الاشتقاق الثقافات السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الجهات المانحة الدماغ البشري

Summary

بروتوكول ثقافة السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الإنسان الدماغ هو وسيلة قوية من الناحية الفنية وبسيطة لاستخلاص الخلايا الليفية السحائية-الفيبرونكتين إيجابية في غضون 6-8 أسابيع وcryopreserve ما يقرب من 20 حتي 30000000 الخلايا.

Abstract

على الرغم من إحراز تقدم كبير في توصيف السريري لمرض الشلل الرعاش، وتفيد العديد من الدراسات أن تشخيص مرض باركنسون لم يتأكد بشكل مرضي في ما يصل إلى 25٪ من تشخيص المرض سريريا باركنسون. لذلك، الأنسجة التي تم جمعها من المرضى الذين شخصت سريريا مع مرض مجهول السبب باركنسون يمكن أن يكون ارتفاع معدل خطأ في التشخيص. وبالتالي في الدراسات المختبرية من هذه الأنسجة لدراسة مرض باركنسون كنموذج قبل السريرية يمكن أن تصبح غير مجدية.

من خلال جمع السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة مع تشخيص عصبية مرضية مؤكدة بمرض باركنسون وتميزت فقدان الخلية السوداوي المخططي والادراج البروتين داخل الخلايا تسمى الهيئات ليوي، يمكن للمرء أن يكون على يقين من أن الرعاش وحظ سريريا لا ينتج عن عملية المرض الكامنة أخرى (مثل الورم، وتصلب الشرايين).

هذا presen بروتوكولنهاية الخبر تشريح وإعداد السحايا الرقيقة الإنسان بعد الوفاة لاشتقاق ثقافة الخلايا الليفية السحائية. هذا الإجراء هو قوي ولديه نسبة نجاح عالية. التحدي المتمثل في الثقافة هو العقم كما هو عادة يتم تنفيذ شراء الدماغ تحت ظروف معقمة. وبالتالي، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، وأمفوتيريسين B.

اشتقاق الخلايا الليفية السحائية من حالات التشريح المؤكدة بمرض باركنسون يوفر الأساس لفي المختبر نماذج من مرض الشلل الرعاش. تظهر الخلايا الليفية سحائي بعد 3-9 أيام إعداد العينات وحوالي 20-30 مليون خلية يمكن cryopreserved في 6-8 أسابيع. ثقافة الخلايا الليفية السحائية هي متجانسة والخلايا تعبر عن فبرونيكتين، علامة تستخدم عادة لتحديد السحايا.

Introduction

تتكون السحايا من ثلاثة أغشية التي تحمي الدماغ: الأم الجافية، العنكبوتية والأم الحنون. وفي الآونة الأخيرة، تم الاعتراف بأن السحايا أيضا أن تلعب دورا هاما في نمو الدماغ والمخ التوازن ^1. وتستمد السحايا من الوسيطة والخلايا المشتقة من قمة العصبية والمثير للاهتمام، فقد تبين أن الخلايا السلف المقيمين في السحايا يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية في المختبر، وبعد زرع في الجسم الحي ^{2، 3، 4.} كما استخدمت الثقافات السحايا بنجاح كما طبقات المغذية، كما أنها تمتلك انسجة المشتقة من خلية النشاط على حث لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الدوبامين ^5. وعلاوة على ذلك، السحايا الرقيقة لديها القدرة على التفريق مباشرة إلى الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في ظل ظروف الدماغية ^6.

لهذا البروتوكول، يتم جمع عينات السحايا بعد الوفاة البشرية من أم عنكبوتية والحنون، مجتمعة تسمى السحايا الرقيقة، ويتم شراؤها كجزء من التبرع الدماغ البشري لأغراض البحث. يتم إجراء تشريح الدماغ خلال 24 ساعة من وفاة ويتم وضع عينة السحايا الرقيقة في وسائل الإعلام نمو البارد لمزيد من المعالجة ضمن ح 6-8 القادمة كما هو موضح هنا في هذا البروتوكول.

يصف هذا البروتوكول تشريح وإعداد العينات السحايا الإنسان لتطوير زراعة الخلايا السحايا الرقيقة الأولية للمرضى. يتم قطع الأنسجة إلى 25-30 قطعة من حوالي 3 ملم × 3 مربعات ملم. وضعت ثلاث قطع في كل جيدا 6 جيدا والاحتفاظ باستمرار مع coverslips الزجاج ذهابا والجيلاتين المغلفة. تشريح السحايا يستغرق حوالي 25-35 دقيقة. ويتمثل التحدي الرئيسي مع هذه الثقافة بشكل عام يتم تنفيذ معقمة وشراء الدماغ، والنقل، وتشريح تحت ظروف معقمة. تherefore، فمن المهم لاستكمال سائل الإعلام والثقافة مع كوكتيل من البنسلين، الستربتومايسين، والأمفوتريسين B واستخدام أطباق متعددة جيدا لحدة قطعة نسيج الثقافة.

ثمرة من الخلايا الليفية السحائية يحدث عادة في غضون الأسبوع الأول. يتم تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام حتى الخلايا هي متكدسة وو passaged الخلايا إنزيمي. والخلايا الليفية السحائية هي cryopreserved من 1 مليون خلية لكل مليلتر / قارورة في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. مع هذا البروتوكول، 20-30000000 الليفية سحائي يمكن أن تستمد في 6-8 أسابيع لحفظ البرودة. تطبيقات المصب من هذه الخلايا الليفية السحائية هي الثقافات الأولية للبحوث الأمراض، تمايز الخلايا العصبية المباشر أو اشتقاق الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها من السحايا الرقيقة لفهم آليات المرض وتطوير الأدوية.

Protocol

يتضمن تسجيل التبرع الدماغ وثائق من قبل المسجل من عزمهم على التبرع. يتم توفير إذن التشريح لاسترجاع الأنسجة من قبل الأقرباء ما يسمح به القانون. يتم مراجعة الدراسات البحثية باستخدام عينات التشريح التي تم جمعها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) لضمان الامتثال لنقل التأمين الصحي والأنظمة (HIPAA) قانون محاسبة.

يتم جمع عينات السحايا الرقيقة التي مشرح الدماغ أو أمراض الأعصاب خلال تشريح الدماغ ويتم تخزينها في أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 25-30 مل السحايا وسائط النمو: ملاحظة. يتم تخزين العينة عند 4 درجات مئوية حتى إعداد العينات. يجب أن يتم تنفيذ معالجة في أقرب وقت ممكن لبقاء الخلايا تتناقص مع مرور الزمن بعد الوفاة.

1. مجموعة المتابعة قبل بدء السحايا الرقيقة تشريح

ملاحظة: خطوات 1،1-1،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

1. إعداد وسائط النمو السحايا من خلال الجمع بين 375 مل من النسر وسائل الإعلام Dulbecco والتعديل، 100 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل 10 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل 200 ملي L-ألانيل-L-الجلوتامين، 5 مل 100 ملي الصوديوم البيروفات، 5 مل 10،000 U / مل البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل 250 ميكروغرام / مل الامفوتريسين في 500 وحدة تصفية مل. تصفية ومزج. استخدام وسائل الإعلام لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
2. وضع جميع المواد في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية قبل البدء في تشريح: أطباق بتري 4X، 2X 6 لوحات جيدا، 2X المشارط، 15-20 تعقيم 15 ملم تغطية زلات، الفوسفات عازلة المالحة (PBS)، الماصات المصلية، الشفط الماصات.
3. إضافة 1 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين معقمة تعقيمها إلى كل بئر من لوحة 6 جيدا. تعيين لوحة جانبا لمدة 30-60 دقيقة. إعداد 2X 6 لوحات جيدا.

2. إعداد السحايا الرقيقة عينة

ملاحظة: خطوات 2،1-2،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

1. إضافة حوالي 10 مل من برنامج تلفزيوني لالعقيمة 10 سم صحن زراعة الأنسجة ووضع العينة السحايا في الطبق. باستخدام ملقط، ويغسل بلطف السحايا الرقيقة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الدم.
2. نقل السحايا إلى 10 سم، وطبق زراعة الأنسجة الجديدة التي تحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني جديد ومواصلة الغسيل. كرر حسب الضرورة لإزالة الكثير من الدم ممكن.
3. باستخدام اثنين من المشارط، وقطع السحايا الرقيقة الأنسجة إلى حوالي 6 سم × 6 سم قطعة كبيرة.
4. مكان غطاء على طبق ثقافة ونقل إلى مجهر تشريح في غطاء تدفق الصفحي أفقي.

3. تشريح الأنسجة السحايا الرقيقة

ملاحظة: خطوات 3،1-3،3 هي التي يتعين القيام بها داخل غطاء تدفق الصفحي أفقي باستخدام مجهر تشريح.

1. إزالة الأوعية الدموية من منطقة على قطعة السحايا الرقيقة (الخطوة 2.3) كبيرة بما يكفي لخلق 20-25 مارس على الأقل قطع ملم × 3 مم. عقد السحايا الرقيقة في مكان مع مشرط واحد ومع الآخر، استخدم مو كشط لطيف والضحلةنشوئها لفصل السفن.
2. قطع مربعات صغيرة من نسيج المنطقة المعدة. قطع في عملية متدرجة بجعل أول أكبر قطعة ثم تشريح تلك إلى أقسام أصغر.
3. استخدام مشرط واحد لعقد الأنسجة في مكان ومشرط آخر لقطع الأنسجة مع حركة التأرجح. ويرجع ذلك إلى اتساق الأنسجة، فمن الصعب أن الشريحة المشارط ضد بعضها البعض. هذا وسوف المسيل للدموع فقط الأنسجة، وبصرف النظر يؤدي إلى حواف خشنة.
4. مواصلة قطع القطع في نصف حتى هناك حوالي 20-25 قطع 3 مم × 3 مم.

4. نقل تشريح السحايا قطع على لوحات زراعة الأنسجة

ملاحظة: الخطوة 4 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

1. الجيلاتين نضح من لوحة 6 جيدا (من الخطوة 1.3). إضافة 1 مل من وسائط النمو السحايا إلى كل بئر. باستخدام ملقط معقم، ضع قطعة 3-4 الخزعة في كل بئر.

5. التنسيب من زلات تغطية على Meninges قطع

ملاحظة: خطوات 5،1-5،2 هي التي يتعين القيام بها داخل غطاء تدفق الصفحي أفقي باستخدام مجهر تشريح.

1. تغطية القطع مع 1-2 العقيمة 15 ملم coverslips دائرية لكل بئر.
2. اضغط لأسفل بحزم مع ملقط لضمان القطع ولمس الجزء السفلي من لوحة. وهذا يسمح الحجز على قطع الأنسجة إلى قاع البئر.
3. وضع لوحة 6 جيدا إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ الحاضنة.

صيانة الثقافة 6. خلية

ملاحظة: خطوات 6،1-6،3 هي التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. التعامل مع أطباق الثقافة مع الرعاية كما يجب coverslips لا تحرك وطرد السحايا قطعة.

1. بعد 2 أيام في الثقافة، إضافة 1 مل إضافية من وسائط النمو السحايا جديدة إلى كل بئر.
2. في يوم 7، ونضح بعناية وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من وسائط جديدة إلى كل بئر.
3. بعد يوم 9، ومواصلة تغيير وسائط النمو كلاليوم الآخر حتى يصبح ثقافة متموجة.

7. الركض

ملاحظة: جميع الخطوات التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. مرة واحدة وقد هاجر الليفية السحائية من قطعة نسيج السحائي وتبدأ في النمو نحو حواف سفينة الثقافة، وتوسيع الخلايا الليفية سحائي في صحن الثقافة أكبر.

1. قبل البدء في الركض، ومعطف الطبق الثقافة مع 1٪ الجيلاتين مدة 15-30 دقيقة.
2. وسائل الإعلام نضح من صحن 6 جيدا وغسل الخلايا مع 2 مل برنامج تلفزيوني.
3. إضافة 1 مل من التربسين / EDTA إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة. وليس من الضروري لإزالة زلات غطاء أو الأنسجة السحائية لهذه الخطوة.
4. عندما الخلايا تقريب وتبدأ في فصل، إضافة 2 مل من وسائط الثقافة.
5. خلايا ماصة صعودا وهبوطا لتعطيل تماما عن كتل ونقل حل الخلية إلى صحن الثقافة أكبر.
6. استخدام نسبة 1: 3-1: 4 الجمع بين الخلايا من ثلاثة أطباق 6 جيدا فيإلى صحن ثقافة T75 واحد.
7. بمجرد متموجة الخلايا الليفية السحائي في قوارير ثقافة T75، ويعرض للتريبسين الخلايا، وcryopreserve في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد في الخلايا 1x10 ⁶ / مل في القارورة. واحد T75 الثقافة قارورة مع الخلايا الليفية السحائية متكدسة يحتوي على حوالي 5-7 مليون خلية.

8. توصيف الخلايا الليفية السحائية التي كتبها المناعية

ملاحظة: قبل البدء في إجراء وإعداد حل لامتصاص العرق 4٪ و 5٪ طبيعي مصل الماعز في برنامج تلفزيوني (عازلة تمنع)، 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (العازلة permeabilization)، حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية، و1 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 المخفف في برنامج تلفزيوني من 10 ملغ الأسهم / مل.

1. البذور 15،000 إلى 30،000 الخلايا الليفية السحائية في 8 جيدا الشرائح الغرفة المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪.
2. بعد 24 ساعة عندما يتم إرفاق الخلايا، إصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ لكل بئر لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
3. Permeabilize الخلايا مع 150 ميكرولتر من 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
4. إضافة 200 ميكرولتر عرقلة الحل (PBS + 5٪ مصل الماعز العادي) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. نضح عرقلة الحل، وإضافة 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة مخففة في عرقلة الحل. لالمزدوج تلطيخ، وإعداد التخفيفات عمل الأجسام المضادة الأولية في أنابيب الطرد المركزي منفصلة على الجليد على النحو التالي:
   1. إعداد 1: 300 التخفيف من معاداة فيبرونكتين] + 1: 200 التخفيف من مكافحة nestin في عرقلة الحل. إعداد 1: 250 التخفيف من مكافحة SERPINH1 + 1: 1000 تخفيف من مكافحة TUJ1 في عرقلة الحل. إعداد 1: 250 التخفيف من مكافحة SERPINH1 + 1: 100 التخفيف من مكافحة SOX2 في عرقلة الحل
6. احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
7. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
8. إعداد العمل 1: 400 التخفيف من fluorescently المسمى الأجسام المضادة الثانوية الماعز المضادة للأرنب (الأخضر؛ م ت / م ² 495/519 نانومتر) والماعز المضادة للماوس (أحمر، تحويلة / م ² 590/617 نانومتر) في حل الحجب وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان لمدة 1 ساعة، في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الآبار مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
9. إضافة 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل هويشت 33342 (الأزرق؛ م ت / م ² 358/461 نانومتر) حل كل بئر واحتضان في الظلام لمدة 3 دقائق. غسل الآبار 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X، وترك في برنامج تلفزيوني 1X غسل النهائي في البئر، وتغطية الشريحة مع رقائق الألومنيوم.
10. تحليل الخلايا تحت المجهر الفلورسنت.

النتائج

عندما كان بروتوكول السحايا الرقيقة المعالجة ناجحة، ويلاحظ نمو الخلايا الليفية السحائية لأول مرة بعد 3-9 أيام تشريح، على الرغم من أن هذا يمكن أن تعتمد على طول فترة ما بعد الوفاة للدماغ. يوضح الشكل 1 الثقافات الليفية السحائية من أربع جهات مانح...

Discussion

يصف هذا البروتوكول بروتوكول بسيط وقوي لاستخلاص الثقافة الليفية السحائية من السحايا الرقيقة تشريح الإنسان جمعها بالتزامن مع هبة الدماغ. هناك عدد قليل جدا من أوصاف بروتوكولات لاستخلاص مزارع الخلايا من المواد البشرية بعد الوفاة. تصف دراستين الجلد المستمدة الثقافات ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Petri dishes	Fisher Scientific	351029
Nunc 6-well plate	Fisher Scientific	14-832-11
15-mm cover slips	Fisher Scientific	12-545-83 15CIR-1D
Scalpels, sterile blade, No. 15	Miltex	4-415
Curved precision tip forceps	Fisher Scientific	16-100-122
Serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-11E
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	22-230490
Gelatin	Sigma	G1890-100G
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific	SH30264.02
Corning 500 mL filter unit	Fisher Scientific	430770	Combine media components and filter.
Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2	Thermo Scientific	178883
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Media
Hyclone DMEM	Fisher Scientific	SH30081.02
Hyclone FBS	Fisher Scientific	SH30910.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140-050
GlutaMAX Supplement (100x)	Thermo Fisher	35050-061
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher	11360-070
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122
Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL)	Fisher Scientific	BP264520
Bambanker Freeze 120 mL	Fisher Scientific	NC9582225
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronectin Staining
8 well chamber slides	Fisher Scientific	1256518
20% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Sigma	T8787
100% Glycerol	BioRad	9455
100% normal goat serum	Fisher Scientific	101098-382
Anti-Fibronectin antibody [F1]	Abcam	ab32419	1:300 dilution in blocking solution
Anti-SERPINH1	Sigma	S5950-200ul	1:250 dilution in blocking solution
Anti-SOX2	Millipore	MAB4343	1:100 dilution in blocking solution
Anti-Nestin	Millipore	MAB5326	1:200 dilution in blocking solution
Anti-TUJ1	Covance	MMS-435P	1:1,000 dilution in blocking solution
Alexa Fluor 488 anti-rabbit	Thermo Fisher	A11029	1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm)
Alexa Fluor 555 anti-mouse	Thermo Fisher	A21424	1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm)
Hoechst 33342 stain	Thermo Fisher	H3570	dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm)
Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well.