שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ"א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Summary

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Abstract

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Introduction

צמחים מייצרים זרעים, אשר להצמיח את הדור הבא. זרעים לצבור כמויות גדולות של עתודות אחסון, כגון שמנים, פחמימות וחלבונים, לצמיחה שלאחר נביטה. בני אדם לנצל עתודות אחסון זרע כמקורות להאכיל במזון מן החי, ובכך זרעי צמחים הם אחד הספקים העיקריים של חומר אורגני אכיל ברחבי העולם. הגדלת תשואות זרע היא אתגר חשוב במדע צמח.

מאז עתודות אחסון הזרע הם מקורות בעלי ערך מסחרי של מזון וחומרים תעשייתיים, המנגנונים המולקולריים שבבסיס רגולציה של חילוף החומרים של עתודות אלו נחקרו בהרחבה ^1-6. להאיר עוד מנגנונים אלו יהיו שימושיים להגדלת תשואות זרע בגידולים. זרעים להתפתח השחלות צמח לאחר הפריה, והם בשלים דרך סדרה של שלבי התפתחות ^1,6,7. בהמשך להבנת התפתחות הזרע הבסיסי המולקולרי מנגנון מחייב מפורט, פרופילי ביטוי גנים מדויקים מתוך סדרה של פיתוח זרעים להיות מיוצר. עם זאת, כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, פחמימות, ופוליפנולים זרעי צמחים להקשות לבודד RNA נקיים במיוחד, אשר מונע פרופיל מדויק של ביטוי גנים.

הנה, אנחנו מציגים שיטה יעילה בידוד RNA מן הבוטנים המכילים כמויות גדולות של שמנים, חלבונים, ופוליפנולים. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו להכין RNA הנקי במיוחד. RNA כזה יהיה שימושי עבור ניטור שינויים תעתיק בגנים מפתח שליטה על ויסות חילוף החומרים של עתודות אחסון זרע בפיתוח גרעיני שמן בוגרת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הפקת RNA הכולל זרעי צמחים

1. הכן סטים חיץ, עמודות ספין, 1.5 ו -2.0 צינורות פוליפרופילן מ"ל, ו -1.5 nuclease ללא צינורות פוליפרופילן מ"ל.
2. הוסף 1% (w / v) polyvinylpyrrolidone כיתת ביולוגיה מולקולרית (להלן המכונה PVP) לתא חיץ תמוגה להפקת RNA ו מערבולת במרץ. דגירה במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס כדי להתמוסס לחלוטין. לאחר 20 דקות הדגירה, לערבב בעדינות למאגר על ידי סיבוב הצינור במהופך כדי למנוע היווצרות של בועות. אחסן בטמפרטורת החדר (15-25 מעלות צלזיוס) לפני השימוש.
3. פירות קציר מצמחים ארבידופסיס thaliana ומכניסים 1.5 צינורות פוליפרופילן מ"ל על הקרח. פירות מקום על צלחות אלומיניום שמרו על 4 מעלות צלזיוס ולבודד זרעים מפירות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
   1. מניח את הזרעים המבודדים (כ -200 זרעים) לתוך 1.5 צינורות פוליפרופילן מיליליטר שאוחסנו במעמד אלומיניום על קרח ומייד ומקום צינורות n הנוזלitrogen.
4. הסר את הצינורות מן החנקן הנוזלי ולהחזירם מתלים אלומיניום על קרח. הוספת 100 μL של למאגר המכיל 1% PVP ו צנטריפוגות דקות 1 XG ב 1000 ב 4 ° C..
5. Homogenize מדגם עם עלי נירוסטה באמצעות מטחנת מנוע עבור 60 s, תוך שמירה על הצינור מתל אלומיניום על קרח.
6. להוסיף 550 μL של למאגר המכיל 1% PVP, מערבב את החיץ בעדינות על ידי סיבוב הצינור במהופך, דגירה במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
7. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 8000 XG ב 25 ° C, והעברת 550 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
8. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 XG ב 25 ° C, והעברת 450 μL של supernatant לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל חדש.
9. השתמש supernatant ככל lysate התא להפקת RNA. מכאן והלאה, בצע את ההליך מתואר להוראות היצרן בערכה הזמינה המסחרי.
10. elute אתRNA באמצעות היקף מינימלי של חיץ elution כדי להבטיח ריכוז גבוה מספיק של RNA לניטור דפוסי הביטוי של תמלילי ברמה נמוכה. אחסן את RNA במקפיא עמוק עד בשימוש.

2. אימות של RNA איכות

1. ההפשרה RNA הכולל, ומערבבים על ידי הקשה עדינה, ובמקום הצינור במעמד אלומיניום על הקרח.
2. למדוד את ריכוז RNA, יחס A260 / A280, ויחס A260 / A230 באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume.
3. לדלל את RNA המוחלט במי RNase ללא לריכוז סופי של 70 ng / μL.

3. שעתוק לאחור של RNA סה"כ מזרעים

1. הפשרת סטי רנ"א חיץ המוחלט מן הערכה המסחרית. שמור על אנזימים מתוך הערכה על הקרח לאחר הקשה עדינה. הכן צינורות פוליפרופילן מ"ל 0.2 nuclease חינם.
2. הוסף 5 μL של רנ"א הכל, 1 μL של אוליגו פריימר dT (50 מיקרומטר), ו -1 מיקרומטר של Random 6-mer (50 מיקרומטר) ל -0.2 פוליפרופילן מ"לצינור Lene על הקרח.
3. דגירה במשך 15 דקות ב 37 ºC ומניחים על קרח.
4. מכאן והלאה, בצע את ההליך המתואר להוראות היצרן בערכה שעתוק-PCR הפוך.
5. מניחים את מוצרי שעתוק לאחור על הקרח לפני השימוש.

4. ניתוח PCR כמותי בזמן אמת

1. Construct פלסמידים מחסה רצפי גני היעד באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
2. התאם את ריכוזי 100-500,000 עותקים / μL עבור תבניות DNA עבור עקומות סטנדרטיות.
3. לדלל את פתרונות cDNA (1: 100) עם מים מזוקקים.
4. הוסף 2 μL של פתרונות cDNA מדולל פלסמידים עבור עקומות סטנדרטיות מיקס מאסטר מתוך הערכה PCR כמותי בזמן אמת.
5. הגדרת PCR בזמן אמת באמצעות התנאים אופניים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולאחר מכן 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו 60 מעלות צלזיוס למשך 35 שניות.
6. לנתח את מספרי העותק פי דבריו של האישההוראות של ufacturer עבור מערכת ה- PCR בזמן אמת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנחנו ראשונים חקרנו את הריכוז האופטימלי של PVP באמצעות זרעים ארבידופסיס בוגרים. RNA סה"כ היה מבודד מכ -1,000 זרעים לפי הפרוטוקול שתואר לעיל באמצעות חיץ תא תמוגה המכיל 0%, 0.25%, 0.5%, 1.0% או 2.0% PVP. לאחר המגון צנטריפוגה, supernatant נאסף תוך הימנעות שכבת שמן ופסול...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרופילי ביטוי גנים לתרום להבנתנו פיזיולוגית צמח; ולכן, שיטות בידוד הספציפי RNA פותחו עבור כל דגימת מצב ^9-12. חקרנו את התהליכים עוכבו במהלך בידוד RNA מזרעים ומצא כי RNA מחייב ממברנות סיליקה היה עכבות קשות. כמויות גדולות של שמן, חלבונים, ופוליפנולים לעכב בידוד RNA. שינינו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENIZER S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit	Kapa biosystems	KK4601