Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Zusammenfassung

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Zusammenfassung

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Einleitung

Pflanzen produzieren Samen, die Anlass zu der nächsten Generation geben. Samen akkumulieren große Mengen an Speicherreserven, wie Öle, Kohlenhydrate und Proteine, für die post-germinative Wachstum. Die Menschen nutzen Samenspeicherreserven als Quellen für Lebens- und Futtermittel und damit Pflanzensamen sind eine der wichtigsten Lieferanten von essbaren organischen Stoffen weltweit. Samenerträge zu erhöhen, ist eine wichtige Herausforderung in der Pflanzenwissenschaft.

Da Reserven Samenspeicher kommerziell wertvolle Quellen für Lebensmittel und Industriematerialien sind, wurden ^1-6 umfassend untersucht die molekularen Mechanismen der Regulation des Stoffwechsels dieser Reserven zu Grunde liegen. Ferner werden diese Mechanismen, welche zur Erhöhung der Samenerträge in Kulturen nützlich sein. Samen entwickeln sich in Pflanzen Ovarien nach der Befruchtung, und sie reifen durch eine Reihe von Entwicklungsstufen ^1,6,7. Weiterhin die Entwicklung zugrunde liegenden Samen molekularen Mechanismus zu verstehen, erfordert eine detaillierte, Präzise Genexpressionsprofile von einer Reihe Samen der Entwicklung erzeugt werden. Allerdings sind die hohen Mengen an Ölen, Proteinen, Kohlenhydraten und Polyphenolen in Pflanzensamen machen es schwierig, hochgereinigter RNA zu isolieren, die eine exakte Profilierung der Genexpression verhindert.

Hier stellen wir ein effizientes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Ölsaaten, die große Mengen an Ölen, Proteinen und Polyphenolen. Mit dieser Methode können die Forscher hoch gereinigter RNA herzustellen. Solche RNA wird zur Überwachung von Transkriptions Änderungen in Schlüsselgenen Steuerung der Stoffwechselregulation von Samenspeicherreserven in der Entwicklung und reifen Ölsaaten nützlich sein.

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Protokoll

1. Extraktion von Gesamt-RNA aus Pflanzensamen

1. Bereiten Puffersätze, Spin-Säulen, 1,5 und 2,0 ml-Polypropylenröhrchen und Nuklease-freies 1,5 ml Polypropylenröhrchen.
2. 1% (w / v) für die Molekularbiologie Polyvinylpyrrolidon (nachstehend bezeichnet als PVP) Lysepuffer für RNA-Extraktion und kräftig vortexen zu Zelle. Inkubieren für 20 min bei 25 ° C vollständig gelöst. Nach 20 min Inkubation wird durch Drehen des Rohrs den Kopf zu verhindern, die Bildung von Blasen des Puffers vorsichtig mischen. Lagerung bei Raumtemperatur (15-25 ° C) vor dem Gebrauch.
3. Erntefrüchte aus Arabidopsis thaliana - Pflanzen und in 1,5 ml Polypropylen - Röhrchen auf Eis. Platz Früchte auf Aluminiumplatten gehalten bei 4 ° C und zu isolieren Samen aus den Früchten unter einem Stereomikroskop.
   1. Legen Sie die Samen isoliert (ca. 200 Samen) in 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen, die in einem Aluminiumgestell auf Eis gelagert wurden und sofort legen Sie die Röhrchen in flüssigem nitrogen.
4. Entfernen Sie die Schläuche aus dem flüssigen Stickstoff und bringt sie in die Aluminiumgestell auf dem Eis. Füge 100 & mgr; l des Puffers, enthaltend 1% PVP und zentrifugieren für 1 min bei 1.000 × g bei 4 ° C.
5. Homogenisieren der Probe mit einem Edelstahl-Stößel einen Motor-Mühle für 60 s unter Verwendung während der Schlauch in der Aluminium-Rack auf Eis zu halten.
6. In 550 & mgr; l des Puffers, der 1% PVP, mischen Sie den Puffer sanft durch das Rohr auf den Kopf, und Inkubation bei 25 ° C für 10 min.
7. Zentrifuge für 5 min bei 8000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 550 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen.
8. Zentrifuge für 5 min bei 10.000 × g bei 25 ° C und die Übertragung 450 ul des Überstands in ein neues 1,5 ml-Polypropylenröhrchen.
9. Verwenden Sie den Überstand als Zelllysats zur RNA-Extraktion. Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers im Handel erhältlichen Kits beschrieben.
10. eluierenRNA mit einem Minimalvolumen des Elutionspuffers zur Überwachung der Expressionsmuster von niedrigem Pegel Transkripte eine ausreichend hohe Konzentration an RNA zu gewährleisten. Lagern Sie die RNA in einem Tiefkühlschrank bis zur Verwendung.

2. Überprüfung der RNA-Qualität

1. durch leichtes Klopfen, und legen Sie den Schlauch in einem Aluminiumgestell auf Eis auftauen Gesamt-RNA, mischen.
2. Messen Sie die RNA-Konzentration, A260 / A280-Verhältnis und A260 / A230-Verhältnis ein Mikrovolumen Spektralphotometer.
3. Verdünne die Gesamt-RNA in RNase-freiem Wasser auf eine Endkonzentration von 70 ng / & mgr; l.

3. Reverse Transkription von Gesamt-RNA aus Samen

1. Tauen Sie die Gesamt-RNA und Puffersätze aus dem im Handel erhältlichen Kits. Halten Sie die Enzyme aus dem Kit auf Eis, nachdem leichtes Klopfen. Bereiten Sie Nuklease-freies 0,2 ml Polypropylenröhrchen.
2. Werden 5 & mgr; l Gesamt-RNA, 1 & mgr; l Oligo-dT-Primer (50 uM) und 1 uM Zufalls 6-mer (50 uM) zu dem 0,2 ml Polypropylene Röhrchen auf Eis.
3. Inkubieren für 15 min bei 37 ° C und auf Eis.
4. Hiernach folgen Sie den Anweisungen in den Anweisungen des Herstellers in die Reverse Transkription-PCR-Kit beschrieben.
5. Legen Sie die reverse Transkription Produkte auf Eis vor dem Gebrauch.

4. Quantitative Real-time PCR-Analyse

1. Konstrukt Plasmide, die die Ziel-Gensequenzen unter Verwendung von Protokoll des Herstellers beherbergt.
2. Passen Sie die Konzentrationen an 100-500,000 Kopien / ul für die DNA-Vorlagen für die Standardkurven.
3. Verdünnen der cDNA-Lösungen (1: 100) mit destilliertem Wasser.
4. In 2 ul der verdünnten cDNA-Lösungen und die Plasmide für die Standardkurven an den Master-Mix aus der quantitativen real-time PCR-Kit.
5. Set up PCR in Echtzeit die folgenden Zyklusbedingungen verwendet: 95 ° C für 30 s und dann 40 Zyklen bei 95 ° C für 5 s und 60 ° C für 35 s.
6. Analysieren Sie die Kopienzahlen nach dem Mannsteller Anweisungen für den Echtzeit-PCR-System.

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Ergebnisse

Wir untersuchten zunächst die optimale Konzentration von PVP mit Arabidopsis reifen Samen. Gesamt-RNA wurde aus etwa 1000 Samen isoliert gemäß dem Protokoll oben unter Verwendung Zelllysepuffer beschrieben, die 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% bzw. 2,0% PVP. Nach Homogenisierung und Zentrifugation wurde der Überstand gesammelt , während die Ölschicht und Samen Debris (1A) zu vermeiden.

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Diskussion

Genexpressionsprofile tragen zum Verständnis der Pflanzenphysiologie; Daher wurden spezifische RNA - Isolierungsverfahren wurden für jede Probe Bedingung ^9-12 entwickelt. Wir untersuchten die Prozesse, die während der RNA-Isolierung aus Samen gehemmt wurden und festgestellt, dass RNA zu Silikamembranen Bindung war stark gehemmt. Große Mengen an Öl, Proteine ​​und Polyphenole hemmen RNA-Isolierung. Wir modifiziert, um die RNA-Extraktionsverfahren dieser Verbindungen mit einer Lyse-Lösung vor dem Proz...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENIZER S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit	Kapa biosystems	KK4601