JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Аннотация

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Введение

Растения производят семена, которые дают начало следующему поколению. Семена скапливаются большие объемы запасов хранения, таких как масла, углеводов и белков, для пост-герминативных роста. Люди используют семенные запасы хранения в качестве источника питания и кормов для животных, и, таким образом, семена растений являются одним из основных поставщиков пищевого органического вещества по всему миру. Увеличение урожайности семян является важной задачей в растительном науке.

Поскольку запасы хранения семян являются коммерчески ценным источником пищевых и промышленных материалов, молекулярные механизмы , лежащие в основе регуляции метаболизма этих запасов были широко исследованы 1-6. Далее выяснении эти механизмы будут полезны для повышения урожайности семян сельскохозяйственных культур. Семена развиваются в растительных яичниках после оплодотворения, и они созревают через ряд стадий развития 1,6,7. Дальнейшее развитие понимания молекулярного механизма, лежащего семян требует подробное, Точные профили экспрессии генов из ряда развивающихся семенах будет производиться. Тем не менее, высокие количества масла, белков, углеводов и полифенолов в семенах растений, делают его трудно выделить высокоочищенного РНК, что исключает возможность точного профилирование экспрессии генов.

Здесь мы вводим эффективный метод выделения РНК из семян масличных культур, содержащих большое количество масел, белков и полифенолов. Используя этот метод, исследователи смогут подготовить высокоочищенного РНК. Такая РНК будет полезна для мониторинга изменений в транскрипционные ключевых генов, контролирующих метаболический регулирование запасов хранения семян в развивающихся и зрелых семян масличных культур.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Выделение тотальной РНК из семян растений

  1. Подготовьте наборы буферов, спиновые колонки, 1,5 и 2,0 мл полипропиленовые трубы и нуклеазы 1,5 мл полипропиленовые трубы.
  2. Добавить 1% (вес / об) молекулярной биологии класса поливинилпирролидона (далее именуемые как PVP) в буфере для лизиса клеток для экстракции РНК и вортексе. Инкубировать в течение 20 мин при 25 ° С до полного растворения. После 20-минутной инкубации, смешать буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, чтобы предотвратить образование пузырьков. Хранить при комнатной температуре (15-25 ° C) перед использованием.
  3. Урожай фруктов из Резуховидка Таля растений и место в 1,5 мл полипропиленовые пробирки на льду. Место фрукты на алюминиевые пластины выдерживают при температуре 4 ° С и изолируют семена из плодов с помощью стереомикроскопа.
    1. Поместите выделенные семена (около 200 семян) в 1,5 мл полипропиленовые пробирки, которые были сохранены в алюминиевой стойке на льду и сразу же поместить пробирки в жидком пitrogen.
  4. Удалите трубки из жидкого азота и вернуть их в алюминиевой стойке на льду. Добавьте 100 мкл буфера, содержащего 1% PVP и центрифуги в течение 1 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С.
  5. Однородный образец с пестиком из нержавеющей стали с использованием мотор-шлифовальной машины в течение 60 с, держа трубку в алюминиевой стойке на льду.
  6. Добавить 550 мкл буфера, содержащего 1% PVP, смешайте буфер осторожно поворачивая трубку вверх дном, и инкубируют в течение 10 мин при 25 ° С.
  7. Центрифуга в течение 5 мин при 8000 х г при 25 ° С и передачи 550 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
  8. Центрифуга в течение 5 мин при 10000 х г при 25 ° С и передачи 450 мкл супернатанта к новой 1,5 мл полипропиленовую трубку.
  9. Используйте супернатант в качестве клеточного лизата для экстракции РНК. Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в коммерчески доступного набора.
  10. ЭлюируйтеРНК с использованием минимального объема буфера для элюции, чтобы обеспечить достаточно высокую концентрацию РНК для мониторинга паттерны экспрессии транскриптов низкого уровня. Хранить РНК в глубоком морозильнике до использования.

2. Проверка качества РНК

  1. Разморозить тотальной РНК, перемешать путем осторожного постукивания, и поместите трубку в алюминиевой стойке на льду.
  2. Измерение концентрации РНК, соотношение A260 / A280 и A260 соотношение / A230 с использованием микрообъем спектрофотометра.
  3. Развести тотальную РНК в РНКазу воде до конечной концентрации 70 нг / мкл.

3. обратной транскрипцией тотальной РНК из семян

  1. Оттепель тотальной РНК и буферных наборов из коммерческого набора. Держите ферменты из комплекта на льду после осторожного постукивания. Подготовка нуклеазы 0,2 мл полипропиленовые трубы.
  2. Добавьте 5 мкл тотальной РНК, 1 мкл олиго дТ праймера (50 мкМ) и 1 мкМ случайных 6-меров (50 мкМ) в 0,2 мл полипропиленоваяЛене трубки на льду.
  3. Выдержите в течение 15 мин при 37 ° С и помещают на лед.
  4. Далее следуйте процедуре, описанной в инструкции изготовителя в обратном наборе транскрипции-ПЦР.
  5. Поместите продукты обратной транскрипции на льду перед использованием.

4. Количественный анализ в реальном времени ПЦР

  1. Построить плазмид, несущих последовательности гена-мишени с использованием протокола производителя.
  2. Отрегулируйте концентрации до 100-500,000 копий / мкл для ДНК-матриц для стандартных кривых.
  3. Разбавьте растворы кДНК (1: 100) с дистиллированной водой.
  4. Добавьте 2 мкл разбавленных растворов кДНК и плазмид для стандартных кривых к основной смеси из количественного ПЦР в реальном времени набора.
  5. Установка ПЦР в реальном времени с использованием следующих условий: езда на велосипеде 95 ° C в течение 30 с, а затем 40 циклов при 95 ° С в течение 5 с и 60 ° С в течение 35 сек.
  6. Анализ числа копий в соответствии с мужчинойинструкции ufacturer для реального времени системы ПЦР.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Сначала мы исследовали оптимальную концентрацию PVP с использованием Arabidopsis зрелых семян. Общую РНК выделяли из приблизительно 1000 семян в соответствии с протоколом, описанным выше, с использованием буфера для лизиса клеток, содержащего 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% или 2,0% PVP. После ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

профили экспрессии генов способствуют нашему пониманию физиологии растений; Поэтому, методами выделения специфической РНК, были разработаны для каждого образца состояния 9-12. Мы исследовали процессы, которые были заторможены в процессе выделения РНК из семян и обнаружили, что Р?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников фонда функциональной геномики и спектрографирование и биоимиджинга фонда, NIBB Основные научно-исследовательских учреждений, а также модель исследовательского фонда растений, NIBB центр биоресурсов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RNeasy Plant Mini KitQIAGEN74904
polyvinylpyrrolidoneSigma-AldrichP5288-100G
HOMOGENIZER S-303AS ONE1-1133-02
NanoDrop LiteThermo ScientificND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)TAKARARR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kitKapa biosystemsKK4601

Ссылки

  1. Hills, M. J. Control of storage-product synthesis in seeds. Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).
  2. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  3. Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. Biochemical pathways in seed oil synthesis. Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).
  4. Santos-Mendoza, M., et al. Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis. Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).
  5. Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).
  6. Kanai, M., et al. The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth. Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).
  7. Kanai, M., et al. Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds. Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).
  8. Dekkers, B. J., et al. Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds. Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).
  9. Salzman, R. A., et al. An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).
  10. Vicient, C. M., Delseny, M. Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds. Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).
  11. Wang, G. F., et al. Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch. Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).
  12. Birtic, S., Kranner, I. Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds. Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

119Brassica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены