Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Resumen

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada convencional.

Resumen

Microscopía de fluorescencia permite la visualización directa de biomoléculas específicas dentro de las células. Sin embargo, para la microscopía de fluorescencia convencional, la resolución espacial está limitada por difracción a ~ 200 nm dentro del plano de la imagen y> 500 nm a lo largo del eje óptico. Como resultado, la microscopía de fluorescencia ha sido durante mucho tiempo muy limitada en la observación de características ultraestructurales de las células. El reciente desarrollo de métodos de microscopía súper resolución ha de superar esta limitación. En particular, el advenimiento de fluoróforos photoswitchable permite súper resolución microscopía basada en la localización, que proporciona el poder de resolución acercarse a la escala de longitud molecular. A continuación, describimos la aplicación de un método de resolución de la microscopía de súper tridimensional basado en una sola molécula de microscopía de localización y la interferometría de fases múltiples, llamado interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm). Este método proporciona una resolución casi isotrópica en elorden de 20 nm en las tres dimensiones. Los protocolos para visualizar el citoesqueleto de actina filamentosa, incluyendo la preparación de muestras y el funcionamiento del instrumento iPalm, se describen aquí. Estos protocolos son también fácilmente adaptable e instructivo para el estudio de otras características ultraestructurales de las células.

Introducción

La visualización de las estructuras celulares complejas ha sido durante mucho tiempo parte integral de conocimientos biológicos y descubrimiento. Aunque la microscopía de fluorescencia puede celdas de imagen con especificidad molecular alto, su poder de resolución está limitada por la difracción a ~ 200 nm en el plano de la imagen (x, y, o dimensión lateral) y> 500 nm a lo largo del eje óptico (z, o dimensión axial) ^1,2. Por lo tanto, la observación de características ultraestructurales históricamente se ha limitado a la microscopía electrónica (EM). Afortunadamente, el reciente desarrollo de la resolución microscopía de súper ha eludido este límite, lo que permite una resolución espacial en el 10 - 100 nm rango de ^1-6. En particular, súper resolución enfoques basados en la localización de una sola molécula, conocida por las siglas como el de palma (photoactivated localización Microscopy) ^4, FPALM (Fluorescencia photoactivated localización Microscopy) ⁵ (d) STORM (directa estocástico óptico Reconstrucción Microscopía) ^6,7, PAINT ( CorreosLa acumulación int for Imaging nanoescala Topografía) ^8, GSDIM (estado fundamental Agotamiento Microscopía seguido por el retorno moleculares individuales) ^9, o SMACM (Single-molécula activa-Control Microscopía) ^10, así como sus implementaciones de 3 dimensiones (3D), como PALM interferométrica (iPalm) ¹¹ o 3D-STORM ^12, han sido valiosa para revelar nuevos conocimientos sobre la organización a nanoescala de numerosas estructuras biológicas, incluyendo los axones neuronales y las sinapsis ^13, adhesiones focales, ^14,15 célula-célula cruces ^{16, 17} poros nucleares centrosomas, y ^18-20, para nombrar unos pocos.

Otra característica ultraestructural en células para las que la resolución microscopía Super es potencialmente útil es el citoesqueleto de actina. La malla complejo de (f) actina filamentosa en la corteza celular juega un papel esencial en el control de la forma celular y las propiedades mecánicas ^21. La organización of f-actina se encuentran activa y dinámicamente regulado, aunque numerosas proteínas reguladoras que influyen fuertemente en la polimerización, reticulación, la facturación, la estabilidad y la topología de la red ^22. Sin embargo, a pesar de la caracterización de la arquitectura de malla de actina F es importante para conocimientos mecánicos en una amplia gama de procesos celulares, el pequeño tamaño (~ 8 nm) de los filamentos de actina F dificulta su observación por microscopía de luz de difracción limitada convencional; Por lo tanto, la visualización de la estructura fina de la actina hasta ahora se ha realizado exclusivamente por EM. A continuación, describimos los protocolos para la visualización del citoesqueleto de actina F en células de mamíferos adherentes, utilizando la técnica de microscopía de súper resolución iPalm para aprovechar su capacidad muy alta precisión en 3D ^11,23. Aunque el instrumento iPalm está altamente especializado, instrucción sobre la creación de un instrumento de este tipo ha sido descrito recientemente ^23, mientras que el acceso al microscopio iPalm organizada por el Howard Hughes Medical Institute también se ha puesto a disposición de la comunidad investigadora con un costo mínimo. Además, los métodos de preparación de muestras descritos en este documento son directamente aplicables a enfoques alternativos 3D Super Resolution, tales como los basados en desenfoque astigmática de la función de dispersión de punto (PSF) ¹² o biplano de detección ^24, que son más ampliamente disponible.

Observamos que un ingrediente necesario para la resolución de la microscopía de súper basada en la localización de una sola molécula, en general, es el fluoróforo photoswitchable ^25, que permite que los tres requisitos críticos para la microscopía de súper resolución basada en la localización de una sola molécula de cumplirse: i) alta sola molécula brillo y el contraste con respecto a las señales de fondo; ii) la distribución dispersa de moléculas individuales en un marco de imagen dada; y iii) la densidad espacial alta de etiquetado suficiente para captar el perfil de la estructura subyacente (también conocido como Nyquist-Shacriterio de muestreo nnon) ^26. Por lo tanto, para obtener resultados satisfactorios, se debe hacer hincapié por igual en ambos la preparación adecuada de las muestras para optimizar photoswitching fluoróforo y para preservar la ultraestructura subyacente, así como en los aspectos de instrumentación y adquisición de los experimentos.

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Protocolo

1. Preparación de las muestras de imagen

1. Dado que las señales de fluorescencia de fondo interfieran con la fluorescencia de las etiquetas de fluoróforos, limpiar los cubres por primera enjuagarlos en agua desionizada _(ddH2O) y luego secarlas con aire usando aire comprimido. Posteriormente, lleve a cabo el grabado por plasma en un limpiador de plasma durante 15 s, o más si es necesario.
2. Para habilitar la corrección de la deriva y calibración iPalm, utilice # 1.5 redonda (de 22 mm de diámetro) cubres pre-limpiado con nanopartículas fluorescentes incrustados como puntos de referencia, que sirven como altamente fotoestables fiduciales para la calibración fiable y corrección de la deriva. Debido al tiempo de adquisición largo requerido para acumular suficiente densidad de fluoróforo (> 15 - 30 min), la deriva de la muestra es inevitable.
3. Coloque cada cubreobjetos fiducialed en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Esterilizarlos por radiación ultravioleta (UV) en una campana de flujo laminar durante 15 min.
4. En una campana de flujo laminar estéril, prepare fibrosolución nectin para el recubrimiento cubreobjetos mediante la dilución de 1 mg solución madre / ml de fibronectina en solución salina tamponada con fosfato estéril de Dulbecco (DPBS) a una concentración final 2 - 10 mg / ml. Enjuague cada cubreobjetos tres veces con DPBS y se incuban con 2 ml de la solución de fibronectina durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, aspirar la solución de fibronectina y se lava una vez con DPBS.
5. Enjuagar las células brevemente con DPBS. Incubar con 1 - 2 ml de tripsina durante unos pocos minutos a 37 ° C hasta que las células se separan y se apaga con 10 ~ ml de medio de cultivo celular que contenía suero fresco. Por ejemplo, para las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), el uso de grandes medio de cultivo suplementado con endoteliales de los vasos grandes factores endoteliales de los vasos y la penicilina o estreptomicina.
   1. Replate las células sobre cubreobjetos recubiertos de fibronectina (por densidad escasa, placa de <50.000 células por cubreobjetos) y mantener el cultivo en una incubadora a 95% de humedad, 5% de CO _2, y 37 & #176; C.
6. Para una buena conservación de las estructuras finas del citoesqueleto de actina F, utilizar soluciones tampón a base de reactivos tampón ²⁷ de Good.
   1. Por ejemplo, preparar tampón PHEM como una solución 2x de la (tubos de 120 mm, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, 4 mM MgCl _2, pH 7,0 con KOH) por disolución de 6,5 g de HEPES, 3,8 g de EGTA y 190 mg de MgCl ₂ en ~ 300 ml de ddH ₂ O, con el pH ajustado a 7,0 mediante la adición gota a gota de una solución de KOH concentrada; a continuación, añadir ddH ₂ O para llevar el volumen a 500 ml. Esterilizar el buffer usando un filtro de 0,22 micras-, almacenarlo a 4ºC, y se diluye 1: 1 con _ddH2O antes de su uso.
7. Para obtener los mejores resultados con el etiquetado de alta densidad de F-actina, el uso faloidina conjugada con fluoróforos orgánicos, tales como Alexa Fluor 647. En el punto de tiempo deseado después de replating celular, fijar las células como sigue:
   1. Aspirar los medios de cada pocillo de cultivo que contienen el ceespécimen ll. Suavemente pero rápidamente dispensar 2 ml de cálidos fijadores de extracción (37 ° C) que contienen 0,25% de glutaraldehído en tampón PHEM con 0,25% de Triton X-100. Incubar a temperatura ambiente durante 1 - 2 min. Para los pasos siguientes, utilizar 2 ml de fijador o tampón de enfriamiento por cubreobjetos, a menos que se indique lo contrario.
   2. Vuelva a colocar el fijador de extracción con un fijador de glutaraldehído al 2,5% en tampón PHEM y dejar que las muestras se incuban durante 10 - 12 min. Esto y siguientes pasos se lleven a cabo a temperatura ambiente.
   3. Aspirar los fijadores y suavemente los reemplazan con tampón PHEM. La inclinación y agitar suavemente y, a continuación, lavar de nuevo con PHEM. Repetir dos veces.
   4. Para saciar la autofluorescencia de glutaraldehído, que puede abrumar a las señales de los fluoróforos deseados, incubar las muestras con un tampón de temple recién preparada que contenía _NaBH4 a una concentración en masa de 0,1% en PHEM. Se observaron burbujas profusas. De vez en cuando toque en el plato de la muestra suavemente para DISLodge las burbujas. Déjelo incubado durante 5 - 10 minutos a.
   5. Aspirar el búfer de enfriamiento rápido y suavemente lo reemplazan con tampón PHEM. Enjuagar varias veces para eliminar las burbujas. Pipeta en 2 ml de tampón PHEM y se deja incubar en la oscuridad durante 5 min. Repetir dos veces y dejar que el resto de muestras en tampón PHEM cuando haya terminado.
   6. Preparar una cámara de humedad para faloidina incubación utilizando un gran placa de Petri de plástico rellena con un trozo de toalla de papel generosamente humedecido con 5 - 10 ml de ddH ₂ O. Coloque una hoja grande de Parafilm limpia en la parte superior de la toalla de papel húmeda.
   7. Debido a la relativamente alto costo de faloidina marcada, utilice un pequeño volumen de cada etiqueta. Para el etiquetado de alta densidad, comenzar con una concentración de 0,3 mM. Preparar ~ 60 l por cubreobjetos usando faloidina-Alexa Fluor 647 en tampón PHEM.
   8. Pipetear 55 - 60 l de la solución faloidina sobre la lámina de Parafilm en la cámara de humedad. Con unas pinzas finas, retire con cuidado la muestra de covergmuchacha. Tenga cuidado de observar la cara que contiene células correcta.
   9. De forma rápida y golpear suavemente el exceso de tampón tocando el borde del cubreobjetos con un trozo de papel doblado absorbente delicada, y luego coloque el lado celular cubre objetos hacia abajo sobre la gota de la solución faloidina en el Parafilm. Asegúrese de que no hay burbujas atrapadas por el cubreobjetos.
   10. Coloque la tapa en la cámara de humedad. Envolver la cámara en papel de aluminio para protegerlo de la luz ambiente, y dejar que la muestra se incuba durante la noche a 4 ° C. La muestra se puede mantener en esta condición durante varios días. Asegúrese de que la cámara de humedad se mantiene húmeda cuando se haya previsto un almacenamiento prolongado.
8. Antes de las imágenes, colocar suavemente el lado celular cubre objetos arriba sobre una nueva placa de 6 pocillos que contiene 2 ml de tampón PHEM por pocillo.
9. Preparar los tampones de imágenes basados ​​en tiol rescatados de oxígeno usando las siguientes soluciones madre: 1 M de glucosa, M cisteamina 1 y mixto de la enzima glucosa oxidasa 100x / catalasaUre (4 mg de catalasa y 10 mg de oxidasa de glucosa en 100 l de tampón de PHEM, mezcladas adecuadamente por agitación) ^28. Justo antes de exponer, mezclar 75 l de solución 1 M de glucosa, 30 l de solución 1 M cisteamina, y 3 l de 100x mezcla de enzima. Ajuste el volumen a 300 l con tampón PHEM y utilizar inmediatamente después de la mezcla para montar la muestra.
10. Para iPalm, preparar la muestra de imágenes usando un pre-limpiado # 1.5 cubreobjetos (22 mm de diámetro).
    1. Alternativamente, utilizar un portaobjetos de vidrio (3 "x 1") con un espaciador adhesivo de doble cara para ayudar en el montaje si a base de astigmatismo 3D-STORM ¹² se va a utilizar en su lugar.
    2. Para el montaje de la muestra de imágenes, utilizar unas pinzas finas para eliminar suavemente el cubreobjetos ejemplar de la memoria intermedia también. Entonces, rápidamente y golpear suavemente el exceso de tampón tocando el borde del cubreobjetos con papel absorbente plegada.
    3. Coloque el lado de células cubreobjetos hacia arriba en un pedazo de papel de la lente limpia. Enjuagar la muestramediante la colocación de 30 - 50 l de tampón de formación de imágenes sobre la muestra, y eliminar el exceso de tampón por la inclinación y tocando con papel absorbente plegada.
    4. Repetir la etapa de aclarado un par de veces, y luego colocar 30 - 50 l de buffer de imágenes sobre la muestra. Secar con el borde del cubreobjetos y colocar varios puntos muy pequeños de epoxi de curado rápido a la zona de secado.
    5. Lentamente baje otro pre-limpiado # 1.5 cubreobjetos (normal, cubreobjetos redondo, diámetro 18 mm) en el centro de la 22-mm cubreobjetos que contiene células. Deje que el tampón de imagen moje las dos cubreobjetos por acción capilar. Los pequeños puntos de epoxi de curado rápido deben adherirse a los dos cubreobjetos.
    6. Presione suavemente sobre la muestra montada con papel absorbente plegada para distribuir la presión uniformemente. Use una presión suficiente para hacer que la célula delgada de la muestra e incluso (<15 micras), pero no tanto como para aplastar las células. Medir el espesor adecuado mediante la observación del patrón de anillos de Newton. Además, asegúrese de llevar a cabo este ptep suavemente para minimizar las burbujas de aire. Si es necesario, practicar con cubres vacíos varias veces de antemano.
11. Sellar la muestra con vaselina fundida de lanolina, parafina (valap, Stock prepara a partir de 100 g cada una de vaselina, lanolina y parafina derretida juntos) ^29, enjuagar la muestra sellada con _ddH2O, y secar con aire comprimido. La muestra está ahora lista para el montaje en el microscopio para obtener imágenes.

2. Colocación de la muestra y alineación iPalm

1. Mover la lente del objetivo superior cargado por resorte hacia arriba para permitir la extracción del soporte de la muestra. Colocar la muestra sellados preparados en la etapa 1.10 en el soporte de la muestra y asegurar con varios pequeños imanes de tierras raras. Aplicar aceite de inmersión en ambos lados de la muestra de imágenes. Colocar el soporte de muestra de nuevo en la trayectoria óptica y baje suavemente la lente objetivo superior.
2. Encienda el láser de excitación. Encienda el dispositivo de carga acoplada multiplicador de electrones (EMCCD) de la cámara en el modo de transferencia de fotogramas.
   1. Girar en los filtros de emisión adecuadas. Activar un obturador mecánico para bloquear la trayectoria del haz superior (Figura 1A) y abrir el camino del haz inferior. Llevar la lente de objetivo inferior en el foco por la traducción en pequeños incrementos utilizando el actuador piezoeléctrico.
   2. Una vez que el fiducial está en foco, abrir la trayectoria del haz superior, mientras que el bloqueo de la trayectoria del haz de fondo y llevar la lente de objetivo superior en el foco de una manera similar. Monitor de la anchura de la fiducial en la pantalla del ordenador para el enfoque óptimo.
3. Para el centrado adecuado, abierto tanto a la parte superior y trayectorias de los rayos de fondo. Para ajustar manualmente la lente del objetivo superior, mientras que el objetivo inferior se mantiene constante utilizando un par de tornillos de ajuste micro-finas, hasta que las imágenes fiduciales se solapan tanto como sea posible, idealmente dentro de un píxel.
   1. Posteriormente, realizar ajustes finos para que las imágenes de referencia en el paso 2.3 se superponen dentro de un décimo de un pixel EMCCD. Ajustar la parte superior2 ejes espejos piezoeléctricos montados a través del software de control mientras mantiene ambas lentes del objetivo y el reflejo inferior espejos constante. Comparación de los centros de las marcas de alineación de la parte superior y las opiniones objetivas de fondo a través de la pantalla del ordenador para guiar el proceso.

3. Calibración de la instalación de iPalm

NOTA: Como la emisión de fluorescencia es incoherente, para la interferencia que se observa en iPalm, la longitudes de trayecto a través de la parte superior y los objetivos de fondo debe estar cerca uno del otro, dentro de unas pocas micras. Esto se puede lograr de la siguiente manera:

1. Con los láseres de, las cámaras de streaming de forma continua, y tanto las trayectorias de los rayos superior e inferior abierta, oscilar el soporte de muestra z-piezo usando una forma de onda de voltaje sinusoidal generada por el software de control para una oscilación del eje z continua sobre una magnitud de 400 nm .
2. Aprovechando el hecho de que, cuando fuera de la alineación óptima, la intensidad fiducial varía poco con tél oscilación, traducir manualmente el conjunto divisor de haz motorizado arriba o hacia abajo hasta que la intensidad de los fiduciales oscila debido al efecto de interferencia de fotón único deseado. Esto significa la estrecha coincidencia de las longitudes de camino óptico. Una proporción de pico a valle de> 10 se puede lograr en los casos óptimos (Figura 1D).
3. Para asegurarse de que tanto la amplitud y la fase en cada superficie son lo más uniforme posible en todo el campo, ajustar el espejo inferior del conjunto divisor de haz en pequeños pasos para poner a punto la brecha y los ángulos de inclinación. Realizar divisor de haz alineación fina mediante la traducción de la muestra en 8 nm z pasos de más de 800 nm.
   1. Seguimiento de la intensidad fiducial entre cámaras # 1 - 3. Ajuste la altura, la posición y la inclinación del espejo inferior dentro del conjunto divisor de haz en pequeños pasos, de manera que la fase de oscilación de la cámara # 1 con respecto a la cámara # 2 se maximiza, lo ideal a 120 ° (Figura 1B-D).
   2. Una vez que el inicialalineación es completa, traducir la muestra para buscar un campo adecuado de vista que contiene tanto células a imagen y múltiples marcas de alineación en las inmediaciones. Colocar un cerramiento alrededor del sistema para bloquear la luz dispersa y perturbaciones ambientales. Una vez que se encuentra la superficie de imágenes, llevar a cabo el procedimiento en el paso 3.4 de nuevo, y registrar la curva de calibración para su uso en posteriores extracciones coordenada z con el comando "Adquirir calibración Scans vs Posición Piezo de ejemplo" en la interfaz principal.

4. Adquisición de Datos

1. Una vez que se encuentra un área deseada y se obtiene la curva de calibración, introduzca los nombres de los archivos correspondientes en el software. Abra la tapa y trayectorias de los rayos de fondo. Aumentar la potencia de excitación del láser de 642 nm en el máximo. Para Alexa Fluor 647, un período inicial de fluoróforo desconexión puede ser necesaria (Figura 2A).
   1. Exponer con una constante de excitación 642 nm durante 5 minutos, o más si es necesario, hasta simolécula ngle parpadear se observa (Figura 2B). El software permite un aumento automático de la activación del foto-405 nm durante el transcurso de la adquisición. Un gran número de marcos de adquisición suelen ser necesarios para las características filamentosa era claramente visible (> 50.000 marcos). Cuando esté listo, comience la adquisición de conjuntos de imágenes en bruto con el comando "Inicio iPalm Adquisición" en la interfaz principal.
2. Durante la adquisición, ajustar el nivel de la fotoactivación mediante el ajuste de la intensidad del láser de 405 nm para mantener la densidad de parpadear adecuado según sea necesario (ver ejemplos en la Figura 2B).
   NOTA: Una vez que se ha completado la adquisición, el software convierte automáticamente los archivos de imagen en el formato binario adecuado. El repositorio de datos en el servidor de cómputo se monta como una unidad de red, lo que permite que los datos se copian directamente allí para su posterior procesamiento.

5. Procesamiento de Datosy análisis

1. Realizar un análisis de la localización utilizando un software desarrollado a medida para extraer los parámetros de ajuste óptimo para todas las moléculas individuales, así como para los fiduciales ^11,15,23. Esto produce no sólo las x, y-coordenadas, sino también la intensidad que se utiliza para análisis de la curva de calibración.
   1. Importar los datos de calibración primas adquiridas en el paso 3.5 utilizando el comando "Extraer valores máximos múltiples etiquetas" en el menú "Archivo" para llevar a cabo la localización de una sola molécula. Tras el análisis inicial de localización, coordenadas obtenidas de las cámaras # 1 - 3 son presente en canales rojo, verde y azul, respectivamente, y se pueden guardar para su posterior análisis mediante el comando "Guardar procesa como IDL (.sav)" en el " "menú archivo.
2. Para llevar los datos de las cámaras # 1 - 3 dentro de registro con las marcas de alineación fluorescentes incrustados en los cubreobjetos, seleccionar varios fiduciales brillantes para dar cobertura a la imagen central (por ejemplo,Figura 1B) con el comando "puntos de anclaje de referencia" en el menú "transformaciones de imagen". Usa los conjuntos triples de coordenadas de localización de las cámaras # 1 - 3 obtenida a partir de los fiduciales brillantes en el paso 5.1 para calcular la rotación y de la matriz de escala que traerá cámaras # 1 y # 3 en el registro con la cámara # 2. Con un número suficientemente grande de fiduciales, de orden superior polinomio de deformación se puede realizar para un mejor ajuste.
3. Una vez que se calcula la matriz de transformación, transformar los datos en bruto de las cámaras # 1 - 3 en conjunto para obtener los datos en bruto se suma. Realice otra ronda de análisis de localización para producir una más precisas x, y de la coordenada y para determinar la contribución relativa de cada canal de la cámara a los datos en bruto resumió; utilice el comando "Transform Raw, Guardar y Guardar Sum (.dat)" en el menú "transformaciones de imagen". Esta relación de intensidad contiene la información de coordenada z.
4. Seleccionar un fiducial brillante y realizar Z-calibración ajustada mediante la función "Prueba de la punta del viento 3D" en el diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales". Esto encajar funciones 3-sinusoidales a las intensidades de los canales de la cámara 3 para determinar la curva de calibración. El archivo de calibración se guarda a continuación, para su posterior utilización en las principales bases de datos.
5. Para probar la calidad de la curva de calibración, realice la extracción de la coordenada z, como se ha descrito previamente ^23. Para fiduciales buen comportamiento en un sistema bien calibrado, la coordenada z se debe ampliar de forma lineal, ya que los conjuntos de datos de calibración se toman con un barrido lineal en la posición z. Además, el Z-posiciones de todos los fiduciales deben escalar con una pendiente similar.
6. Una vez que se obtiene una calibración satisfactoria, lleve a cabo la localización y análisis de transformación de los conjuntos de datos de imágenes en bruto adquiridos en el paso 4 siguiente mismo procedimiento descrito en los pasos 5.1-5.3. Cuando haya terminado, cargue el archivo de calibración desde el paso 5.4 y realizar la extracción de coordenada z utilizando las funciones de "Pick WND Archivo" y "Extraer coordenada Z" en el diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales".
   NOTA: Como el tiempo de adquisición es> 15 min, la deriva mecánica es de esperar.
7. Para realizar la corrección de la deriva de x, y, seleccione un fiducial brillante partir de las coordenadas de localización. Este fiducial debe estar presente en todos los marcos. A continuación, el terminal x, coordenada y la deriva de la fiduciaria para alinear todas las otras coordenadas dentro del mismo marco de nuevo en el registro (Figura 3A-B) usando la función "Prueba / escritura Estrella Guía" en el menú "transformaciones de imagen". el registro de la coordenada Z se puede realizar de manera similar mediante el acceso a la "Prueba de Estrella Guía" y "Escribir Estrella Guía" funciones en el cuadro de diálogo emergente, haga clic en "Z-coordinar las operaciones" en el menú "Funciones especiales".
8. A medida que la muestra puede presentar una ligera inclinación, realizar la corrección de inclinación, proporcionando las x, y, z las coordenadas de 3 puntos de referencia que define el plano que se debe establecer el nivel de uso de la función "Eliminar XYZ inclinación" en el diálogo emergente, haga clic en " Z-coordinar las operaciones "en el menú" Funciones especiales ".
9. Con posterioridad a las correcciones de deriva y de inclinación, guardar las coordenadas de localización. Reconstruir una imagen de súper resolución para su posterior análisis (Figura 4A-D) utilizando el comando "Render" en la interfaz principal. El color puede ser usado para indicar la coordenada z. Alternativamente, una vista lateral de la zona seleccionada también se puede representar. Las coordenadas de localización se pueden exportar como archivos de texto para su posterior cuantificación, o la imagen reconstruida se pueden guardar como un archivo .tif.

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Resultados

requisitos críticos para iPalm son la alineación, registro y calibración de los sistemas ópticos. Estos son necesarios para garantizar la interferencia adecuada dentro del requisito de 3 vías divisor de haz para la coordenada z de extracción. Para habilitar la supervisión continua, fuentes puntuales constantes de fluorescencia son necesarios. Esto se puede lograr usando fluorescente Au o nanopartículas bimetálicas ²³ cuya fotoluminiscencia surgir de resonancia de plas...

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Discusión

El sistema óptico de iPalm se basa en un diseño de doble objetivo opuesto 4-π, como se muestra en la Figura 1A. La configuración se construye con piezas mecanizadas tanto a medida y comerciales opto-mecánico, como se ha descrito anteriormente ²³ y que figuran en la Tabla 1. Además de nuestra configuración, el Instituto Médico Howard Hughes (HHMI) aloja un sistema que es accesible a la comunidad científica en el Centro de Imagen Avanzada en el Campus ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
optical table	Newport, CA	RS4000	iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table	Newport, CA	S-2000
laser-642	Newport, CA	1185055	output power=100 mw
laser-561	Newport, CA	1168931	output power=200 mw
laser-488	Newport, CA	1137970	output power=200 mw
laser-405	Newport, CA	1142279	output power=100 mw
broadband dielectric mirrors	Thorlabs, NJ	BB1-E02	laser combiner
dichroic beamsplitter	Semrock, NY	LM01-427-25
acousto-optic tunable filter	AA Opto-Electronic, France	AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer	Newport, CA	05LP-VIS-B
baseplate	local workshop	customized
turning mirror (22.5°)	Reynard Corpporation, CA	customized	22.5° mirror
motorized optic mounts	New Focus, CA	8816
motorized XYZ translation stage	Thorlabs, NJ	MT3/M-Z6	sample holder
T-Cube DC servo motor controller	Thorlabs, NJ	TDC001
Piezo Phase Shifter	Physik Instrumente, Germany	S-303.CD
objective lens	Nikon, Japan	MRD01691	objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage	New Focus, CA	9062-COM-M
Pico Motor Actuator	New Focus, CA	8301
rotary Solenoid/Shutter	DACO Instruments, CT	5423-458
3-way beam splitter	Rocky Mountain Instruments, CO	customized	beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner	Physik Instrumente, Germany	S-316.10
motorized five-axis tilt aligner	New Focus, CA	8081
Picmotor ethernet controller	New Focus, CA	8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module	Physik Instrumente, Germany	E-509/E-503/E-517
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-523/20	filters
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-588/21
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-607/30
band-pass filter	Semrock, NY	FF01-676/37
notch filter	Semrock, NY	NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter	Thorlabs, NJ	FW103H
EMCCD	Andor, UK	DU-897U-CSO-#BV	3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization	Dell	Precision T3500	PC, 4 sets
coverslips with fiducial	Hestzig, VA	600-100AuF	sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin	Millipore, MT	FC010
paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	15710	fixation. 16%
glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences, PA	16220	25%
triton X-100	Sigma aldrich, MO	T8787
HUVEC cells	Life Technologies, CA	C-015-10C
Medium 200	Life Technologies, CA	M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors	Life Technologies, CA	A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline		14190367
Pennicillin/Streptomycin		15140122
Trypsin/EDTA	Life Technologies, CA	25200056
PIPES	Sigma aldrich, MO	P1851	PHEM
HEPES	1st base, Malaysia	BIO-1825
EGTA	Sigma aldrich, MO	E3889
MgCl2	Millipore, MT	5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen, CA	A22287	staining
sodium borohydride (NaBH4)	Sigma aldrich, MO	480886	quenching
glucose	1st base, Malaysia	BIO-1101	imaging buffer
glucose oxidase	Sigma aldrich, MO	G2133
catalase	Sigma aldrich, MO	C9322
cysteamine	Sigma aldrich, MO	30070
Epoxy	Thorlabs, NJ	G14250
vaseline	Sigma aldrich, MO	16415	sample sealing
lanolin	Sigma aldrich, MO	L7387
parafin wax	Sigma aldrich, MO	327204
Immersion oil	Electron Microscopy Sciences, PA	16915-04	imaging. Cargille Type HF