Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA'nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Özet

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Özet

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Giriş

Bitkiler nesil doğuran tohum üretmek. Tohumlar, post-germinatif büyüme yağlar, karbohidratlar ve proteinler gibi depolama rezervlerinin büyük miktarda birikir. İnsanlar gıda ve hayvan yemi kaynağı olarak tohum depolama rezervleri kullanmak ve böylece bitki tohumları dünya çapında yenilebilir organik maddenin önemli tedarikçilerinden biri vardır. tohum verimi artan bitki biliminde önemli bir sorundur.

Tohum depolama rezervleri gıda ve endüstriyel malzemelerin ticari olarak değerli kaynaklar olduğundan, bu rezervlerin metabolizmasının düzenlenmesine altında yatan moleküler mekanizmalar yaygın ^1-6 incelenmiştir. Bundan başka, bu mekanizmaların tanıtılması bitkileri tohum verimini artırmak için yararlı olacaktır. Tohumlar Döllenmeden sonra bitki yumurtalıklarda gelişir ve bunlar gelişim aşamaları ^1,6,7 bir dizi olgun. Dahası, moleküler mekanizma yatan tohum gelişimini anlamak detaylı gerektirirTohum geliştirme bir dizi hassas gen ekspresyon profillerini üretilecek. Ancak, bitki tohumlarında yağlar, proteinler, karbohidratlar, ve polifenoller yüksek miktarlarda zor sentezlenmesinin hassas profil önleyen yüksek ölçüde saflaştırılmış RNA izole etmek istiyorum.

Burada, sıvı yağlar, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda ihtiva eden yağlı tohumlardan RNA izolasyonu için etkili bir yöntem getirmektedir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar yüksek derecede arıtılmış RNA'nın hazırlanması mümkün olacaktır. RNA geliştirilmesi ve olgun yağlı tohumlar tohum depo edilen metabolik kontrol düzenlenmesi önemli genlerin transkripsiyonel değişikliklerin izlenmesi için yararlı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bitki tohumları toplam RNA'nın 1. Ekstraksiyon

1. tampon setleri, spin sütunları, 1.5 ve 2.0 ml polipropilen tüpler ve nükleaz içermeyen 1.5 mL polipropilen tüpleri hazırlayın.
2. (Ağırlık / hacim) (bundan sonra PVP olarak anılacaktır) moleküler biyoloji sınıf polivinilpirolidon kuvvetli RNA ekstraksiyonu ve vorteks için lizis tamponu hücre% 1 ekleyin. tamamen çözülmesi, 25 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edin. 20 dakika inkübasyondan sonra, kabarcıkların oluşumunu önlemek için ters tüp çevirerek hafifçe tampon karıştırın. Kullanmadan önce oda sıcaklığında (15-25 ° C) muhafaza ediniz.
3. Buz üzerinde 1.5 ml polipropilen tüpleri içinde Arabidopsis thaliana bitkileri ve yerden hasat meyveleri. alüminyum plakalar üzerine yerleştirin meyve 4 ° C'de muhafaza ve stereo mikroskop altında meyve tohumlarını izole.
   1. Sıvı n tüpleri hemen buz üzerine bir alüminyum rafın saklanan 1.5 ml polipropilen tüplere izole tohumları (yaklaşık olarak 200 tohum) yerleştirin veitrogen.
4. sıvı azot tüpleri çıkarın ve buz üzerinde alüminyum raf onları geri. 4 ° C'de 1000 x g'de 1% 1 dakika için PVP ve santrifüj ihtiva eden tampon 100 ul ekle.
5. Buz üzerinde, alüminyum rafın tüp tutulurken 60 saniye için bir motor-öğütücü kullanılarak paslanmaz çelik bir havan tokmağı ile homojenize örnek.
6. % 1 PVP içeren tampon 550 mcL ters tüp çevirerek tampon hafifçe karıştırın ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
7. 5 25 ° C'de 8000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 550 uL santrifüjleyin.
8. 5 25 ° C'de 10,000 x g'de dakika ve yeni bir 1.5 ml polipropilen tüpe Süpernatant 450 uL santrifüjleyin.
9. RNA ekstraksiyonu için hücre lizatı gibi süpernatant kullanın. Bundan sonra, piyasada mevcut olan kit üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
10. ZehirRNA, düşük seviyede transkriptlerinin ekspresyonu kontrolü için RNA yeterince yüksek bir konsantrasyonunu sağlamak için elüsyon tamponunun minimum hacim kullanılarak gerçekleştirilmiştir. kullanılıncaya kadar derin dondurucuda RNA saklayın.

RNA Kalite 2. Doğrulama

1. Toplam RNA çözülme nazik dokunarak karıştırın ve buz üzerinde bir alüminyum rafa tüp yerleştirin.
2. Bir microvolume spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu, A260 / A280 oranı ve A260 / A230 oranı ölçün.
3. 70 ng / ml bir son konsantrasyona kadar, RNaz içermeyen su içinde toplam RNA seyreltilir.

Tohumlar toplam RNA'nın 3. Ters Transkripsiyon

1. ticari kit toplam RNA ve tampon setleri çözülme. nazik dokunarak sonra buz üzerinde kiti enzimleri tutun. nükleaz içermeyen 0.2 ml polipropilen tüpleri hazırlayın.
2. 0.2 mL Polipropilen 5 toplam RNA uL, 1 uL Oligo dT primeri (50 uM) ve 1 Random uM 6-mer (50 uM) ilavebuz üzerinde lene tüp.
3. 37 ° C 'de 15 dakika boyunca inkübe ve buz üzerine yerleştirin.
4. Bundan sonra, ters transkripsiyon-PCR kiti üreticinin talimatlarında açıklanan prosedürü uygulayın.
5. Kullanmadan önce buz üzerinde ters transkripsiyon ürünlerini yerleştirin.

4. Kantitatif Real-time PCR Analizi

1. üreticinin protokolünü kullanarak, hedef gen dizilerini barındıran plasmidleri oluşturun.
2. standart eğrileri için DNA şablonları 100-500,000 kopya / uJ'ye konsantrasyonları ayarlayın.
3. damıtılmış suyla: cDNA çözümleri (100 1) seyreltin.
4. 2 seyreltilmiş cDNA çözümleri uL ve kantitatif real-time PCR kiti master karışımı standart eğriler için plazmidler ekleyin.
5. 30 sn için 95 ° C ve daha sonra 5 saniye boyunca 95 ° C 'de 40 döngü 35 sn için 60 ° C: Aşağıdaki bisiklet koşulları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ayarlayın.
6. adama göre kopya sayısını analizGerçek zamanlı PCR sistemi olarak üreticinin talimatları.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz ilk Arabidopsis olgun tohum kullanılarak PVP optimal konsantrasyonunu araştırdık. Toplam RNA,% 0,% 0.25,% 0.5,% 1.0 veya% 2.0 PVP içeren hücre parçalama tamponu kullanılarak, yukarıda tarif edilen protokole göre yaklaşık 1.000 tohumlardan izole edildi. Yağ tabakası ve tohum artıkları (Şekil 1A) kaçınarak homojenizasyon ve santrifüj sonrasında üst faz toplanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gen ekspresyon profilleri bitki fizyolojisinin anlayışımıza katkıda; Bu nedenle, belirli bir RNA izolasyon yöntemleri her bir örnek durum ^9-12 geliştirilmiştir. Tohumları RNA izolasyonu sırasında inhibe ve RNA silika membranlanna bağlanan ölçüde inhibe olduğu bulundu işlemleri incelenmiştir. Yağ, proteinler ve polifenoller büyük miktarlarda RNA izolasyonu inhibe eder. Biz RNA silika membranların bağlanma işleminden önce bir parçalama solüsyonu ile bu bileşikleri kaldırmak için R...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENIZER S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit	Kapa biosystems	KK4601