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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

Zusammenfassung

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung von spezifischen Biomoleküle in Zellen. Jedoch für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie, die räumliche Auflösung wird durch Beugung auf ~ 200 nm innerhalb der Bildebene und> 500 nm entlang der optischen Achse beschränkt. Als Ergebnis wurde bei der Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale innerhalb der Zellen Fluoreszenzmikroskopie lang stark eingeschränkt. Die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie-Methoden hat diese Einschränkung zu überwinden. Insbesondere ermöglicht das Aufkommen von photoschaltbarer Fluorophore Lokalisation-basierten Super Resolution Mikroskopie, die die molekulare Länge Annäherung Skala Auflösungsvermögen zur Verfügung stellt. Hier beschreiben wir die Anwendung eines dreidimensionalen Super Resolution Mikroskopie-Methode basiert auf Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie und mehrphasigen Interferometrie genannt interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm). Dieses Verfahren liefert nahezu isotrop Auflösung auf demGrößenordnung von 20 nm in allen drei Dimensionen. Protokolle für die filamentöse Aktin-Zytoskelett Visualisierung, einschließlich Probenvorbereitung und den Betrieb des Instruments iPalm, werden hier beschrieben. Diese Protokolle sind auch leicht anpaßbar und lehrreich für die Untersuchung anderer ultrastrukturelle Merkmale in Zellen.

Einleitung

Die Visualisierung von komplexen zellulären Strukturen ist seit langem ein integraler Bestandteil biologische Einsichten und Entdeckungen. Obwohl die Fluoreszenzmikroskopie können Bildzellen mit hohem Molekular Spezifität, dessen Auflösungsvermögen durch Beugung auf ~ 200 nm in der Bildebene begrenzt ist (x, y, oder laterale Dimension) und> 500 nm entlang der optischen Achse (z, oder axiale Abmessung) 1,2. Daher hat die Beobachtung der ultrastrukturellen Merkmale historisch worden Elektronenmikroskopie (EM) begrenzt. Glücklicherweise hat die jüngste Entwicklung der Super Resolution Mikroskopie , diese Grenze zu umgehen, räumliche Auflösung im 10 ermöglicht - Bereich 100 nm 1-6. Insbesondere Ansätze Superauflösung auf Einzelmoleküllokalisierung anhand von Akronymen wie PALM (photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 4 bekannt, FPALM (Fluorescence photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie) 5 (d) STORM (direkte Stochastische Optische Rekonstruktionsmikroskopie) 6,7, PAINT ( Point Accumulation for Imaging Nanoskalige Topographie) 8, GSDIM (Grundzustand Depletion - Mikroskopie , gefolgt von einzelnen Molekülrück) 9 oder SMACM (Einzelmolekül - Aktiv-Control - Mikroskopie) 10, sowie deren 3-dimensionale (3D) Implementierungen, wie interferometrischen PALM (iPalm) 11 oder 3D-STORM 12, haben neuronale Axone in enthüllt neue Einblicke in die nanoskaligen Organisation zahlreicher biologischer Strukturen, einschließlich wertvoll und Synapsen 13, Fokaladhäsionen 14,15, Zell-Zell - Verbindungen 16, Kernporen 17 und Zentrosomen 18-20, um nur einige zu nennen.

Ein weiteres Merkmal ultra in Zellen, für die Super Resolution Mikroskopie potentiell nützlich ist, ist das Aktin-Zytoskelett. Der Komplex meshwork filamentöser (f) -Actin in der Zelle cortex spielt eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Zellform und der mechanischen Eigenschaften 21. Die Organisation of F-Aktin ist aktiv und dynamisch wenn zahlreiche regulatorische Proteine reguliert , die stark beeinflussen Polymerisation, Vernetzung, Umsatz, Stabilität und Netzwerktopologie 22. Doch obwohl die Charakterisierung der f-Actin meshwork Architektur ist wichtig für die mechanistische Einblicke in ein breites Spektrum von zellulären Prozessen, die geringe Größe (~ 8 nm) der f-Aktin-Filamente ihre Beobachtung behindert durch konventionelle beugungsbegrenzte Lichtmikroskopie; Somit hat die Visualisierung von Aktin Feinstruktur bisher durch EM ausschließlich durchgeführt. Hier beschreiben wir Protokolle zur Visualisierung des f-Aktin - Zytoskelett in adhärenten Säugetierzellen unter Verwendung der iPalm Super Resolution Mikroskopie - Technik den Vorteil der sehr hohen Präzision Fähigkeit zu nehmen in 3D 11,23. Obwohl die iPalm Instrument hoch spezialisiert ist, Instruktion über die Einrichtung eines solchen Instruments wurde vor kurzem 23 beschrieben, während der Zugang zu dem iPalm Mikroskop vom Ho gehostetStation Hughes Medical Institute hat sich auch für die Forschungsgemeinschaft mit minimalen Kosten zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus sind die Probenvorbereitung hier beschriebenen Verfahren unmittelbar auf alternative 3D Super Resolution Ansätze, wie solche auf Basis von astigmatischen Defokussierung des Punktverteilungsfunktion (PSF) 12 oder bi-Ebenenerkennung 24, die im weiteren Sinne zur Verfügung stehen.

Wir stellen fest , dass ein notwendiger Bestandteil für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie im Allgemeinen ist die photoschaltbare Fluorophore 25, die die drei kritischen Anforderungen für Einzelmoleküllokalisierung-basierten Super Resolution Mikroskopie erfüllt werden können: i) hohe Einzelmolekül Helligkeit und Kontrast in Bezug auf Hintergrundsignale; ii) spärliche Verteilung einzelner Moleküle in einem gegebenen Bildrahmen; und iii) eine hohe räumliche Dichte der Markierung ausreichend, um das Profil der darunterliegenden Struktur zu erfassen (auch bekannt als Nyquist-Shannon Sampling - Kriterium) 26. So für zufriedenstellende Ergebnisse sollte der Schwerpunkt gleichermaßen sowohl auf der richtigen Vorbereitung von Proben Fluorophor Photoschaltbarkeit platziert werden, um zu optimieren und die zugrunde liegende Ultrastruktur sowie auf die Instrumentierung und Akquisitions Aspekte der Experimente zu erhalten.

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Protokoll

1. Imaging Probenvorbereitung

  1. Da die Signale Hintergrund - Fluoreszenz mit der Fluoreszenz von Fluorophor Etiketten stören, reinigen Sie die Deckgläser indem sie zunächst in de-ionisiertem Wasser (ddH 2 O) Spülen und dann an der Luft trocknen sie mit Druckluft. Anschließend Plasmaätzen in einem Plasma-Reiniger für 15 sec oder länger, falls erforderlich, durchzuführen.
  2. Um Driftkorrektur und iPalm Kalibrierung zu aktivieren, verwenden # 1.5 Runde (22 mm Durchmesser) vorgereinigte Deckgläser mit fluoreszierenden Nanopartikel als Markierungszeichen eingebettet, die als hoch licht fiducials für zuverlässige Kalibrierung und Driftkorrektur dienen. Aufgrund der Zeit langen Erfassung erforderlich, um ausreichende Fluorophor Dichte zu akkumulieren (> 15 - 30 min), ist Probe Drift unvermeidlich.
  3. Platzieren Sie jede fiducialed Abdeckglas in einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Sterilisieren sie durch ultraviolette (UV) Strahlung in einer laminaren Strömungshaube für 15 min.
  4. In einem sterilen Laminar-Flow-Haube, bereiten FibroNectin Lösung für Abdeckglas Beschichtung durch Verdünnen von 1 mg / ml Fibronektin-Stammlösung in sterilem Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) in einer Endkonzentration von 2 bis 10 & mgr; g / ml. Spülen jedes Abdeckglas dreimal mit DPBS und Inkubation mit 2 ml der Fibronektin-Lösung über Nacht bei 4 ° C. Anschließend absaugen Fibronektinlösung aus und spülen Sie einmal mit DPBS.
  5. Spülen Sie die Zellen kurz mit DPBS. Inkubieren mit 1 bis 2 ml Trypsin für einige min bei 37 ° C, bis die Zellen abzulösen und schrecke mit ~ 10 ml frischem serumhaltigen Zellkulturmedium. Beispielsweise für den menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), verwenden große Kulturmedium Gefäß endothelial mit großen Gefäß Endothelfaktoren und Penicillin oder Streptomycin ergänzt.
    1. Ausstrich der Zellen auf die Fibronektin-beschichtete Deckglas (für spärliche Dichte, Platte <50.000 Zellen pro Deckglas) und zur Erhaltung der Kultur in einem Inkubator eingestellt bei 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 und 37 & #176; C.
  6. Für eine ordnungsgemäße Erhaltung der feinen Strukturen des f-Aktin - Zytoskelett, verwenden Pufferlösungen auf Basis von Good-Puffer - Reagenzien 27.
    1. Beispielsweise PHEM - Puffer als 2x - Stammlösung (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2, pH 7,0 mit KOH) durch Auflösen von 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA und 190 mg Vorbereitung von MgCl 2 in ~ 300 ml ddH 2 O, wobei der pH auf 7,0 eingestellt durch tropfenweise Zugabe von konzentrierter KOH - Lösung; Dann fügen Sie ddH 2 O , um das Volumen auf 500 ml zu bringen. Sterilisieren Sie den Puffer mit einem 0,22-um - Filter verwenden, lagern Sie es bei 4 ° C, und verdünnen Sie es 1: 1 mit ddH 2 O vor dem Gebrauch.
  7. Für die besten Ergebnisse mit hoher Dichte Kennzeichnung von F-Actin, Verwendung phalloidin mit organischen Fluorophore konjugiert, wie Alexa Fluor 647. Bei der gewünschten Zeitpunkt nach Zelle replating, um die Zellen zu beheben, wie folgt:
    1. Absaugen Medien aus jeder Kultur, die auch die cell Probe. Sanft, aber schnell mit 2 ml warmem (37 ° C) Extraktions Fixiermitteln mit 0,25% Triton X-100, das 0,25% Glutaraldehyd in PHEM-Puffer verzichtet werden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 bis 2 min. Für nachfolgende Schritte Verwenden 2 ml Fixativ oder Abschrecken Puffer pro Deckglas, sofern nicht anders angegeben.
    2. Ersetzen Sie die Extraktion Fixiermittel mit einer 2,5% Glutaraldehyd Fixiermittel in PHEM Puffer und lassen Sie die Proben 10 brüten - 12 min. Diese und alle folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
    3. Saugen Sie die Fixierungen und sanft sie mit PHEM Puffer ersetzen. Tilt und wirbeln sanft, und dann waschen wieder mit PHEM. Zweimal wiederholen.
    4. Abzuschrecken Autofluoreszenz von Glutaraldehyd, die Signale von den gewünschten Fluorophore überwältigen können, Inkubation der Proben mit einem frisch zubereiteten Abschrecken Puffer, der NaBH 4 bei einer Massenkonzentration von 0,1% in PHEM. Reichlicher Blasen werden beobachtet. Gelegentlich tippen Sie auf die Probenschale sanft Dislodge die Blasen. Lassen Sie es für 5 ausbrüten - 10 min.
    5. Saugen Sie die Löschpuffer und ersetzen Sie sie vorsichtig mit PHEM Puffer. Spülen Sie ein paar Mal um die Blasen zu beseitigen. Pipette in 2 ml PHEM Puffer und lassen Sie es für 5 min im Dunkeln inkubiert. Wiederholen Sie zweimal und lassen Sie die Probe Rest in PHEM Puffer, wenn Sie fertig.
    6. Bereiten Sie eine Feuchtigkeitskammer für Phalloidin Inkubation mit einem großen Kunststoff - Petrischale mit einem Stück Papiertuch mit 5 großzügig befeuchtet gepolstert - 10 ml ddH 2 O. Legen Sie ein großes Blatt sauber Parafilm auf der Oberseite des nassen Papiertuch.
    7. Aufgrund der relativ hohen Kosten von markiertem Phalloidin, verwenden für jede Markierung ein kleines Volumen. Für hochdichte Markierung, mit einer Konzentration von 0,3 uM starten. Bereiten Sie ~ 60 & mgr; l pro Deckglas mit Phalloidin-Alexa Fluor 647 in PHEM Puffer.
    8. Pipette 55-60 ul der phalloidin Lösung auf das Blatt Parafilm in der Feuchtigkeitskammer. Mit einer feinen Pinzette, entfernen Sie die Probe covergMädel. Achten Sie darauf, die richtige Zellen enthaltende Gesicht zu beachten.
    9. Schnell und leicht abklopfen entfernt überschüssige Puffer durch den Rand des Deckglases mit einem gefalteten Stück zart saugfähigem Papier zu berühren, und dann das Deckglas Zellenseite legen auf die Tropfen phalloidin Lösung auf dem Parafilm nach unten zeigt. Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen durch das Deckglas gefangen sind.
    10. Legen Sie die Abdeckung auf der Feuchtigkeitskammer. Wickeln Sie die Kammer in Aluminiumfolie zum Schutz vor Umgebungslicht, und lassen Sie die Probe Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Die Probe kann in diesem Zustand für mehrere Tage aufbewahrt werden. Stellen Sie sicher, dass die feuchte Kammer feucht bleibt, wenn lange Lagerung geplant.
  8. Vor der Bildgebung, legen Sie vorsichtig die Abdeckglas Zellseite nach oben auf ein neues 6-Well-Platte 2 ml PHEM-Puffer, der pro Vertiefung.
  9. Bereiten Sie Sauerstoff-gespülten Thiolbasis Bildgebung Puffer die folgenden Stammlösungen: 1-M Glucose, 1 M Cysteamin und 100x Glucose-Oxidase / Katalase Enzym mixture (4 mg Katalase und 10 mg Glukoseoxidase in 100 ul PHEM - Puffer, gut gemischt , durch Vortexen) 28. Kurz vor Bildgebung, mischen 75 ul 1 M Glucoselösung, 30 ul 1 M Cysteamin-Lösung und 3 ul 100x Stockenzymmischung. Stellen Sie die Lautstärke auf 300 & mgr; l mit PHEM Puffer und verwenden unmittelbar nach dem Mischen der Probe zu montieren.
  10. Für iPalm, bereiten Sie die Imaging-Probe unter Verwendung eines vorgereinigte # 1.5 Deckglas (22 mm Durchmesser).
    1. Alternativ können Sie einen Glasobjektträger (3 "x 1") mit einem doppelseitig klebenden Abstandshalter in der Anordnung zu unterstützen , wenn Astigmatismus basierten 3D-STORM 12 stattdessen verwendet werden.
    2. Um die Abbildungs ​​Beispiel verwenden feinen Pinzette montieren vorsichtig auf die Probe Abdeckglas aus dem Puffer gut entfernen. Dann schnell und leicht abklopfen entfernt überschüssige Puffer durch den Rand des Deckglases mit gefalteten saugfähigem Papier zu berühren.
    3. Legen Sie die Deckglaszellenseite auf einem sauberen Objektivpapier nach oben zeigt. Spülen Sie die Probedurch Platzieren von 30 bis 50 & mgr; l von Abbildungspuffer auf die Probe, und die überschüssige Puffer entfernen durch Kippen und mit gefalteten absorbierenden Papier tippen.
    4. Wiederholen Sie den Spülvorgang ein paar Mal, und legen Sie dann 30 - 50 & mgr; l von Abbildungspuffer auf die Probe. Blot den Rand des Deckglas trocknen und mehrere sehr kleine Punkte von schnell aushärtenden Epoxid auf die getrocknete Fläche platzieren.
    5. Langsam senken andere vorgereinigte # 1.5 Deckglas (plain, rund Abdeckglas, 18 mm Durchmesser) auf die Mitte der Zelle enthaltenden 22-mm-Deckglas. Lassen Sie den Imaging-Puffer beide Deckgläser durch Kapillarwirkung benetzen. Die kleinen Punkte von schnell härtenden Epoxid sollte an beiden Deckgläsern haften.
    6. Drücken Sie vorsichtig auf die zusammengesetzten Probe gefaltet saugfähigem Papier mit gleichmäßig um den Druck zu verbreiten. Verwenden Sie einen ausreichenden Druck der Probenzelle dünn und sogar (<15 & mgr; m) zu machen, aber nicht so viel wie die Zellen zu vernichten. Spur die richtige Dicke durch die Ringe Muster Newton beobachten. Also, stellen Sie sicher, dass diese st ausführenep sanft Luftblasen zu minimieren. Bei Bedarf üben mit leeren vorher mehrmals Deckgläsern.
  11. Verschließen Sie die Probe mit geschmolzenem Vaseline-Lanolin-Paraffin (VALAP, Lager , hergestellt aus je 100 g Vaseline, Lanolin und Paraffin, zusammengeschmolzen) 29, spülen Sie die versiegelte Probe mit ddH 2 O und Föhnen mit Druckluft. Die Probe ist nun bereit für die für die Bildgebung auf das Mikroskop Montage.

2. Proben Platzierung und Ausrichtung iPalm

  1. Bewegen Sie den gefederten oberen Objektivlinse nach oben für die Entfernung des Probenhalters zu ermöglichen. Legen Sie die versiegelte Probe vorbereitet in Schritt 1.10 auf den Probenhalter und sichern mit mehreren kleinen Seltenerd-Magneten. Anwenden Sionsöl auf beiden Seiten der Abbildungsprobe. Setzen Sie den Probenhalter zurück in den optischen Pfad und sanft die obere Objektivlinse zu senken.
  2. Schalten Sie den Anregungslaser. Schalten Sie den Elektronenvervielfachungs Charge-Coupled Device (EMVCD) Kamera im Rahmen-Übertragungsmodus.
    1. Drehen Sie in den richtigen Emissionsfilter. Aktivieren Sie einen mechanischen Verschluss der oberen Strahlengang (Abbildung 1A) und öffnen Sie den unteren Strahlengang zu blockieren. Bringen Sie die untere Objektivlinse in den Fokus durch Übersetzung in kleinen Schritten den Piezo-Aktor verwendet wird.
    2. Sobald der Fiducial im Fokus ist, öffnen Sie den Pfad oberen Balken, während die untere Strahlengang blockiert und die obere Objektivlinse in den Fokus auf eine ähnliche Art und Weise bringen. Überwachen der Breite der Justiermarke auf der Computeranzeige für eine optimale Fokussierung.
  3. Für eine korrekte Zentrierung offen sowohl für die oberen und unteren Strahlengänge. Manuelle Einstellung der oberen Objektivlinse, während die untere Ziel konstant gehalten wird, ein Paar von mikrofeinen Satz Schrauben, bis die Fiducial Bilder so nah wie möglich überlappen, idealerweise innerhalb eines Pixels.
    1. Anschließend führen Sie die Feineinstellung, so dass die Fiducial Bilder in Schritt 2.3 Überlappung innerhalb eines Zehntel eines EMCCD Pixel. Stellen Sie die obere2-Achsen-Piezo montierte Spiegel über die Steuerungssoftware und halten die beiden Objektivlinsen und die untere Reflexionsspiegel konstant. Vergleichen der Zentren der Justiermarken der oberen und der unteren Objektiv Ansichten über den Computerbildschirm, den Prozess zu führen.

3. Kalibrierung des iPalm-Setup

HINWEIS: Da die Fluoreszenzemission inkohärent ist, für eine Interferenz in iPalm beobachtet werden, die Weglängen durch die oberen und unteren Ziele müssen innerhalb von wenigen Mikrometern zueinander, in der Nähe sein. Dies kann wie folgt erreicht werden:

  1. Mit den Laser auf die Kameras kontinuierlich Streaming und sowohl die oberen und unteren Strahlengänge offen, schwingen die Probenhalter z-piezo unter Verwendung einer sinusförmigen Spannungswellenform von der Steuersoftware für eine kontinuierliche z-Achse Schwingung über eine Amplitude von 400 nm erzeugt, .
  2. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass, wenn aus der optimalen Ausrichtung variiert die Intensität fiducial wenig mit ter Schwingung, zu übersetzen manuell den motorisierten Strahlteilerbaugruppe nach oben oder nach unten, bis die Intensität der Fiducial oszilliert aufgrund der Ein-Photonen-Interferenzeffekt erwünscht ist. Dies bedeutet, die enge Anpassung der optischen Weglängen. Ein Spitze-Tal - Verhältnis von> 10 können in optimalen Fällen (Figur 1D) erreicht werden.
  3. Um sicherzustellen, dass sowohl die Amplitude und die Phase an jeder Oberfläche sind so gleichförmig wie möglich über das Feld, stellen Sie den unteren Spiegel des Strahlteileranordnung in kleinen Schritten, um eine Feinabstimmung des Spaltes und die Neigungswinkel. Führen Strahlteiler Feinausrichtung durch die Probe in 8 nm z-Schritten über 800 nm zu übersetzen.
    1. Überwachung der Fiducial Intensität unter Kameras # 1 - 3. Die Höhe, Position und Neigung des unteren Spiegels innerhalb des Strahlteilerbaugruppe in kleinen Schritten, so dass die Schwingungsphase der Kamera # 1 relativ zur Kamera 2 # maximiert ist, im Idealfall bei 120 ° (1B-D).
    2. Sobald die ersteAusrichtung abgeschlossen ist, übersetzen die Probe für ein geeignetes Sichtfeld zu scannen, die beide Zellen zu Bild enthält und mehrere Justiermarken in der Nähe. Legen Sie ein Gehäuse um das System Streulicht und Umgebungsstörungen zu blockieren. Mit dem Befehl "Acquire Kalibrierung Scans vs Beispiel Piezo-Position" in der Hauptoberfläche Nachdem der Imaging-Bereich gefunden wird, durchführen 3.4 das Verfahren in einem Schritt wieder, und die Kalibrierungskurve für die Verwendung in nachfolgenden z-Koordinaten Extraktionen aufzuzeichnen.

4. Datenerfassung

  1. Sobald eine gewünschte Bereich gefunden wird und die Kalibrierungskurve erhalten wird, geben Sie die entsprechenden Dateinamen in die Software. Öffnen Sie sowohl die obere und untere Strahlengänge. Erhöhen Sie die Anregungsleistung des 642-nm-Laser auf Maximum. Für Alexa Fluor 647 kann eine anfängliche Dauer von Fluorophor Abschalten benötigt werden (2A).
    1. Belichten mit einer konstanten 642-nm-Anregung für 5 min oder länger, falls erforderlich, bis single Molekül blinkt beobachtet (2B). Die Software ermöglicht eine automatische Erhöhung der 405-nm-Photoaktivierung im Verlauf der Übernahme. Eine große Anzahl von Akquisitionsrahmen sind in der Regel erforderlich für filamentöse Merkmale deutlich sichtbar sind (> 50.000 Frames). Wenn Sie bereit sind, beginnen die Akquisition von rohen Bild setzt den Befehl "Start iPalm Acquisition" in der Hauptoberfläche.
  2. Während der Akquisition, stimmen die Photoaktivierungsniveau , indem die Intensität des Lasers 405-nm Einstellen der richtigen Blink Dichte zu halten , wie (siehe Beispiele in 2B) benötigt.
    HINWEIS: Sobald die Übernahme abgeschlossen ist, wird die Software automatisch die Bilddateien in die richtige binäre Format konvertieren. Die Daten-Repository in der Berechnung Server als Netzwerk-Laufwerk, sind die Daten damit direkt dort zur weiteren Verarbeitung kopiert werden.

5. Datenverarbeitungand Analysis

  1. Führen Lokalisierung Analyse einer speziell entwickelten Software Best-Fit - Parameter für alle einzelnen Molekülen sowie für die fiducials 11,15,23 zu extrahieren. Dies ergibt nicht nur die x, y-Koordinate, sondern auch die Intensität, die für die Kalibrierungskurvenanalyse verwendet wird.
    1. Importieren Sie die rohen Kalibrierungsdaten in Schritt erworben 3.5 mit dem Befehl "Extrahieren Peaks Mehrere Labels" unter dem Menü "Datei" die Einzelmoleküllokalisierung durchzuführen. Nach der anfänglichen Lokalisierungsanalyse, Koordinaten von Kameras # erhalten 1-3 vorhanden sind, in Rot, Grün und Blau-Kanäle sind, und können zur weiteren Analyse mit dem Befehl gespeichert werden "Speichern verarbeitet, wie IDL (.sav)" unter dem " Datei "-Menü.
  2. Zu bringen , Daten von Kameras # 1 - 3 in den Registrierung der Fluoreszenz fiducials mit auf den Deckgläsern eingebettet, wählen Sie mehrere helle fiducials Abdeckung des zentralen Bild zu liefern (zBAbbildung 1B) den Befehl "Anchor Fiducial - Punkte" im "Bild - Transformation" Menü. Verwenden Sie die dreifache Sätze von Lokalisierung von Kameras # Koordinaten 1 - 3 den hellen fiducials in Schritt 5.1 die Rotations- und Skalierungsmatrix zu berechnen, die Kameras # 1 und # 3 in das Register mit der Kamera # 2 bringen wird. Mit einer ausreichend großen Anzahl von fiducials höherer Ordnung kann Polynom Warping für bessere Anpassungen durchgeführt werden.
  3. Sobald die Transformationsmatrix berechnet wird, transformieren die Rohdaten der Kameras # 1 - 3 zusammen die summierten Rohdaten zu erhalten. Führen Sie eine weitere Runde der Lokalisierung Analyse eine genauere x zu erhalten, Y-Koordinate und den relativen Beitrag der einzelnen Kamerakanäle zu dem summierten Rohdaten zu bestimmen; verwenden Sie den Befehl "Trans Raw, Speichern und Speichern Sum (.dat)" unter "Bild-Transformation" Menü. Das Intensitätsverhältnis enthält die z-Koordinateninformationen.
  4. Wählen Sie eine helle Fiducial und führen z-Kalibrierung Einpassen der Funktion "Test Wind-Punkt-3D" im Pop-up-Dialog von "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü klicken. Dies passt 3-Sinusfunktionen zu den Intensitäten der drei Kamerakanäle der Eichkurve zu bestimmen. Die Kalibrierungsdatei wird dann zur weiteren Verwendung auf den wichtigsten Datensätze gespeichert.
  5. Um die Qualität der Eichkurve zu testen, führen z-Koordinaten Extraktion, wie zuvor beschrieben 23. Für wohlerzogene fiducials in einem gut kalibriertes System, die z-Koordinate sollte linear skalieren, da die Kalibrierungsdatensätzen mit einem linearen Sweep in z-Position genommen werden. Darüber hinaus sollte die z-Positionen aller Justiermarken mit einer ähnlichen Steigung erklimmen.
  6. Sobald eine zufriedenstellende Kalibrierung erhalten wird, führen Sie die Lokalisierung und Transformation-Analyse für die RAW-Bilddatensätzen in Schritt erworben 4 folgende gleiche Verfahren in Schritten beschrieben 5,1-5,3. Wenn Sie fertig sind, laden Sie die Kalibrierungsdatei aus Schritt 5.4 und führen z-Koordinate Extraktion der Funktionen "WND Datei-Pick" und "Extrahieren Z-Koordinate" im Pop-up-Dialog von "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü klicken.
    HINWEIS: Da die Erfassungszeit> 15 min, mechanische Drift ist zu erwarten.
  7. Um Driftkorrektur in x ausführen, y, wählen Sie eine helle Fiducial aus den Lokalisierungskoordinaten. Diese Fiducial sollte in allen Frames vorhanden sein. Verwenden Sie dann die x, y-Koordinaten - Drift des Fiducial alle anderen Koordinaten innerhalb des gleichen Rahmens auszurichten zurück in Registrierung (3A-B) mit der Funktion "Test / Write Guide Star" unter "Bild - Transformation" Menü. durch Zugriff auf den "Test Guide Star" und "Write Guide Star" Funktionen in der Pop-up-Dialog ähnlich ausgeführt werden, indem Sie auf "Z-Koordinate Operationen" unter dem "Sonderfunktionen" Menü Z-Koordinaten-Registrierung kann.
  8. Da die Probe leichte Neigung aufweisen kann, Neigungskorrektur durch die Bereitstellung der x, y, z-Koordinaten von drei Referenzpunkte definieren die Ebene auszuführen, die Ebene mit der Funktion "entfernen XYZ Tilt" im Pop-up-Dialog, indem Sie auf "eingestellt werden sollte Z-Koordinaten-Operationen "unter dem" Sonderfunktionen "Menü.
  9. Im Anschluss an die Drift und Neigungskorrekturen, speichern Sie die Lokalisierungskoordinaten. Rekonstruieren einer Super - Resolution - Bild für die weitere Analyse (4A-D) mit dem Befehl "Render" auf dem Hauptbildschirm. Farbe kann die z-Koordinate, um anzuzeigen, verwendet werden. Alternativ kann auch eine Seitenansicht des ausgewählten Bereichs wiedergegeben werden. Die Lokalisierungskoordinaten können als Textdateien zur weiteren Quantifizierung exportiert werden, oder das rekonstruierte Bild kann als TIF-Datei gespeichert werden.

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Ergebnisse

Kritische Anforderungen für iPalm sind die Ausrichtung, Registrierung und Kalibrierung der optischen Systeme. Diese sind notwendig, geeignete Störungen innerhalb der 3-Wege-Strahlteiler erforderlichen, um sicherzustellen, für die Extraktion z-Koordinate. Damit eine kontinuierliche Überwachung, konstante Punktquellen der Fluoreszenz erforderlich. Dies kann unter Verwendung von fluoreszierenden Au erreicht oder Bi-Metall - Nanopartikel 23 , deren Photolumineszenz entstehen a...

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Diskussion

Das optische System iPalm basiert auf einem 4-π dual-Gegensatz Ziel - Design, wie in 1A gezeigt. Die Einrichtung ist mit konstruiert sowohl individuell bearbeitet und kommerzielle opto-mechanische Teile, wie bereits 23 beschrieben und in Tabelle 1 aufgelistet. Zusätzlich zu unserer Einrichtung beherbergt das Howard Hughes Medical Institute (HHMI) ein System, das für die wissenschaftliche Gemeinschaft an der Advanced Imaging Center an der Janelia Research C...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

YW und PK dankbar finanzielle Unterstützung von der Singapore National Research Foundation, vergeben PK (NRF-NRFF-2011-04 und NRF2012NRF-CRP001-084) bestätigen. Wir danken auch den MBI offenen Labor und Mikroskopie Kerneinrichtungen für Infrastrukturunterstützung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
optical tableNewport, CARS4000iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical tableNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055output power=100 mw
laser-561Newport, CA1168931output power=200 mw
laser-488Newport, CA1137970output power=200 mw
laser-405Newport, CA1142279output power=100 mw
broadband dielectric mirrorsThorlabs, NJBB1-E02laser combiner
dichroic beamsplitterSemrock, NYLM01-427-25
acousto-optic tunable filterAA Opto-Electronic, FranceAOTFnC-VIS-TN
Linear polarizerNewport, CA05LP-VIS-B
baseplatelocal workshopcustomized
turning mirror (22.5°)Reynard Corpporation, CAcustomized22.5° mirror
motorized optic mountsNew Focus, CA8816
motorized XYZ translation stageThorlabs, NJMT3/M-Z6sample holder
T-Cube DC servo motor controllerThorlabs, NJTDC001
Piezo Phase ShifterPhysik Instrumente, GermanyS-303.CD
objective lensNikon, JapanMRD01691objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stageNew Focus, CA9062-COM-M
Pico Motor ActuatorNew Focus, CA8301
rotary Solenoid/ShutterDACO Instruments, CT5423-458
3-way beam splitterRocky Mountain Instruments, COcustomizedbeamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scannerPhysik Instrumente, GermanyS-316.10
motorized five-axis tilt alignerNew Focus, CA8081
Picmotor ethernet controllerNew Focus, CA8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation modulePhysik Instrumente, GermanyE-509/E-503/E-517
band-pass filterSemrock, NYFF01-523/20filters
band-pass filterSemrock, NYFF01-588/21
band-pass filterSemrock, NYFF01-607/30
band-pass filterSemrock, NYFF01-676/37
notch filterSemrock, NYNF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllterThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BV3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronizationDellPrecision T3500PC, 4 sets
coverslips with fiducialHestzig, VA600-100AuFsample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectinMillipore, MTFC010
paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences, PA15710fixation. 16%
glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial FactorsLife Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287staining
sodium borohydride (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101imaging buffer
glucose oxidaseSigma aldrich, MOG2133
catalaseSigma aldrich, MOC9322
cysteamineSigma aldrich, MO30070
EpoxyThorlabs, NJG14250
vaselineSigma aldrich, MO16415sample sealing
lanolinSigma aldrich, MOL7387
parafin waxSigma aldrich, MO327204
Immersion oilElectron Microscopy Sciences, PA16915-04imaging. Cargille Type HF

Referenzen

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

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