Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

Resumen

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Resumen

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

Introducción

Las plantas producen semillas, que dan lugar a la generación siguiente. Las semillas se acumulan grandes cantidades de reservas de almacenamiento, tales como aceites, hidratos de carbono y proteínas, para el crecimiento post-germinativa. Los seres humanos utilizan las reservas de almacenamiento de las semillas como fuentes de alimentación humana y animal, y por lo tanto las semillas de plantas son uno de los principales proveedores de materia orgánica comestible en todo el mundo. El aumento de los rendimientos de semilla es un reto importante en la ciencia de las plantas.

Dado que las reservas de almacenamiento de semillas son fuentes de valor comercial de alimentos y materiales industriales, los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del metabolismo de estas reservas han sido ampliamente investigados ^1-6. al aclarar más estos mecanismos será útil para aumentar el rendimiento de semilla en los cultivos. Las semillas se desarrollan en los ovarios después de la fertilización de las plantas, y que maduran a través de una serie de etapas de desarrollo ^1,6,7. entender aún más el desarrollo de semillas mecanismo molecular subyacente requiere detallada, Perfiles de expresión génica precisas de una serie de semillas en desarrollo a ser producidos. Sin embargo, las altas cantidades de aceites, proteínas, hidratos de carbono, y los polifenoles en semillas de plantas hacen que sea difícil aislar ARN altamente purificada, que se opone a los perfiles precisa de la expresión génica.

Aquí, se introduce un método eficiente para el aislamiento de ARN a partir de las semillas oleaginosas que contienen grandes cantidades de aceites, proteínas y polifenoles. Usando este método, los investigadores podrán preparar ARN altamente purificada. Dicho ARN será útil para el seguimiento de los cambios en la transcripción de genes clave que controlan la regulación del metabolismo de las reservas de almacenamiento de semillas oleaginosas en el desarrollo y maduros.

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Protocolo

1. Extracción de ARN total de semillas de la planta

1. Preparar conjuntos de tampones, columnas giratorias, 1.5 y 2.0 mL tubos de polipropileno, y tubos de polipropileno de 1,5 ml sin nucleasa.
2. Añadir 1% (w / v) de polivinilpirrolidona de calidad para biología molecular (en lo sucesivo denominado PVP) a la celda tampón de lisis para la extracción de RNA y agitar vigorosamente. Incubar durante 20 min a 25 ° C para disolver completamente. Después de 20 min de incubación, mezclar el tampón suavemente girando el tubo boca abajo para evitar la formación de burbujas. Almacenar a temperatura ambiente (15-25 ° C) antes de su uso.
3. La cosecha de frutas de las plantas de Arabidopsis thaliana y colocar en tubos de polipropileno de 1,5 ml en hielo. Coloque las frutas en placas de aluminio mantuvieron a 4 ° C y aíslan las semillas de los frutos bajo un microscopio estereoscópico.
   1. Coloque las semillas aisladas (aproximadamente 200 semillas) en 1,5 ml tubos de polipropileno que han sido almacenados en un bastidor de aluminio en hielo e inmediatamente colocar los tubos de líquido nitrogen.
4. Retire los tubos del nitrógeno líquido y devolverlos a la rejilla de aluminio en el hielo. Añadir 100 ml de la solución tampón que contiene 1% de PVP y centrifugar durante 1 min a 1000 xg a 4 ° C.
5. Homogeneizar la muestra con una mano de mortero de acero inoxidable usando un motor-amoladora durante 60 s mientras se mantiene el tubo en el bastidor de aluminio en hielo.
6. Añadir 550 l de la solución tampón que contiene 1% de PVP, mezclar el tampón suavemente girando el tubo boca abajo, y se incuba durante 10 min a 25 ° C.
7. Centrifugar durante 5 min a 8.000 xg, a 25 ° C y la transferencia de 550 l del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
8. Centrifugar durante 5 min a 10.000 xg, a 25 ° C y la transferencia de 450 l del sobrenadante a un nuevo tubo de polipropileno de 1,5 mL.
9. Usar el sobrenadante como el lisado de células para la extracción de RNA. De aquí en adelante, siga el procedimiento descrito en las instrucciones del fabricante en el kit disponible en el mercado.
10. eluir elARN usando un volumen mínimo de tampón de elución para garantizar una concentración suficientemente alta de ARN para el seguimiento de los patrones de expresión de las transcripciones de bajo nivel. Almacenar el ARN en un congelador hasta su uso.

2. Verificación de RNA de calidad

1. Descongelar el ARN total, se mezcla con unos golpecitos suaves, y colocar el tubo en un bastidor de aluminio en el hielo.
2. Medir la concentración de ARN, la relación A260 / A280, y la relación A260 / A230 usando un espectrofotómetro microvolumen.
3. Diluir el ARN total en agua libre de RNasa hasta una concentración final de 70 ng / mL.

3. transcripción inversa del ARN total a partir de semillas

1. Descongelar los conjuntos totales de ARN y de amortiguamiento de referencia del fabricante. Mantenga las enzimas del kit en hielo después de golpecitos suaves. Preparar tubos de 0,2 ml de polipropileno libre de nucleasa.
2. Añadir 5 l de ARN total, 1 l de cebador oligo dT (50 mM), y 1 mM de Random 6-mer (50 M) al 0,2 mL proliprolenolene tubo en hielo.
3. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C y colocar en hielo.
4. De aquí en adelante, siga el procedimiento descrito en las instrucciones del fabricante en el kit de PCR con transcripción inversa.
5. Coloque los productos de transcripción inversa en el hielo antes de su uso.

4. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

1. La construcción de plásmidos que albergan las secuencias de genes diana utilizando el protocolo del fabricante.
2. Ajustar las concentraciones de 100-500,000 copias / l para las plantillas de ADN para las curvas de calibración.
3. Diluir las soluciones de ADNc (1: 100) con agua destilada.
4. Añadir 2 l de las soluciones diluidas de ADNc y los plásmidos para las curvas estándar a la mezcla maestra en el kit de PCR cuantitativa en tiempo real.
5. Configurar-PCR en tiempo real utilizando las siguientes condiciones de ciclos: 95ºC durante 30 s y luego 40 ciclos a 95 ° C durante 5 s y 60ºC durante 35 s.
6. Analizar el número de copias de acuerdo con el hombreinstrucciones del ufacturer para el sistema de PCR en tiempo real.

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Resultados

En primer lugar, se investigó la concentración óptima de PVP usando Arabidopsis semillas maduras. ARN total fue aislado de aproximadamente 1000 semillas de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, utilizando tampón de lisis celular que contiene 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% o 2,0% de PVP. Después de la homogeneización y centrifugación, se recogió el sobrenadante evitando al mismo tiempo la capa de aceite y los residuos de la semilla (Figura 1A).

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Discusión

los perfiles de expresión de genes contribuyen a nuestra comprensión de la fisiología de las plantas; Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN específico se han desarrollado para cada condición de muestra ^9-12. Se investigaron los procesos que se inhibe durante el aislamiento de ARN a partir de semillas y se ha encontrado que el ARN a membranas de sílice fue gravemente inhibida. Grandes cantidades de petróleo, proteínas y polifenoles inhiben el aislamiento de ARN. Hemos modificado el proceso d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGENIZER S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Fast qPCR kit	Kapa biosystems	KK4601