на образец. Блот сухой край покровного стекла и поместить несколько очень маленьких точек быстрого отверждения эпоксидной смолы на высушенный области.
    5. Медленно опустите другой предварительно очищенную # 1.5 покровного стекла (обычный, круглый покровного стекла, диаметр 18 мм) на центре ячейки, содержащей 22-мм покровного стекла. Пусть буфер изображений намочить как coverglasses под действием капиллярных сил. Маленькие точки быстрого отверждения эпоксидной смолы следует придерживаться обоих coverglasses.
    6. Аккуратно нажмите на собранном образце с использованием сложенной фильтровальной бумагой, чтобы распределить давление равномерно. Используйте достаточное давление, чтобы сделать образец клеток тонкий и даже (<15 мкм), но не настолько, чтобы раздавить клетки. Калибр необходимой толщины, наблюдая Ньютона кольца шаблон. Кроме того, убедитесь, что для выполнения этой стер осторожно, чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха. При необходимости практиковать с пустыми coverglasses несколько раз заранее.
  11. Печать образца с растопленным вазелиновым-ланолин-парафин (VALAP, запас получают из 100 г каждого из вазелина, ланолина и парафина, сплавлены вместе) 29, полоскание запечатанный образца с DDH 2 O, и продуйте сжатым воздухом. Образец теперь готов для монтажа на микроскоп для работы с изображениями.

2. Пример размещения и выравнивания iPALM

  1. Перемещение подпружиненную верхнюю линзу объектива вверх, чтобы обеспечить удаление держателя образца. Поместите запечатанном образца, полученного на стадии 1.10 на держатель образца и закрепите с помощью нескольких небольших магнитов редкоземельных. Нанесите иммерсионного масла на обеих сторонах образца изображения. Поместите держатель образца обратно в оптический путь и осторожно опустить верхнюю линзу объектива.
  2. Включите лазеров возбуждения. Включите электронного умножителя прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры в режиме кадра передачи.
    1. Поворот в соответствующих фильтров выбросов. Активировать механический затвор , чтобы блокировать верхнюю траекторию луча (рис 1А) и открыть нижнюю траекторию луча. Доведите нижнюю линзу объектива в фокус на перевод с небольшим шагом, используя привод пьезо.
    2. После того, как фидуциальное находится в фокусе, откройте верхнюю траекторию луча, блокируя нижний путь луча и довести верхнюю линзу объектива в фокус аналогичным образом. Монитор ширины фидуциального на дисплее компьютера для оптимальной фокусировки.
  3. Для правильной центрации, открытой в верхней и нижних траекторий лучей. Ручная регулировка верхнего объектива в то время как нижняя цель поддерживается на постоянном уровне, используя пару микро-тонкой установочных винтов, пока фидуциальные изображения не накладываются друг на друга настолько близко, насколько это возможно, в идеале в пределах одного пикселя.
    1. Затем выполнить точную настройку так, что фидуциальные изображения в шаге 2.3 перекрытия в пределах одной десятой EMCCD пикселя. Отрегулируйте верхнюю2-осевой пьезо монтажа зеркал с помощью программного обеспечения управления, удерживая обе объективы и нижней отражения зеркал постоянным. Сравните центры реперные верхних и нижних объективных взглядов с помощью дисплея компьютера для управления процессом.

3. Калибровка установки iPALM

Примечание: Поскольку флуоресцентное излучение некогерентно, за помех , которые должны соблюдаться в iPALM, путь длины через верхний и нижний цели должны быть близки друг к другу, в пределах нескольких микрон. Это может быть достигнуто следующим образом:

  1. С помощью лазеров на, камеры непрерывно потоковое, и обе верхние и нижние пути лучей открытыми, вибрировать держатель образца Z-пьезоэлемент с использованием синусоидальной формы напряжения, генерируемого программным обеспечением управления для непрерывной Z-оси колебаний по величине 400 нм ,
  2. Пользуясь тем, что, когда из оптимального выравнивания, фидуциальные интенсивность мало меняется с тон колебаний, вручную перевести моторизованный узел луча сплиттер вверх или вниз до интенсивности отправных колеблется из-за требуемого однофотонной эффекта интерференции. Это означает тесное согласование оптических длин путей. Отношение пика к долине> 10 может быть достигнуто в оптимальных случаях (рис 1D).
  3. Для того, чтобы гарантировать, что и амплитуда и фаза на каждой поверхности как можно более равномерным по полю, отрегулируйте нижнее зеркало узла светоделитель небольшими шагами для точной настройки зазора и углов наклона. Выполните расщепитель лучей точное выравнивание путем перевода образца в 8 нм Z-шагом более 800 нм.
    1. Монитор фидуциальные интенсивности среди камер # 1 - 3. Отрегулируйте высоту, положение и наклон нижнего зеркала в сборке светоделитель небольшими шагами, таким образом, что фаза колебаний камеры # 1 по отношению к камере # 2 развернуто, в идеале при 120 ° (рис 1B-D).
    2. Как только начальнаявыравнивание будет завершено, перевести образец для поиска подходящего поля зрения, которое содержит клетки к образу и нескольких реперных поблизости. Поместите кожух вокруг системы, чтобы блокировать посторонний свет и окружающей среды возмущения. После того, как область формирования изображения найдены, выполните процедуру, описанную в шаге 3.4 снова, и записывают кривую калибровки для использования в последующих Z-координат извлечений с помощью команды "Приобретать калибровки Сканы против образца Piezo Позиция" в главном интерфейсе.

4. Сбор данных

  1. После того, как желательное область найдена и получена калибровочную кривую, введите соответствующие имена файлов в программное обеспечение. Откройте обе верхние и нижние пути луча. Увеличение мощности возбуждения на 642-нм лазера до максимума. Для Alexa Fluor 647, начальный период флуорофора отключения может потребоваться (рис 2А).
    1. не выставляют с постоянной 642 нм возбуждения в течение 5 мин или дольше, если это необходимо, до тех пор, сиngle молекула мигания наблюдается (рис 2В). Программное обеспечение позволяет автоматическое увеличение 405 нм фотоактивации в процессе приобретения. Большое количество кадров сбора, как правило, требуется для нитевидные возможности быть четко виден (> 50000 кадров). Когда все будет готово, начать приобретение сырья наборов изображений с помощью команды "Start iPALM получения снимка" в главном интерфейсе.
  2. Во время приобретения, настройка уровня фотоактивация путем регулировки интенсивности 405 нм лазера для поддержания надлежащего мигающего плотности по мере необходимости (см примеры на рисунке 2B).
    Примечание: После приобретения завершен, программа будет автоматически конвертировать файлы изображений в соответствующий двоичный формат. Хранилище данных на сервере вычислений устанавливается в качестве сетевого привода, позволяя данным быть скопирован там для дальнейшей обработки.

5. Обработка данныхи анализ

  1. Выполнить анализ локализации с помощью пользовательских разработанного программного обеспечения для извлечения наилучшего соответствия параметров для всех одиночных молекул, а также для реперных 11,15,23. Это дает не только х, у-координаты, но и интенсивность, которая используется для анализа калибровочной кривой.
    1. Импорт необработанных данных калибровки, полученных на этапе 3.5 с помощью команды "Извлечь Пикс несколько ярлыков" в меню "Файл", чтобы выполнить локализацию в одной молекуле. После первоначального анализа локализации, координаты получены из камер # 1 - 3 присутствуют в красном, зеленом и синем каналах, соответственно, и могут быть сохранены для дальнейшего анализа с помощью команды "Сохранить Обрабатываются как IDL (.sav)" под " меню Файл ".
  2. Для того, чтобы перенести данные из камеры № 1 - 3 в регистрации с использованием флуоресцентных реперные внедренные на покровные, выберите несколько ярких реперные , чтобы обеспечить покрытие центрального образа (например,Рисунок 1B) с помощью команды "Якорь фидуциального Точки" в меню "Image" Трансформации. Используйте тройные наборы локализации координат из камер # 1 - 3, полученной из ярких реперные на шаге 5.1 для вычисления поворота и масштабирования матрицы, которая приведет камеры # 1 и # 3 в регистр с камерой # 2. При достаточно большом количестве реперные, полиномиальное деформирование высшего порядка могут быть выполнены для лучшего припадков.
  3. После того, как матрица преобразования вычисляется, преобразование исходных данных камер # 1 - 3 вместе, чтобы получить суммированные исходных данных. Выполните еще один раунд анализа локализации, чтобы получить более точные х, у-координаты и определить относительный вклад каждого канала камеры к суммарному необработанных данных; используйте команду "Преобразовать RAW, Сохранить и Сохранить Sum (.dat)" в меню "Image" Трансформации. Это отношение интенсивности содержит информацию о Z-координаты.
  4. Выберите яркую фидуциального и выполнить Z-Калибровка установки с помощью функции "Test Wind Точка 3D" во всплывающем диалоге, нажав кнопку "Z-координате Операции" в меню "специальных функций". Это будет соответствовать 3-синусоидальной функции интенсивностей 3 каналов камер для определения калибровочной кривой. Файл калибровки затем сохраняется для дальнейшего использования на основных наборах данных.
  5. Чтобы проверить качество калибровочной кривой, выполнить Z-координате экстракции, как описано ранее 23. Для хорошо вели себя реперные в хорошо калиброванной системе Z-координата должна линейно масштабировать, так как калибровочные наборы данных принимаются с линейной разверткой в ​​г-м положении. Кроме того, г-позиции всех реперных должны масштабировать с аналогичным наклоном.
  6. После удовлетворительной калибровки получается, выполнить локализацию и анализ преобразования для необработанных наборов данных изображения, полученных на этапе 4 следующий же процедуре, описанной в пунктах 5.1-5.3. Когда это сделано, загрузите файл калибровки с шага 5.4 и выполнить Z-координате экстракции с использованием функции "Pick Wnd Файл" и "Извлечь координаты Z" в всплывающем диалоговом окне, нажав кнопку "Z-координате Операции" в меню "специальных функций".
    Примечание: Так как время приобретение> 15 мин, механическая дрейф следовало ожидать.
  7. Для выполнения коррекции дрейфа по х, у, выберите яркую фидуциального от координат локализации. Этот фидуциальный должен присутствовать во всех кадрах. Затем, с помощью х, у-координату дрейф нормирующего выровнять все другие координаты в пределах одного кадра обратно в регистрации (Рисунок 3A-B) с помощью функции "Test / Write Guide Star" в меню "Image" Трансформации. регистрация Z-координата может быть выполнена аналогично путем доступа к "Test Guide Star" и "Записать Guide Star" функции во всплывающем диалоге, нажав кнопку "Z-координате Операции" в меню "специальных функций".
  8. По мере того как образец может демонстрировать небольшой наклон, выполнить коррекцию наклона, предоставляя х, у, Z-координаты 3 опорных точек, определяющих плоскость, которая должна быть установлена ​​уровень с помощью функции "Удалить XYZ Tilt" в всплывающем диалоговом окне, нажав кнопку " Z-координате Операции "под" меню специальных функций ".
  9. После дрейфа и наклона поправок, сохранить координаты локализации. Реконструировать супер разрешение изображения для дальнейшего анализа (рис 4A-D) с помощью команды "визуализацией" на главном интерфейсе. Цвет может быть использовано для обозначения Z-координат. В качестве альтернативы, вид сбоку выделенной области также могут быть оказаны. Координаты локализации могут быть экспортированы в виде текстовых файлов для дальнейшей количественной оценки, или реконструированное изображение может быть сохранено в виде файла в формате TIF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Критические требования к iPALM являются выравнивание, регистрация и калибровка оптических систем. Они необходимы для обеспечения надлежащего вмешательства в течение 3-х ходового светоделитель реквизита для Z-координате экстракции. Для обеспечения непрерывного монито?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Оптическая система iPALM основана на 4-П двойственной оппозитных объективном конструкции, как показано на рисунке 1А. Установка построена с использованием как специально обработанную и коммерческие оптико-механические части, как описано ранее 23 и приведены в таблице

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

YW и PK выражают глубокую признательность финансовую поддержку Сингапурского Национального исследовательского фонда, присужденной PK (СРН-NRFF-2011-04 и NRF2012NRF-CRP001-084). Мы также благодарим MBI открытые лаборатории и основные микроскопию средства для поддержки инфраструктуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
optical tableNewport, CARS4000iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical tableNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055output power=100 mw
laser-561Newport, CA1168931output power=200 mw
laser-488Newport, CA1137970output power=200 mw
laser-405Newport, CA1142279output power=100 mw
broadband dielectric mirrorsThorlabs, NJBB1-E02laser combiner
dichroic beamsplitterSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optic tunable filterAA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear polarizerNewport, CA05LP-VIS-B
baseplatelocal workshopcustomized
turning mirror (22.5°)Reynard Corpporation, CAcustomized22.5° mirror
motorized optic mountsNew Focus, CA8816
motorized XYZ translation stageThorlabs, NJMT3/M-Z6sample holder
T-Cube DC servo motor controllerThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, GermanyS-303.CD
objective lensNikon, JapanMRD01691objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stageNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotary Solenoid/ShutterDACO Instruments, CT5423-458
3-way beam splitterRocky Mountain Instruments, COcustomizedbeamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, GermanyS-316.10
motorized five-axis tilt alignerNew Focus, CA8081
Picmotor ethernet controllerNew Focus, CA8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation modulePhysik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
band-pass filterSemrock, NYFF01-523/20filters
band-pass filterSemrock, NYFF01-588/21
band-pass filterSemrock, NYFF01-607/30
band-pass filterSemrock, NYFF01-676/37
notch filterSemrock, NYNF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronizationDellPrecision T3500PC, 4 sets
coverslips with fiducialHestzig, VA600-100AuFsample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectinMillipore, MTFC010
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16%
glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial FactorsLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287staining
sodium borohydride (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101imaging buffer
glucose oxidaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cysteamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415sample sealing
lanolinSigma aldrich, MOL7387
parafin waxSigma aldrich, MO327204
Immersion oilElectron Microscopy Sciences, PA16915-04imaging. Cargille Type HF

Ссылки

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

118iPALMFSingle Molecule

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены