JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Abstract

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Introduction

النباتات تنتج البذور، والتي تؤدي إلى الجيل التالي. بذور تتراكم كميات كبيرة من احتياطيات تخزين، مثل الزيوت والكربوهيدرات، والبروتينات، للنمو بعد منتش. البشر الاستفادة من احتياطيات تخزين البذور كمصدر للتغذية الأغذية والأعلاف الحيوانية، وبالتالي بذور النباتات هي واحدة من الموردين الرئيسيين للمواد العضوية الصالحة للأكل في جميع أنحاء العالم. زيادة محصول البذور يشكل تحديا هاما في علم النبات.

منذ احتياطيات تخزين البذور هي مصادر ذات قيمة تجارية عالية من المواد الغذائية والمواد الصناعية، الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم عملية الأيض هذه الاحتياطيات تم التحقيق على نطاق واسع 1-6. وعلاوة على ذلك توضيح هذه الآليات يكون مفيدا لزيادة محصول البذور للمحاصيل. بذور تطور في المبايض المصنع بعد الإخصاب، وتنضج من خلال سلسلة من المراحل التنموية 1،6،7. فهم كذلك تطوير الآلية الجزيئية البذور الكامنة يتطلب تفصيلاودقيقة ملامح التعبير الجيني من سلسلة تطوير البذور التي يتم إنتاجها. ومع ذلك، فإن كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات، والكربوهيدرات، ومادة البوليفينول في بذور النباتات تجعل من الصعب عزل الحمض النووي الريبي عالي النقاء، والذي يحول دون التنميط دقيقة في التعبير الجيني.

هنا، ونحن نقدم وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي من البذور الزيتية التي تحتوي على كميات كبيرة من الزيوت والبروتينات ومادة البوليفينول. باستخدام هذه الطريقة، وسوف يقوم الباحثون أن يكون قادرا على إعداد RNA عالي النقاء. وهذا RNA يكون مفيدا لرصد التغيرات النسخي في الجينات الرئيسية السيطرة على تنظيم التمثيل الغذائي للاحتياطيات تخزين البذور في البلدان النامية والبذور الزيتية ناضجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من بذور النباتات

  1. إعداد مجموعات العازلة، أعمدة الدوران، 1.5 و 2.0 أنابيب البولي بروبلين مل، وأنابيب البولي بروبلين 1.5 مل nuclease خالية.
  2. إضافة 1٪ (ث / ت) البيولوجيا الجزيئية الصف بوفيدون (يشار إليها فيما PVP) إلى الخلية تحلل العازلة لاستخراج الحمض النووي الريبي ودوامة بقوة. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية إلى حل تماما. بعد 20 دقيقة الحضانة، مزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب لمنع تشكيل فقاعات. تخزين في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
  3. ثمار الحصاد من النباتات thaliana نبات الأرابيدوبسيس ومكان في 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين على الجليد. أبقى مكان الفواكه على لوحات الألومنيوم في 4 درجات مئوية، وعزل البذور من ثمار تحت المجهر ستيريو.
    1. وضع بذور معزولة (حوالي 200 البذور) إلى 1.5 مل أنابيب البولي بروبلين التي تم تخزينها في حامل الألومنيوم على الجليد وعلى الفور وضع الأنابيب في ن السائلitrogen.
  4. إزالة الأنابيب من النيتروجين السائل وإعادتها إلى الرف الألومنيوم على الجليد. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية.
  5. تجانس العينة مع مدقة الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام طاحونة المحرك لمدة 60 ثانية مع الحفاظ على أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
  6. إضافة 550 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1٪ PVP، ومزيج المخزن المؤقت بلطف من خلال تحويل أنبوب رأسا على عقب، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
  7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 8000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 550 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 x ج عند 25 درجة مئوية، ونقل 450 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 الجديد البولي بروبلين مل.
  9. استخدام طاف مثل المحللة خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي. الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عدة متاحة تجاريا.
  10. أزلRNA باستخدام حجم الحد الأدنى من شطف العازلة لضمان تركيز عال بما فيه الكفاية من الحمض النووي الريبي لرصد أنماط التعبير النصوص مستوى منخفض. تخزين الحمض النووي الريبي في التجميد العميق حتى استخدامها.

2. التأكيد من الحمض النووي الريبي الجودة

  1. ذوبان الجليد في الحمض النووي الريبي مجموع، ومزيج من خلال استغلال طيف، ووضع أنبوب في رف الألومنيوم على الجليد.
  2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي، ونسبة A260 / A280، ونسبة A260 / A230 باستخدام معمل microvolume.
  3. تخفيف الحمض النووي الريبي مجموع في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 70 نانوغرام / ميكرولتر.

3. النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي مجموع من بذور

  1. ذوبان الجليد مجموع RNA وعازلة مجموعات من عدة التجارية. الحفاظ على الانزيمات من هذه المجموعة على الجليد بعد التنصت لطيف. إعداد أنابيب 0.2 مل البولي بروبلين nuclease خالية.
  2. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مجموع، 1 ميكرولتر من جزئية DT التمهيدي (50 ميكرون)، و 1 ميكرومتر من عشوائية 6 مير (50 ميكرومتر) إلى مل polypropy 0.2أنبوب لين على الجليد.
  3. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومكان على الجليد.
  4. الآخرة، اتبع الإجراء هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة في عكس عدة نسخ-PCR.
  5. وضع منتجات النسخ العكسي على الجليد قبل الاستخدام.

4. في الوقت الحقيقي تحليل PCR الكمي

  1. بناء البلازميدات إيواء تسلسل الجين المستهدف باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. ضبط تركيزات إلى 100-500،000 نسخ / ميكرولتر لقوالب الحمض النووي للالمنحنيات القياسية.
  3. تمييع الحلول كدنا] (1: 100) مع الماء المقطر.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من الحلول كدنا] المخففة والبلازميدات لمنحنيات القياسية لمزيج الرئيسي من الوقت الحقيقي عدة PCR الكمي.
  5. إعداد الوقت الحقيقي PCR باستخدام الشروط التالية الدراجات: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ثم 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 35 ثانية.
  6. تحليل الأرقام نسخة وفقا للرجلتعليمات ufacturer لنظام PCR الوقت الحقيقي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

علينا أولا التحقيق في تركيز الأمثل لحماية الأصناف النباتية باستخدام نبات الأرابيدوبسيس البذور الناضجة. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من حوالي 1،000 البذور وفقا لبروتوكول المذكورة أعلاه باستخدام عازلة خلية تحلل تحتوي على 0٪، 0.25٪، 0.5٪، 1.0٪ أو 2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تساهم ملامح التعبير الجيني في فهمنا لفسيولوجيا النبات. لذا، وضعت أساليب عزل الحمض النووي الريبي محددة لكل حالة عينة 9-12. نحن التحقيق في العمليات التي تحول دون خلال عزل الحمض النووي الريبي من البذور وجدت أن الحمض النووي الريبي ملزمة لأغشية السيليكا كانت تحول دون...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر موظفي مرفق الجينوم وظيفية والتصوير الطيفي وBioimaging مرفق، NIBB مرافق البحوث الأساسية، ومرفق نموذج بحوث النباتية، NIBB مركز Bioresource.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
HOMOGENIZER S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)TAKARARR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kitKapa biosystemsKK4601

References

  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119 PCR thaliana napus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved